呂雪峰， 許艷麗， 鄭文新， 胡 昕， 王 樂(lè)

(新疆畜牧科學(xué)院 畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所， 新疆 烏魯木齊 830000)

0 引言

【研究意義】絨山羊是我國(guó)重要的牲畜品種之一，為人類提供羊絨、羊皮和羊肉等重要畜產(chǎn)品，在畜牧業(yè)發(fā)展中占有重要地位，特別在西北荒漠地區(qū)，絨山羊一直是牧民經(jīng)濟(jì)收入的重要來(lái)源。我國(guó)絨山羊經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育，已經(jīng)擁有了許多產(chǎn)絨量高、絨品質(zhì)優(yōu)的品種，如遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、新疆山羊、西藏山羊和陜北白絨山羊等，據(jù)2021年《中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，截止2020年底，我國(guó)山羊存欄13 345萬(wàn)只，山羊絨產(chǎn)量15 244 t，是絨山羊養(yǎng)殖和產(chǎn)絨大國(guó)，在世界上占有舉足輕重的地位。近年來(lái)，隨著生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識(shí)增強(qiáng)，絨山羊養(yǎng)殖已經(jīng)逐步轉(zhuǎn)向半舍飼或全舍飼，為追求更高的經(jīng)濟(jì)效益，高繁殖力和抗病性成為選育關(guān)注的焦點(diǎn)。主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompability complex, MHC)是由緊密連鎖、高度多態(tài)的基因座組成的復(fù)合體，具有高度的多態(tài)性，控制著機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力[1]。由I類、II類和III類基因組成，其中II類基因的多態(tài)性在動(dòng)物免疫中發(fā)揮最主要的作用，II類基因包含DQ、DR、DO等亞區(qū)，其產(chǎn)物參與抗原遞呈和T細(xì)胞激活，在機(jī)體免疫中有重要作用，是開(kāi)展抗病育種的首選標(biāo)記基因，同時(shí)適用群體適應(yīng)性遺傳變異研究[2-3]。因此，研究絨山羊DRB1基因有助于絨山羊抗病育種，還可為種質(zhì)資源的深度挖掘、分子評(píng)價(jià)、優(yōu)良絨山羊品種的保護(hù)和利用提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】MHC基因(Goat lymphocyte antigen，GOLA)遺傳多態(tài)性的研究主要集中在DR亞區(qū)的DRB基因[4-6]和DQ亞區(qū)的DQA1基因[7-9]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，DRB基因外顯子多態(tài)性與綿羊布魯氏菌病[10-11]、線蟲[12]、包蟲病[13]、葡萄球菌病[14]等多種疾病存在一定的關(guān)聯(lián)性。在陜北絨山羊中發(fā)現(xiàn)DRB1*16 等位基因頻率與球蟲感染強(qiáng)度顯著相關(guān)[15]，河西絨山羊中發(fā)現(xiàn)DRB1*8可能是流產(chǎn)發(fā)病的遺傳易感基因[16]；黃蘭等[17]在黔北麻羊DRB1基因Exon3 中檢測(cè)7個(gè)SNPs，均引起RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，但并未引起抗原表位改變?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】大量研究證實(shí)，DRB1基因作為抗病分子遺傳標(biāo)記，其多態(tài)位點(diǎn)主要位于第2外顯子序列，新疆山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和西藏山羊生活的自然環(huán)境差異很大，在適應(yīng)性方面有各自的特點(diǎn)，如西藏山羊受到高海拔適應(yīng)性的選擇[18]，內(nèi)蒙古絨山羊在人為選育方面強(qiáng)度更大。通過(guò)DRB1基因第2外顯子研究我國(guó)3個(gè)主要絨山羊品種的群體結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和適應(yīng)性選擇等方面還未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以新疆山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和西藏山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)分析3個(gè)絨山羊品種DRB1基因第2外顯子序列的遺傳變異，以闡明該基因在不同絨山羊品種中的遺傳多樣性和遺傳變異，并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)編碼序列進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè)，篩選出絨山羊疾病抗性和易感病候選基因，以期為開(kāi)展抗病育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和西藏山羊樣品采集地點(diǎn)分別位于新疆和豐縣、內(nèi)蒙古鄂爾多斯市和西藏日土縣，采集數(shù)量分別為33只、17只和22只。頸靜脈采血，EDTA抗凝，冷藏保存。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA提取 采用生工生物工程(上海)股份有限公司的EZUP柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 采用在線primer設(shè)計(jì)DRB1基因第2外顯子引物：5′-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3′和5′-TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度258 bp，引物由工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增采用德國(guó)biometra PCR儀，反應(yīng)體系(25 μL)：基因組DNA 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.3 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送工生物工程(上海)股份有限公司純化和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中比對(duì)，確保所得序列是目標(biāo)序列，用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用DnaSP V5(version 5.10.01)計(jì)算各堿基組成比例、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(k)、品種間核苷酸平均差異數(shù)(Kxy)、基因分化系數(shù)(Gst)、核苷酸歧義度(Dxy)、遺傳分化指數(shù)(Fst)和基因交流值(Nm)，并進(jìn)行中性檢驗(yàn)；運(yùn)用MEGA 7.0計(jì)算品種之間的遺傳距離(采用Kimura雙參數(shù)模型)，計(jì)算序列同義突變率(dS)和非同義突變率(dN)，分析DRB1基因受到的選擇壓力；采用NJ法(Bootstrap抽樣重復(fù)次數(shù)為1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)；用Arlequin V 3.5.1.3進(jìn)行分子變異分析。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 測(cè)定核酸序列翻譯成氨基酸后，采用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性質(zhì)；Protscale工具(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質(zhì)疏水性；SignalP 5.0 Server 工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析磷酸化位點(diǎn)；利用SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Phyre2(Esypred 3D Web Server 4.0)對(duì)DRB1蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DRB1基因第2外顯子序列特征

3個(gè)絨山羊品種的基因組 DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，得到與預(yù)期目標(biāo)片段大小一致、整齊而清晰的條帶，測(cè)序后與GeneBank(登錄號(hào)：AB008346.1)中山羊CDS區(qū)比對(duì)，序列為DRB1基因第2外顯子，經(jīng)比對(duì)校正后得到240 bp的核酸序列。3個(gè)品種69條序列檢出核苷酸多態(tài)位點(diǎn)32個(gè)，其中單堿基突變位點(diǎn)3個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)29個(gè)，占全部核苷酸序列的13.33%。由表1可見(jiàn)，基因序列中T、C、A和G含量分別為16.9%、24.2%、22.2%和36.7%，其中A+T含量(39.1%)遠(yuǎn)低于C+G含量(60.9%)。

表1 3個(gè)絨山羊品種DRB1基因第2外顯子序列堿基組成

2.2 3個(gè)絨山羊品種的遺傳多樣性

由表2可知，3個(gè)絨山羊品種群體的單倍型多樣度(Hd)均大于0.9，其中，新疆山羊的單倍型多樣度最高，為0.993；西藏山羊最低，為0.900。3個(gè)絨山羊品種的平均核苷酸多樣度均大于0.02，其中，西藏山羊的核苷酸多樣度最高，為0.060 25；內(nèi)蒙古絨山羊最低，為0.022 00。3個(gè)絨山羊品種Tajima’s D中性檢測(cè)無(wú)顯著性差異。

表2 3個(gè)絨山羊品種的采集信息與遺傳多樣性

2.3 3個(gè)絨山羊品種的遺傳分化

經(jīng)計(jì)算3個(gè)絨山羊品種基因差異程度的遺傳學(xué)參數(shù)顯示，3個(gè)絨山羊品種總基因分化系數(shù)(Gst)為0.002 73，總遺傳分化指數(shù)(Fst)為0.181 24，總基因流(Nm)為1.13。3個(gè)絨山羊品種間基因分化系數(shù)(Gst)為0.001 03～0.003 98，均值為0.002 42；遺傳分化指(Fst)為0.116 14～0.212 63，均值為0.177 65；核苷酸差異數(shù)(Kxy)為12.106 95～15.243 94，均值為13.772 52；核苷酸歧義度(Dxy)為0.050 24～0.063 25，均值為0.057 15。

2.4 3個(gè)絨山羊品種的遺傳距離

從NCBI中下載西班牙野山羊(登錄號(hào)：AF461696)、野山羊(登錄號(hào)：U00198)、蘇格蘭絨山羊(登錄號(hào)：LS974820)、印度羅伊爾坎迪山羊(登錄號(hào)：KT624235)、洛基山山羊(登錄號(hào)：DQ648493)和薩能奶山羊(登錄號(hào)：AB008362)的同源序列，以Kimura-2參數(shù)為模型，計(jì)算各品種之間的遺傳距離(表3)。3個(gè)絨山羊品種之間的遺傳距離比較接近，內(nèi)蒙古絨山羊與新疆山羊之間的遺傳距離為0.070，與西藏山羊之間的為0.084，新疆山羊與西藏山羊之間的為0.098。西藏山羊與西班牙野山羊之間的遺傳距離較小，僅0.048，與野山羊之間的為0.075；新疆山羊和內(nèi)蒙古絨山羊與西班牙野山羊間的遺傳距離相同，均為0.084。3個(gè)絨山羊與其他山羊品種之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，為0.080～0.128。

表3 9個(gè)山羊品種間的遺傳距離(下三角)和標(biāo)準(zhǔn)誤(上三角)

2.5 3個(gè)絨山羊品種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

以鄰接法Neighbour-Joining構(gòu)建3個(gè)絨山羊品種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1a)，新疆山羊先與內(nèi)蒙古絨山羊聚在一起，然后再與西藏山羊聚在一起。以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的6個(gè)山羊品種為外群，與3個(gè)絨山羊品種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1b)顯示，西藏山羊先與西班牙野山羊聚在一起，再與野山羊聚在一起，最后與新疆山羊和內(nèi)蒙古絨山羊聚為一個(gè)大的分枝，其余4個(gè)國(guó)外山羊品種(蘇格蘭絨山羊、印度羅伊爾坎迪山羊、洛基山山羊和薩能奶山羊)聚為另一分枝。

注：a,3絨山羊品種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；b,9個(gè)山羊品種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.6 3個(gè)絨山羊品種的群體變異

經(jīng)AMOVA 分子變異分析得出，3個(gè)絨山羊品種群體間的遺傳變異為24.71%，遠(yuǎn)小于群體內(nèi)的遺傳變異(75.29%)。說(shuō)明，遺傳變異主要來(lái)自品種內(nèi)，品種間的遺傳變異較低。

2.7 3個(gè)絨山羊品種的選擇壓力

由表4可知，3個(gè)絨山羊品種DRB1基因受到明顯的選擇壓力，序列中非同義替換率(dn)均顯著大于同義替換率(ds)。其中，內(nèi)蒙古絨山羊DRB1基因受到更強(qiáng)的選擇壓力，其次是新疆山羊，西藏山羊受到的選擇壓力最小。

表4 3個(gè)絨山羊品種DRB1基因同義替換與非同義替換率

2.8 DRB1序列生物信息學(xué)

2.8.1 蛋白理化性質(zhì) 通過(guò)測(cè)序比對(duì)分析，絨山羊DRB基因第2外顯子240個(gè)堿基共編碼80個(gè)氨基酸殘基，與GeneBank中AB008346.1中山羊完整CDS區(qū)比對(duì)，氨基酸差異達(dá)21個(gè)。選擇每個(gè)品種中單倍型數(shù)量多的序列用于生物信息學(xué)分析，內(nèi)蒙古絨山羊DRB1序列分子式為C416H620N128O134S2，預(yù)測(cè)分子量約為9 622.40 Da，理論等電點(diǎn)為5.15，由19種基本氨基酸組成，其中，精氨酸(Arg)含量最高，占氨基酸總數(shù)的15.0%，谷氨酸(Glu)其次，占12.5%(表5)；含有帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)16個(gè)，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)13個(gè)，280 nm 的摩爾消光系數(shù)為20 065 mol/cm，蛋白的平均親水系數(shù)為-1.210，不穩(wěn)定指數(shù)44.64，顯示該蛋白不穩(wěn)定。新疆山羊DRB1序列分子式為C426H626N124O129S2，預(yù)測(cè)分子量約為9 612.53 Da，理論等電點(diǎn)為6.13，由19種基本氨基酸組成，其中，精氨酸(Arg)含量最高，占氨基酸總數(shù)的12.5%，谷氨酸(Glu)其次，占10.0%；含有帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)13個(gè)，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)12個(gè)，280 nm 的摩爾消光系數(shù)為21 555 mol/cm，蛋白的平均親水系數(shù)為-0.945，不穩(wěn)定指數(shù)50.74，顯示該蛋白不穩(wěn)定。西藏山羊DRB1序列分子式為C423H628N128O129S2，預(yù)測(cè)分子量約為9 634.54 Da，理論等電點(diǎn)為5.56，由19種基本氨基酸組成，其中，精氨酸(Arg)含量最高，占氨基酸總數(shù)的13.8%，谷氨酸(Glu)其次，占11.2%；含有帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)15個(gè)，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)12個(gè)，280 nm 的摩爾消光系數(shù)為18 575 mol/cm，蛋白的平均親水系數(shù)為-0.954，不穩(wěn)定指數(shù)40.90，顯示該蛋白不穩(wěn)定。

表5 3個(gè)絨山羊品種DRB1基因序列的氨基酸組成

2.8.2 疏水性 利用ProtScale 對(duì)3個(gè)絨山羊品種DRB1氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測(cè)(圖2)。坐標(biāo)軸X軸正值，說(shuō)明此區(qū)域具有強(qiáng)疏水性；負(fù)值，說(shuō)明此區(qū)域?yàn)橛H水性?？梢?jiàn)，3個(gè)絨山羊品種DRB1編碼的蛋白總體表現(xiàn)出強(qiáng)的親水性。內(nèi)蒙古絨山羊DRB1序列第73位谷氨酸(Glu)疏水性最強(qiáng)(0.456)，第25位精氨酸(Arg)親水性最強(qiáng)(-2.211)，整個(gè)蛋白序列中，親水氨基酸占97.5%，疏水氨基酸占2.5%。新疆山羊DRB1序列第73位谷氨酸(Glu)疏水性最強(qiáng)(1.000)，第48位天冬酰胺(Asn)親水性最強(qiáng)(-2.167)，整個(gè)蛋白序列中，親水氨基酸占93.75%，疏水氨基酸占6.25%。西藏山羊DRB1序列第73位谷氨酸(Glu)疏水性最強(qiáng)(1.000)，第47位色氨酸(Ser)和第48位天冬酰胺(Asn)親水性最強(qiáng)(-2.333)，整個(gè)蛋白序列中，親水氨基酸占92.5%，疏水氨基酸占7.5%。

注：a為內(nèi)蒙古絨山羊，b為新疆山羊，c為西藏山羊。箭頭所指為疏水性/親水性最強(qiáng)的氨基酸。

2.8.3 信號(hào)肽 3個(gè)絨山羊品種DRB1氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示，該蛋白不存在信號(hào)肽序列。

2.8.4 磷酸化位點(diǎn) 由圖3可見(jiàn)，內(nèi)蒙古絨山羊DRB1氨基酸序列共有4個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)。新疆山羊DRB1氨基酸序列共有4個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。西藏山羊DRB1氨基酸序列共有3個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(得分均>0.5)。3個(gè)絨山羊品種DRB1氨基酸序列上磷酸化位點(diǎn)占比約10%，其中內(nèi)蒙古絨山羊最多，占13.75%。

注：T為蘇氨酸，S為絲氨酸，Y為酪氨酸。

2.8.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 3個(gè)絨山羊品種DRB1蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲組成(表6)，其中，主要以α-螺旋為主，其次是無(wú)規(guī)卷曲和延伸主鏈。利用Phyre2對(duì)3個(gè)絨山羊的DRB1蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)絨山羊品種DRB1蛋白三維結(jié)構(gòu)基本相同(圖4)，結(jié)構(gòu)中有較多的α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相吻合。

表6 3個(gè)絨山羊品種DRB1的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖4 絨山羊DRB1的三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討論

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)是脊椎動(dòng)物中與免疫相關(guān)的多基因家族，其蛋白產(chǎn)物負(fù)責(zé)識(shí)別和處理體內(nèi)存在的外來(lái)致病因子[19]。MHC由Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類基因組成，山羊MHC II類抗原可與細(xì)胞外經(jīng)加工后的抗原多肽結(jié)合，并將其提呈給表位特異性CD4+T淋巴細(xì)胞[20]，從而引起機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[21]。MHC是脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，肽結(jié)合區(qū)決定了MHC蛋白可以結(jié)合的外源肽片段種類，這些區(qū)域的多樣性增加MHC不同等位基因的基因產(chǎn)物和與不同抗原結(jié)合的可能性[22]，從而賦予動(dòng)物對(duì)某些抗原更大的易感性或抗性。已有研究發(fā)現(xiàn)，DRB基因在其他物種中均具有較高的多態(tài)性[23-24]，本研究發(fā)現(xiàn)，新疆山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和西藏山羊的DRB1序列具有非常高的遺傳多樣性，單倍型多樣度(Hd)均大于0.9，平均核苷酸多樣性大于0.02，根據(jù)GRANT等[25]的分類，3個(gè)絨山羊品種均具有高的單倍型多樣度(Hd>0.5)和核苷酸多樣性(Pi>0.005)；從核苷酸序列和氨基酸序列看，3個(gè)絨山羊品種檢出核苷酸多態(tài)位點(diǎn) 32個(gè)，氨基酸差異達(dá)21個(gè)，分別占總數(shù)的13.3%和26.25%，與陜北白絨山羊的研究相似[26]，說(shuō)明這3個(gè)絨山羊品種在進(jìn)化中產(chǎn)生了諸多突變，積累了豐富的單倍型和核苷酸變異，該物種對(duì)于變化的環(huán)境具有較強(qiáng)的生存能力。研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)絨山羊品種DRB1基因均受到較強(qiáng)的選擇壓力，其中，內(nèi)蒙古絨山羊和新疆山羊受到的選擇壓力更強(qiáng)，可能是由于長(zhǎng)期選育造成，2個(gè)品種是西北地區(qū)最主要的絨山羊品種，相對(duì)于西藏山羊來(lái)說(shuō)，在生產(chǎn)性能的選育提高上力度更大，這種選擇壓力可能有助于適應(yīng)當(dāng)?shù)睾?、風(fēng)沙等氣候環(huán)境。

遺傳分化指數(shù)Fst值為0～0.05，表明群體間的遺傳分化程度很?。粸?.05～0.15，表明群體間遺傳分化程度中等；為0.15～0.25，表明群體間的遺傳分化較大[27]。3個(gè)絨山羊品種總遺傳分化指數(shù)Fst為 0.181 24，大于0.15，表明3個(gè)品種間的遺傳分化較大，分子變異分析也表明，遺傳變異主要來(lái)自于品種間而非品種內(nèi)，與品種間遺傳分化程度較高的結(jié)論一致。張樂(lè)超等[28]對(duì)我國(guó)7個(gè)地方山羊品種遺傳結(jié)構(gòu)研究也發(fā)現(xiàn)，我國(guó)的山羊群體遺傳多樣性豐富，群體間遺傳分化程度大，基因交流少。

遺傳距離和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，新疆山羊先與內(nèi)蒙古絨山羊聚在一起，然后再與西藏山羊聚在一起，西藏山羊與其他2個(gè)品種遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。狄冉等[29]通過(guò)微衛(wèi)星將中國(guó)10個(gè)絨山羊品種進(jìn)行了分類，其中一類由遼寧絨山羊、新疆山羊、柴達(dá)木山羊及陜北山羊組成，另一類由內(nèi)蒙古絨山羊組成，與本研究基本一致。3個(gè)絨山羊品種與野山羊的親緣關(guān)系更近，而與其他4種國(guó)外山羊品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明我國(guó)的絨山羊可能是從野山羊馴化、選育而來(lái)。關(guān)于山羊起源研究的說(shuō)法較多，LUIKART等[30]認(rèn)為山羊主要存在3個(gè)起源。已有報(bào)道，西藏山羊部分支系起源于鐮刀型角野山羊(Capraaegagrus)和捻角山羊(Caprafalconeri)[31]，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。我國(guó)山羊絨品質(zhì)優(yōu)良，市場(chǎng)需求大，我國(guó)也是山羊絨的出口國(guó)，羊絨及制品主要出口到歐洲、美國(guó)、日本及東南亞國(guó)家。因此，在絨山羊遺傳資源上未與國(guó)外絨山羊進(jìn)行交流，具有明顯的地域性遺傳特征，與國(guó)外山羊在遺傳和起源上有明顯的區(qū)別。據(jù)MANJUNATH等[32]對(duì)印度10個(gè)山羊品種mtDNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，印度家養(yǎng)山羊?qū)儆谕粏蜗等?，與所有野生山羊序列不同，因此，印度山羊可能來(lái)自一個(gè)未知的種群。

生物信息學(xué)分析顯示，絨山羊DRB1基因第2外顯子編碼蛋白可判斷為酸性蛋白，具有強(qiáng)的親水性，無(wú)信號(hào)肽序列，有大量的磷酸化位點(diǎn)，可被不同的催化激酶引發(fā)磷酸化，這種磷酸化修飾可能使DRB1的構(gòu)象更穩(wěn)定，使其能很好地發(fā)揮生物學(xué)功能。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，絨山羊DRB1基因第2外顯子主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲組成。在蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，起穩(wěn)定蛋白作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)為α-螺旋和β-折疊，作為蛋白的骨架，不易變形，支撐著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，抗體難以嵌合，而無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)松散，則決定著蛋白質(zhì)的功能，很可能成為抗原表位[33-34]。抗原通過(guò)與淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合，從而激活淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。DRB1基因二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲比例也比較大，說(shuō)明抗原結(jié)合位點(diǎn)多，對(duì)抗原捕獲和呈遞強(qiáng)，這些結(jié)合位點(diǎn)是由基因編碼的且高度變化以調(diào)節(jié)結(jié)合位點(diǎn)的側(cè)鏈[35]，核苷酸序列的突變可能會(huì)改變編碼氨基酸，最終導(dǎo)致結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象變化，從而影響抗原的結(jié)合，引起動(dòng)物對(duì)疾病的抵抗力或敏感性改變。

4 結(jié)論

新疆山羊、內(nèi)蒙古絨山羊和西藏山羊3個(gè)絨山羊品種均具有豐富的遺傳多樣性，DRB1基因受到較強(qiáng)的選擇壓力，品種間遺傳分化程度較高，3個(gè)絨山羊品種與野山羊的親緣關(guān)系更近，表明3個(gè)絨山羊可能是從野山羊馴化、選育而來(lái)。絨山羊DRB1 基因第2外顯子編碼蛋白為酸性蛋白，具有強(qiáng)的親水性，無(wú)信號(hào)肽序列，有大量的磷酸化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲組成。