吳天昊， 韓 蕊， 許志凌云， 許秀穎， 侯景瑤， 齊佳偉， 吳玉柱，趙城彬， 劉景圣

(吉林農業(yè)大學 食品科學與工程學院/小麥和玉米深加工國家工程實驗室， 吉林 長春 130118)

玉米中含有豐富的維生素和植物纖維素，有促進胃腸蠕動、抑制餐后血糖及降血脂等營養(yǎng)功效。玉米中約含70%淀粉，玉米淀粉(corn starch，CS)作為一種廉價、易得的食品原料，常在食品加工中作為穩(wěn)定劑和食品增稠劑等[1-2];但由于CS本身存在易老化、熱穩(wěn)定性差、快速消化淀粉含量較高等缺陷，限制了其在食品工業(yè)中的應用范圍[3]。

目前較多研究表明，蛋白質的添加可改善淀粉凝膠的結構及消化特性。Yang等[4]發(fā)現(xiàn)，乳清分離蛋白與玉米淀粉在蒸煮過程中主要通過氫鍵作用，并且隨著乳清分離蛋白的增加，加熱過程中淀粉顆粒的凝膠化過程被延緩，并降低了淀粉的消化率。肖瑜[5]研究發(fā)現(xiàn)，在消化過程中，蛋白質覆蓋于淀粉顆粒表面，可阻礙消化酶對淀粉顆粒的可及性，從而降低淀粉的消化性。Lu等[6]研究表明，馬鈴薯分離蛋白和馬鈴薯淀粉之間通過靜電作用和氫鍵作用結合，隨著蛋白質混合比例的增加，降低了加工過程中共混物的淀粉消化率。陳旭[7]研究了外源脂質和蛋白質對淀粉形貌特征及消化特性的影響，結果發(fā)現(xiàn)玉米油和大豆蛋白均可降低淀粉的消化速率。已有研究均表明，原蛋白質的添加能夠改善淀粉凝膠的結構及消化特性，然而關于改性蛋白與淀粉復配體系的相關研究卻鮮見報道。超聲波是一種成本低、效率高的改性方式，超聲處理產生的空穴效應可改變蛋白質構象、展開柔性結構，使蛋白平均粒徑減小，表面疏水性和溶解度增加，二級、三級結構發(fā)生改變，使更多的巰基和疏水基團暴露于蛋白質分子的表面，降低蛋白質溶液的表面張力和剛性，從而導致聚合物的結構更穩(wěn)定。超聲對蛋白質的這種改變，可能會促進其與淀粉相互作用，從而改變淀粉凝膠的特性。本研究擬將不同超聲時間處理的大豆分離蛋白與CS復配，研究其對CS凝膠的結構和消化特性的影響，以期改善CS凝膠的功能特性，擴大其應用范圍，為改性蛋白在淀粉基食品中的應用提供基礎數據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CS(水分質量分數12%、直鏈淀粉質量分數24%)，上海瑞永生物科技有限公司；大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)(蛋白質量分數為90.2%)，北京奧博星生物技術有限責任公司；NaCl、尿素(urea)、十二烷基硫酸鈉(K12)等化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；P7545豬胰α-淀粉酶(8 U/mg)、A7095淀粉葡萄糖苷酶(260 U/mL)，美國Sigma-Aldrich公司；D-葡萄糖檢測試劑盒(GOPOD 法)，愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 儀器與設備

JY92- 2D型超聲波細胞粉碎機，寧波Scientz生物科技股份有限公司；ALPHA1- 4LD plus型冷凍干燥機，德國Christ公司；PC- 620D型磁力攪拌器，美國Corning公司；VERTEX 70型傅里葉紅外光譜儀(FTIR)，德國Bruker公司；Q- 2000型差示掃描量熱儀，美國TA公司；D/MAX2500 MCR- 302型X-射線衍射儀，日本理學公司；MCR- 302 型流變儀，奧地利Anton Paar公司；Alpha1- 4Ldplus型全波長酶標儀，德國Christ公司；RF- 5301PC型熒光分光光度計，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1改性蛋白的制備

超聲處理SPI分散液參照胡昊[8]的方法，略作改動。準確稱取3 g的SPI置于100 mL三角瓶中，加入蒸餾水配置成質量濃度為0.06 g/mL的SPI分散液，在室溫下磁力攪拌2 h至充分溶解，并放置于4 ℃冰箱中備用。用直徑為0.636 cm的超聲波探頭伸入SPI溶液表面下方1～2 cm處理SPI分散液。整個超聲過程中，對三角瓶進行冰浴，以避免蛋白過熱。以未經超聲處理的SPI分散液作為對照組，在20 kHz的超聲頻率和300 W輸出功率下對蛋白溶液進行超聲。每超聲4 s，停止超聲2 s，總作用時間為(含每4 s工作后休息2 s的時間)10、20、30 min。超聲結束后，將蛋白冷凍干燥，然后放入干燥器中保存，即獲得超聲改性SPI(U-SPI)。

1.3.2復配樣品的制備

根據Zhang等[9]的方法稍作修改。在前期預實驗以及肖瑜等[5]的研究基礎上，樣品中蛋白添加量為總樣品質量的10.0%。準確稱量3 g樣品放入快速黏度分析儀(RVA)專用鋁盒中，加入去離子水，配成質量分數為10%的懸浮液，將樣品攪拌至完全溶解，避免樣品結塊及掛壁。RVA糊化程序：在50 ℃ 下保持1 min，以12 ℃/min 在3.75 min內升溫到95 ℃，在95 ℃下保持2.5 min，然后在3.75 min內下降到50 ℃，繼續(xù)保溫2 min。前10 s內攪拌速率為960 r/min，而后以160 r/min攪拌速率進行測定。將糊化后的樣品凍干、粉碎過100目篩，儲存于干燥器中備用。以糊化后的玉米淀粉作為對照樣品，蛋白超聲0、10、20、30 min后與玉米淀粉復配的樣品分別用SPI-CS、U10-SPI-CS、U20-SPI-CS、U30-SPI-CS表示。

1.3.3U-SPI二級結構的測定

參考Zhao等[10]的方法測定復配樣品的FTIR光譜。測定溫度為25 ℃，波數掃描范圍為 500～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，波數精度為0.01 cm-1，掃描次數為64次。

1.3.4U-SPI三級結構的測定

參考Peng等[11]的方法，將樣品溶液用磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L、pH值 7.0)稀釋至蛋白質質量濃度為0.5 mg/mL，于激發(fā)波長280 nm、發(fā)射波長范圍300～500 nm掃描，激發(fā)狹縫寬為3 nm，發(fā)射狹縫寬為5 nm，掃描3次。

1.3.5復配樣品FTIR的測定

參考Cai等[12]的方法，稍作改動。在400～4 000 cm-1下掃描64次，分辨率為4 cm-1。采用 OMNIC 8.0對圖片進行處理，得到紅外去卷積光譜圖。

1.3.6復配樣品熱特性的測定

參考常曉紅[13]的方法并稍作修改。稱取5.0 mg樣品置于鋁質坩堝內，其中蛋白添加量占總樣品質量的10.0%，加入10 μL去離子水，密封壓蓋。密封后在4 ℃條件下平衡24 h，以10 ℃/min 的速度從40 ℃升至120 ℃進行掃描。空鋁質坩堝為對照，記錄凝膠化的起始溫度(to)、峰值溫度(tp)、終止溫度(tc)和熱焓值(ΔH)。

1.3.7復配樣品晶體結構的觀察

根據Qiao等[14]的方法，略有修改。測定CS和蛋白- 淀粉復配體系的結晶特性。采用銅靶Cu Kα，管壓40 kV，管流30 mA，掃描角度(2θ)范圍為5 °～50 °，掃描速率為5 °/min，步長0.02 °。

1.3.8復配樣品相互作用力的測定

采用Wang等[15]的方法測定了蛋白- 淀粉糊在熱處理后的分子相互作用力。將2.0 g樣品放入含有25 mL蒸餾水的鋁盒中，其中蛋白添加量為總樣品質量的10.0%，將獲得的蛋白- 淀粉混合物攪拌10 min。將懸浮液與NaCl溶液(0.1、0.2、0.3 mol/L)、urea溶液(0.1、0.2、0.3 mol/L)和K12(1%、2%、3%)混合，以不含這3種化學物質的蛋白混合物作為對照。將懸浮的混合物置于試管中，用95 ℃水浴加熱15 min，冷卻至37 ℃，在0.1～10.0 Hz，1%的應變條件下進行流變學測試。

1.3.9復配樣品消化特性的測定

樣品消化率根據Englyst等[16]的方法測定，并稍作修改。稱取600 mg制備好的樣品，加入乙酸鈉緩沖溶液(15 mL、0.1 mol/L、pH值5.2)以及6枚玻璃珠于100 mL錐形瓶中，在37 ℃下間歇混合平衡5 min。將5 mL混合酶溶液(豬胰α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶)添加到每個錐形瓶中。將樣品放入37 ℃恒溫水浴搖床中進行酶解。在0、10、20、30、40、60、80、100、120 min各取出0.5 mL，并與4 mL的無水乙醇(質量分數為70%)混合以終止反應，在4 500 r/min下離心10 min，取離心后的上清液，采用D-葡萄糖檢測試劑盒來測定水解產物。將0、20、120 min水解后的葡萄糖含量分別標記為m0、m20和m120。根據式(1)、(2)、(3)計算快消化淀粉(RDS)，慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)的含量。

(1)

(2)

w(RS)=[1-w(RSD)-w(SDS)]×100%。

(3)

式(1)(2)(3)中，m0是上清液中樣品的游離葡萄糖質量，mg；m20是20 min時釋放的葡萄糖質量，mg；m120是120 min時釋放的葡萄糖質量，mg；mTS是總淀粉質量，mg。

1.4 數據處理

所有實驗重復測試3次取平均值。通過SPSS 25.0軟件對實驗數據進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著，同時使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 U-SPI結構特性分析

2.1.1U-SPI二級結構分析

SPI在波數為400～4 000 cm-1的紅外光譜見 圖1。 利用PeakFit 4.0軟件進行處理，通過去卷積計算可以得到蛋白質二級結構含量變化[17]。

圖1 不同超聲時間處理SPI的紅外光譜

不同超聲時間處理下SPI的二級結構相對含量分析結果見表1。由表1可知，與原蛋白相比，隨著超聲時間的延長，U-SPI的二級結構發(fā)生顯著變化，其α-螺旋結構相對含量減少，β-轉角和無規(guī)卷曲結構相對含量增加，表明蛋白結構由有序向無序趨勢轉變。這可能由于超聲處理破壞了蛋白質結構，增加蛋白質分子柔韌性，夏軒澤等[18]也得出類似結論。β-折疊相對含量能夠反映蛋白質疏水作用力，β-折疊相對含量降低表明蛋白表面疏水基團暴露，疏水性增強[19]。實驗結果表明，隨超聲時間的延長，蛋白的表面疏水性的增加，二級結構發(fā)生改變，并且打開蛋白分子或者聚合體，使巰基和疏水基團暴露，可能會改變蛋白三級結構，本實驗結果與Hu等[20]和Zhao等[21]的研究結果相類似。這些性質的變化可能會對蛋白- 淀粉凝膠的形成及特性產生一定影響。

表1 不同超聲時間處理下SPI的二級結構相對含量

2.1.2 U-SPI三級結構分析

在激發(fā)波長為280 nm處可反映蛋白質內部色氨酸的熒光強度變化，大量色氨酸存在于SPI的內部疏水區(qū)域，因此可從熒光的波動確定蛋白質三級結構的變化[22]。不同超聲時間處理SPI熒光強度的變化結果見圖2。由圖2可知，隨著超聲時間延長，SPI內源熒光強度升高，說明蛋白內部暴露的色氨酸基團增多。Sui等[23]在研究過程中也得出類似結論。超聲后的SPI熒光強度增加，可能是由于超聲處理改變了蛋白質分子內部的極性微環(huán)境，使蛋白結構變得疏松，促進蛋白內部疏水區(qū)域的打開，使埋藏于蛋白分子內部的疏水基團暴露出來導致熒光強度增加。本實驗結果與Li等[24]的研究結果一致。

圖2 不同超聲時間處理SPI熒光強度的變化

2.2 復配樣品結構特性分析

2.2.1復配樣品傅里葉紅外光譜分析

圖3 不同超聲條件改性SPI-CS復配體系的紅外光譜和去卷積化光譜

對900～1 200 cm-1段特征峰進行去卷積處理，分析蛋白質對淀粉短程有序結構的影響。1 054 cm-1和1 020 cm-1分別表征淀粉結晶區(qū)結構和非結晶區(qū)結構，993 cm-1表征淀粉分子羥基間形成的氫鍵結構[27]。波數為1 054 cm-1與1 020 cm-1、1 020 cm-1與993 cm-1處的吸收峰強度比值，可反映淀粉有序結構和氫鍵強度。不同超聲條件改性SPI-CS復配體系的短程有序結構參數計算結果見表2。由表2可知，與CS相比，當添加U-SPI后，U-SPI-CS體系在波數為1 054 cm-1與1 020 cm-1的吸收峰強度比值隨超聲時間的延長呈逐漸下降趨勢，而1 020 cm-1與993 cm-1的吸收峰強度比值逐漸升高。這表明淀粉顆粒短程有序性被破壞，淀粉顆粒的結晶區(qū)結構特征逐漸減弱，無定形區(qū)結構特征增強，淀粉分子鏈間原有的氫鍵被破壞，打破了分子間締合狀態(tài)。這可能是在超聲波的空穴效應及高壓和剪切力的作用下，隨著超聲時間的延長，SPI較大顆粒的聚集體解聚成更小的蛋白顆粒[28]，而小顆粒蛋白分子的加入抑制了淀粉分子間的相互作用，從而抑制淀粉分子內和分子間氫鍵的形成。

表2 不同超聲條件改性SPI-CS復配體系的短程有序結構參數

2.2.2 復配樣品的熱特性分析

不同超聲條件改性SPI-CS復配體系的熱力學參數測定結果見表3。由表3可知，熱處理后，SPI和U-SPI的加入使復配體系的熱特性產生明顯變化。ΔH可用來表示淀粉相變過程中雙螺旋解聚及熔融所需要的能量，淀粉的有序結構被破壞使得體系焓值降低[29]。與CS相比，熱處理后的SPI-CS體系和U-SPI-CS體系的ΔH均顯著降低(P<0.05)，當超聲時間為0、10、20、30 min時，SPI和U-SPI的加入使復配體系ΔH分別降低了10.02%、20.25%、23.14%、27.27%。由此可見，SPI和U-SPI的加入，可降低淀粉熔融所需要的能量。與SPI-CS體系相比，U-SPI-CS體系作用的程度更大；且隨著超聲時間的延長，ΔH降低的程度越大。這表明超聲對于蛋白質結構的伸展和構象的改變，影響了其與玉米淀粉復合凝膠體系的形成。超聲空穴效應使蛋白質大分子物質分解為小分子顆粒，導致體系中蛋白顆粒的大小和數目均發(fā)生了變化[30]，使超聲改性蛋白能更大程度包裹在淀粉顆粒表面。隨著超聲時間的延長，改性的蛋白質顆粒粒徑變小[31]，包裹的程度更大，阻礙了水分子與淀粉顆粒的接觸，使淀粉分子間氫鍵的結合受到抑制，導致淀粉顆粒中結晶區(qū)域的不完全熔化，從而使糊化受到抑制，降低了ΔH。

表3 不同超聲條件改性SPI-CS復配體系的熱力學參數

2.2.3復配樣品的晶體結構分析

淀粉是一種天然多晶聚合物，常用X-射線衍射的方法來分析淀粉的晶體結構特征[32]。不同超聲條件改性SPI-CS復配體系的X射線衍射圖見圖4。由圖4可知，未糊化的玉米淀粉在2θ為15°和23°處顯示強衍射峰，在17°和18°處有未分解的雙峰，這是典型的A型結構[32]。糊化后，CS、SPI-CS和U-SPI-CS體系的XRD圖均表現(xiàn)出分散的模式，原淀粉的結晶峰消失，表明糊化使淀粉凝膠樣品中A型結構受損[33]。所有樣品均在2θ約20°時出現(xiàn)寬峰，呈現(xiàn)典型Ⅴ型結構[34]。這是因為淀粉在糊化過程中由于濕熱效應破壞了淀粉的晶體結構有序性，而在冷卻過程中只有一小部分有缺陷的晶體形成。隨著SPI和不同超聲時間SPI的加入，復配體系峰的位置未發(fā)生明顯變化，也沒有出現(xiàn)與淀粉和蛋白質晶體相關的新峰。這表明不同超聲時間處理SPI的添加對CS的晶體類型沒有影響。Wang等[15]在研究秈稻淀粉與蛋白熱加工相互作用時也得到類似研究結果，但區(qū)別于Wang等研究的是本實驗采用了改性的SPI。

圖4 不同超聲條件改性SPI-CS復配體系的 X射線衍射圖

2.2.4復配樣品的相互作用力分析

本研究通過在樣品中添加特定化學物質(NaCl、urea和K12)來研究非共價結合相互作用對淀粉- 蛋白質混合物的流變學或黏度特性的影響。NaCl影響靜電相互作用，urea破壞氫鍵，K12影響疏水力[35]。受添加特定化學物質影響的SPI-CS和U30-SPI-CS體系儲能模量圖譜見圖5。由圖5可知，當體系中加入K12后，SPI-CS和U30-SPI-CS體系的彈性模量G′位移明顯向高值移動，且隨著K12濃度的升高彈性模量G′移動越明顯，而加入NaCl和urea則波動較小，說明相比靜電相互作用和氫鍵，SPI-CS和U30-SPI-CS中主要以疏水相互作用為主。

圖5 添加NaCl、urea和K12對淀粉- 蛋白糊的儲能模量的影響

在超聲及加熱過程中，蛋白質發(fā)生部分變性，可能會暴露蛋氨酸、半胱氨酸等疏水氨基酸[36]，這些疏水殘基與淀粉的疏水區(qū)域(如C-H)發(fā)生疏水相互作用[37]。改性蛋白在靜電相互作用力和疏水作用力的共同作用下可能吸附在淀粉顆粒的表面，與淀粉分子鏈纏結，形成凝膠，從而改變淀粉的糊化、回生和流變學性質[38]。Xu 等[39]利用色譜法和分子模擬也證實大米蛋白和直鏈淀粉間可自發(fā)地結合，且主要驅動力為疏水相互作用力。

2.3 復配樣品的消化特性分析

SPI-CS和U-SPI-CS復配體系體外消化擬合曲線見圖6。由圖6可知，與SPI-CS體系相比，U-SPI-CS體系的水解率下降程度更顯著，且隨著超聲時間的延長，U-SPI-CS體系的水解率下降程度越大。RDS、SDS、RS質量分數分析結果見表4。由表4可知，SPI和U-SPI的加入使體系的水解率和RDS質量分數顯著降低(P<0.05)，SDS和RS質量分數顯著升高(P<0.05)。與CS相比，添加超聲時間0、10、20、30 min的SPI時，復配體系的RDS質量分數分別降低了2.42%、7.11%、9.43%、10.42%，SDS含量分別升高了1.60%、5.31%、6.60%、7.01%，RS含量分別升高了0.82%、1.80%、2.83%、3.41%。RDS、SDS和RS質量分數分析結果表明，U-SPI比SPI改變淀粉消化率的效果更明顯。這可能是由于超聲改性后暴露出的疏水殘基可顯著增強蛋白質- 淀粉的相互作用，促使蛋白包裹在淀粉顆粒表面，阻礙淀粉和淀粉酶相互作用。且隨超聲時間的延長，更多通過超聲改性后小顆粒蛋白附著在淀粉顆粒表面，從而起到包裹作用，降低了淀粉酶與淀粉接觸的面積，促進了淀粉之間的相互聚集，導致了SDS和RS質量分數升高。相關研究表明，淀粉的Ⅴ型晶體結構更有助于形成抗性淀粉，并在抑制淀粉消化中起重要作用[40]，體外消化特性分析也證實了2.2.3中圖4的這一結論。與CS相比，U30-SPI-CS復配體系對淀粉消化的抑制作用最為顯著，表現(xiàn)出對人體的潛在健康益處。López-Barón等[41]在研究天然、變性和經酶水解的幾種蛋白對小麥淀粉消化性的影響時發(fā)現(xiàn)，天然蛋白和淀粉的結合力較弱，對混合物的RDS質量分數無顯著影響，而酶水解和熱變性后暴露出的疏水殘基可顯著增強蛋白質- 淀粉的相互作用，促使蛋白在淀粉顆粒表面形成一層包衣，阻礙酶的可及性，顯著降低了混合物的RDS質量分數。

表4 超聲改性蛋白對玉米淀粉體外消化結果的影響

圖6 不同超聲條件改性SPI-CS復配體系的 水解率變化

3 結 論

本研究對超聲改性SPI-CS凝膠的結構以及消化特性影響進行了分析。與CS相比，在CS中添加不同超聲時間處理的SPI，U-SPI-CS凝膠體系的有序程度降低，分子間及分子內氫鍵強度減弱，ΔH降低；與SPI-CS復配體系相比，U-SPI-CS體系的作用效果更為顯著(P<0.05)。隨著超聲處理時間的延長，U-SPI的加入使CS的短程有序性、體系氫鍵強度和ΔH均逐漸降低；SDS和RS質量分數逐漸升高。相互作用力的分析結果表明，超聲改性蛋白與淀粉間主要結合方式為疏水相互作用。X-射線衍射分析表明復配體系在2θ約20°出現(xiàn)寬峰，形成了典型的Ⅴ型晶體結構。改性蛋白加入改變了淀粉消化特性。與CS相比，超聲30 min U-SPI-CS復配體系變化最明顯，SDS和RS質量分數分別提升了7.01%和3.41%。此外，為進一步明確超聲改性SPI對CS消化特性的影響，有待于在體內進行再驗證，如細胞實驗、動物實驗；體內血糖變化規(guī)律、胰島素抵抗情況等還有待進一步研究。希望本研究可為超聲改性蛋白對CS凝膠結構及消化特性的影響規(guī)律提供一定的理論指導。