余 晴, 方寶枝, 呂明恩

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院/蘇州市立醫(yī)院 血液科, 江蘇 蘇州, 215002)

遺傳性易栓癥是指機(jī)體內(nèi)存在某種基因缺陷而導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白含量減少或者功能異常，以及凝血因子的濃度升高，造成血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加?；蛉毕莳?dú)立存在時(shí)可無臨床表現(xiàn)，但合并獲得性復(fù)雜高危因素時(shí)，可使血栓嚴(yán)重程度與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果不匹配。中國人群易栓癥檢測(cè)主要有表型檢測(cè)和基因檢測(cè)2種方式，但表型檢測(cè)易受外在因素(急性血栓形成期、抗凝藥物、感染、妊娠、激素等)的干擾，經(jīng)多次復(fù)測(cè)才可能明確診斷，而基因檢測(cè)便捷、準(zhǔn)確，在任意時(shí)間進(jìn)行2次測(cè)序即可[1]。2018年，瑞金醫(yī)院對(duì)292例靜脈血栓形成患者及其近700名家系成員進(jìn)行基因檢測(cè)，突變檢出率達(dá)到60.6%, 在指導(dǎo)制訂個(gè)性化診療方案中具有很好的臨床應(yīng)用效果[2]。因此，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)篩查也不能完全明確異常部位血栓病因且有家族史的年輕患者，早期進(jìn)行基因檢測(cè)有益于有效診療。

1 主要基因檢測(cè)技術(shù)及特點(diǎn)

在美國國立衛(wèi)生院2015年發(fā)布的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃中，將基因組技術(shù)推向了醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究的前沿[3]，推進(jìn)了基因檢測(cè)技術(shù)的多樣性發(fā)展。對(duì)于未知致病基因的突變檢測(cè)，通常會(huì)選擇先用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、單鏈構(gòu)象多態(tài)分析技術(shù)、變性梯度凝膠電泳分析等篩選出突變基因，再采用基因測(cè)序?qū)ν蛔兓蜻M(jìn)行檢測(cè)，找出突變位點(diǎn)[4]。隨著快速平行測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因測(cè)序具有速度快、成本低、通量高、自動(dòng)化操作的特點(diǎn)[5], 一定程度上縮短了檢測(cè)時(shí)限，因此在臨床上廣泛應(yīng)用?；驕y(cè)序包括第一代測(cè)序、下一代測(cè)序(NGS)。第一代測(cè)序中，Sanger測(cè)序可對(duì)基因組的已知區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，并在2～3 d內(nèi)讀取超過1 000個(gè)堿基對(duì)的序列，并檢測(cè)所有的突變、插入和缺失，已成為臨床和實(shí)驗(yàn)室研究的核心力量; 焦磷酸測(cè)序需要特殊的測(cè)光強(qiáng)度儀器，一次運(yùn)行也僅能識(shí)別15～95個(gè)堿基，與Sanger相比較并無優(yōu)勢(shì)[6]。NGS分為第二代測(cè)序和第三代測(cè)序。第二代測(cè)序技術(shù)也被稱作高通量測(cè)序技術(shù)，包括可逆鏈終止測(cè)序、離子激流半導(dǎo)體測(cè)序等[7-8], 該技術(shù)具有高通量、高準(zhǔn)確性、高靈敏度等突出優(yōu)勢(shì)，但是也存在工作量大、費(fèi)用高、讀長(zhǎng)較短等缺點(diǎn)，對(duì)一些大的結(jié)構(gòu)變異無法識(shí)別，而且測(cè)序前的克隆擴(kuò)增步驟還可能造成錯(cuò)誤引入，所以目前多用于實(shí)驗(yàn)室。新興的第三代測(cè)序技術(shù)包括合成測(cè)序、離子半導(dǎo)體測(cè)序、納米球測(cè)序等，其可對(duì)DNA或RNA分子進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的測(cè)序，并能可靠地解析重復(fù)序列和大型基因組重排，也能直接測(cè)序解析基因組區(qū)域，因此成為目前最常用的基因測(cè)序技術(shù)，但是仍存在堿基對(duì)讀取的準(zhǔn)確性較低、儀器和生物信息學(xué)所需的成本較高等問題，而解決這些問題則可能是未來實(shí)驗(yàn)室研究的重大突破點(diǎn)[6, 9]。

2 遺傳性易栓癥的相關(guān)致病基因及功能特征

自1965年遺傳性易栓癥患者的首個(gè)致病基因—抗凝血酶基因缺陷被報(bào)道后，臨床醫(yī)生在診療過程中逐漸重視血栓形成的遺傳因素，完善基因傾向性檢測(cè)以明確病因，尤其隨著NGS技術(shù)的普及，發(fā)現(xiàn)了G20210A突變、Leiden突變、Cambridge突變、Liverpool突變、ATBp3突變、C677T突變等數(shù)百種相關(guān)致病基因。

2.1 F2基因

F2基因編碼的凝血酶原可被活化為凝血酶，促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白而形成血栓，其主要抑制物為抗凝血酶(AT)。F2基因596位的突變可降低凝血酶與血栓調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合能力，影響蛋白C途徑的抗凝作用，促進(jìn)血栓形成[2]。目前已報(bào)道的F2基因突變有PTM突變(G20210A)、Yukuhashi(Arg596Leu)、Amrita(Arg596Gln)、Padua2(Arg596Trp)。PTM通過提高凝血酶原轉(zhuǎn)譯過程中mRNA的3′未翻譯區(qū)域的末端核苷酸的處理效率和準(zhǔn)確度，導(dǎo)致凝血酶原血漿濃度升高，形成高凝的血栓前狀態(tài)，這種突變?cè)诟呒铀魅巳褐懈甙l(fā)，在中國人群中的發(fā)生率較低。Amrita是中國人群的熱點(diǎn)突變型，其突變體的抗凝血酶抑制功能受損，致使凝血酶功能平衡向促凝途徑轉(zhuǎn)移[10]。在荷蘭人群中發(fā)現(xiàn)的C1621T錯(cuò)義突變，其是通過增加凝血酶電位和降低肝素抗凝功能而形成靜脈血栓栓塞癥(VTE)。有復(fù)發(fā)VTE病史的患者或家庭，不可忽視這些新突變或其他新的潛在遺傳機(jī)制。

2.2 F5基因

F5基因編碼的凝血因子V(FV)經(jīng)水解活化為FVa, 作為FXa的輔因子加速凝血酶的形成，也可經(jīng)活化蛋白C(APC)裂解后，協(xié)同蛋白S(PS)發(fā)揮抗凝活性。然而,F5基因易突變而導(dǎo)致FVa產(chǎn)生異常的蛋白C(PC)切割位點(diǎn)，抵抗APC的裂解，導(dǎo)致抗凝功能受損。常見的錯(cuò)義突變有Leiden(Arg506Glu)、Hong Kong突變(Arg306Gly)、Cambridge突變(Arg306Thr)、Liverpool突變(Ile359Thr)、HR2單倍型(A4070G)、Bonn突變(Ala512Val)。Leiden突變?cè)斐蒄Va抵抗APC作用，凝血酶濃度增加，導(dǎo)致血栓前狀態(tài)。Liverpool突變似乎會(huì)導(dǎo)致碳水化合物鏈增加，干擾位于相對(duì)遠(yuǎn)離殘基Asn357的結(jié)合位點(diǎn)，顯著降低Arg306的裂解率，使FVa抗凝活性降低，也不能裂解FVIIIa, 促成血液高凝[11]。

2.3 SERPINC1基因

SERPINC1基因?qū)ν蛔兒苊舾?，甚至微小錯(cuò)義突變都可能導(dǎo)致其編碼的AT產(chǎn)生缺陷[12]，使血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加9.8倍[13]。由于目前檢測(cè)AT缺乏癥的診斷方法的局限性，不能準(zhǔn)確檢測(cè)到突變的反應(yīng)位點(diǎn)(IIRS)、肝素結(jié)合位點(diǎn)(IIHBS), AT缺乏癥檢出率較低(<1%)[14]。但是, AT-ⅡHBS(Pro73Leu、Asn77His、Arg79Cys、Arg79His、Leu131Phe、Gln150Pro)與動(dòng)脈血栓形成相關(guān)，尤其是Pro73Leu和Arg79His突變，減弱了肝素誘導(dǎo)的抗凝血酶活性。曾偉等[13]發(fā)現(xiàn)的新復(fù)合突變熱點(diǎn)，即G883A(Val295Met)、G881T(Arg294Leu)和C880T(Arg294Cys), 可能通過減弱天然抗凝血酶與靶蛋白酶的相互作用，使中國人群VTE的風(fēng)險(xiǎn)增加近20倍。Cambridge Ⅱ突變(Arg416Ser)更是被證明與心肌梗死有關(guān)[15]。

2.4 PROC基因

PROC基因編碼的PC是一種具有抗凝特性的糖蛋白。PROC基因突變或多態(tài)性易引起PC缺乏，抗凝功能受損，產(chǎn)生VTE。遺傳性PC缺乏常見的突變有的Arg189Trp[16]、Asp297His(變異率51%)、K193del、Arg147Trp和Lys150del等，其中部分致病性不明。已知的Arg189Trp突變不會(huì)顯著影響PC的分泌和降解，但會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變，阻礙PC與細(xì)胞表面磷脂、PS以及部分凝血因子的作用，是中國VTE的普遍危險(xiǎn)因素，將該變異納入常規(guī)易栓檢測(cè)可改善靜脈血栓形成的診斷和預(yù)防[17]。Arg147Trp和Lys150del編碼的PC都有正常的酰胺水解和蛋白水解活性，但是前者與內(nèi)皮蛋白C受體結(jié)合的親和力降低約3倍，導(dǎo)致抗凝作用減弱; 后者在強(qiáng)效輔因子存在情況下仍會(huì)使抗凝活性受損2～3倍[18]。目前關(guān)于PROC基因突變的報(bào)道較少，未來可以擴(kuò)大樣本數(shù)據(jù)，以客觀準(zhǔn)確地評(píng)估其突變?cè)谥袊巳褐袦p弱抗凝的作用。

2.5 PROS1基因

PROS1基因編碼的PS可顯著增強(qiáng)APC對(duì)凝血限速因子的滅活作用，抑制凝血酶的形成。單一PROS1基因突變患者的靜脈血栓發(fā)病率較低，僅當(dāng)合并其他繼發(fā)性危險(xiǎn)因素(例如妊娠、口服避孕藥、手術(shù)等)時(shí), VTE的發(fā)病率才會(huì)明顯升高。中國人群中常見的突變類型有無義突變、錯(cuò)義突變(例如Arg355Cys、Leu607Ser)以及剪切位點(diǎn)突變，剪接位點(diǎn)突變可引起mRNA的異常剪接，改變翻譯閱讀框并且提前終止翻譯過程，最終產(chǎn)生不穩(wěn)定的PS突變蛋白[19]。錯(cuò)義突變表達(dá)的細(xì)胞經(jīng)裂解后的產(chǎn)物和PS水平降低，導(dǎo)致PS折疊異常，不能將活性凝血酶限制在損傷部位，導(dǎo)致血栓彌漫性形成。

2.6 MTHFR基因

MTHFR基因編碼亞甲基四氫葉酸還原酶，在蛋氨酸和葉酸代謝以及蛋白質(zhì)、DNA和RNA合成中具有關(guān)鍵作用[20], 可將同型半胱氨酸甲基化為蛋氨酸。目前報(bào)道了34種罕見但有害的突變[21], 通常與其他缺陷基因共同降低MTHFR活性，導(dǎo)致同型半胱氨酸水平升高，增加動(dòng)脈閉塞性疾病和靜脈血栓形成危險(xiǎn)度[22]。較為常見的有MTHFR C677T突變 (Ala222Val)和A1298C(Glu429Ala), 兩者可降低體外MTHFR酶活性，兩種突變獨(dú)立存在時(shí)，對(duì)血栓形成產(chǎn)生相反作用; 共同存在時(shí)，對(duì)血栓形成產(chǎn)生協(xié)同作用[23]。

2.7 JKA2基因

JAK2編碼表達(dá)的Janus激酶(JAK)是一類位于胞漿內(nèi)的非受體型蛋白酪氨酸激酶。JAK2突變導(dǎo)致機(jī)體血細(xì)胞增多、血液黏度增加、血液凝固和血管壁內(nèi)皮改變，影響細(xì)胞黏附。已知的JAK2V617F是一種獲得性突變，是門靜脈和腸系膜靜脈血栓、腦室出血的高危因素，通常與慢性骨髓增殖性腫瘤相關(guān)，包括真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥和原發(fā)性骨髓纖維化。目前越來越多的證據(jù)[24]支持JAK2V617F突變可以作為血栓形成的新危險(xiǎn)因素，盡管尚未提供前瞻性臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證，但是對(duì)于全血細(xì)胞計(jì)數(shù)升高的病例，應(yīng)進(jìn)行JAK2V617F突變篩查以防止血栓形成[25]。

2.8 TFPI基因

TFPI基因編碼的組織因子途徑抑制物(TFPI)可調(diào)控外源性凝血途徑、抑制游離凝血酶，限制損傷部位的凝血反應(yīng)。以往對(duì)于TFPI更關(guān)注研究出血性疾病的靶向抗TFPI(例如康珠單抗)，但是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)TFPI水平降低會(huì)增加靜脈血栓形成和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[26]。已知TFPI突變(Cys399Thr、Thr287Cys、Thr33Cys和Val264Met等)和靜脈血栓形成患者的TFPI水平降低有關(guān)[27], 但是作用機(jī)制還需要在更大的患者群體中進(jìn)行更多的研究來驗(yàn)證。

3 遺傳性易栓癥基因診斷流程

關(guān)注和篩查遺傳性易栓癥，不是純粹的實(shí)驗(yàn)室檢查[28], 也不能盲目檢測(cè)靜脈血栓栓塞患者的血栓形成傾向[29], 僅在具有特定適應(yīng)證的患者中篩查[28]。依據(jù)臨床易栓癥評(píng)估和實(shí)驗(yàn)室檢查確定篩查方向和順序，臨床醫(yī)生層層評(píng)估推進(jìn)，判斷是否需要基因檢測(cè)。對(duì)于排除獲得性高危因素(>60歲、骨髓增殖性腫瘤、PNH、庫欣綜合征等)的血栓首發(fā)患者，可先行基因擴(kuò)增，使用第二代全外顯子測(cè)序?qū)ο茸C者及其父母進(jìn)行常見突變位點(diǎn)的篩查，一旦發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，再對(duì)家系中全部直系親屬進(jìn)行驗(yàn)證[1], 同時(shí)應(yīng)告知親屬基因突變只是易患靜脈血栓栓塞性疾病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。進(jìn)行定期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并實(shí)施必要的臨床干預(yù)，但并非所有具有相同突變的患者都會(huì)發(fā)生血栓栓塞[28, 30]。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果呈陰性的易栓癥患者，需要進(jìn)一步行全外顯子或全基因組測(cè)序篩查，并且通過家系共分離等技術(shù)尋找家系中可能存在的新致病基因[31]。

4 總結(jié)及展望

中國人群的遺傳性易栓癥診斷主要針對(duì)抗凝蛋白的檢測(cè)，其表型檢測(cè)結(jié)果易受到干擾[1, 32], 而隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，準(zhǔn)確性高的基因檢測(cè)正逐漸成為主要的診斷方式?；驒z測(cè)能早期診斷和明確病因，幫助臨床醫(yī)生開展個(gè)性化診療，為高危人群提供適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施?；蛲蛔冇挟愘|(zhì)性，國外的易栓癥篩查研究并不適用于指導(dǎo)評(píng)估國內(nèi)易栓癥患者的血栓性疾病風(fēng)險(xiǎn)，還需進(jìn)一步將區(qū)域基因分布特點(diǎn)結(jié)合臨床表型，完善國內(nèi)的基因譜，制訂實(shí)用的基因檢測(cè)方案; 同時(shí)，建立相匹配的高通量測(cè)序技術(shù)，使許多基因在個(gè)體患者身上能夠進(jìn)行研究，而這些都可能是未來易栓癥診治的新方向。