胡小霞 ，曾蘭 ，康健文 ，鄧鳳 ，朱書瑤 ，張曦 ，何翠

（1.蓬溪縣婦幼保健院，四川 蓬溪 629100；2.四川省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科，四川 成都 610031；3.四川省婦幼保健院兒科，四川 成都 610031）

0 引言

本研究聯(lián)合多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)和連鎖分析對2個均生育DMD患兒的家庭進(jìn)行基因診斷評估其致病因素，明確基因型，對高風(fēng)險胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷基因分析，并提供遺傳咨詢。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1號家庭先征者，男，8歲，G1P1，足月順產(chǎn)，圍生期無異常?；純鹤杂走\(yùn)動發(fā)育落后，2歲仍不會說話，自5歲開始出現(xiàn)不愿走路，走路步態(tài)異常，易摔倒，下蹲不易站起，從臥位站起困難，呈鴨子步態(tài)，好動，學(xué)習(xí)困難，智力測試：73分。查體：體型瘦小，雙側(cè)腓腸肌略肥大，四肢肌力Ⅳ級、肌張力弱，膝腱反射弱，Gower征(-)。輔助檢查：CK 6879.00U/L參考值(25.00~196.00U/L)。

患兒父母體健，非近親結(jié)婚，家族中無同類病史記載?；純耗赣H2020年8月在蓬溪縣婦幼保健院產(chǎn)檢，并且經(jīng)四川省婦幼保健院產(chǎn)前診斷科會診，建議做羊水DMD基因產(chǎn)前診斷，孕婦繼續(xù)妊娠足月順產(chǎn)。2021年11月先征者弟弟，1歲，因發(fā)熱就診，輔助檢查發(fā)現(xiàn)：CK 4648.00U/L參考值(25.00~196.00U/L)。查體：四肢肌張力正常，可扶站，生后至今兒保體檢運(yùn)動發(fā)育無落后，神經(jīng)系統(tǒng)無陽性體征。

2號家庭孕婦，32歲，自訴曾生育一患兒，雙側(cè)腓腸肌肥大，走路步態(tài)異常，易摔倒，輔助檢查CK明顯高于參考值。2021年12月經(jīng)四川省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科遺傳咨詢，建議孕婦做DMD基因檢測，并且同時做羊水DMD基因產(chǎn)前診斷分析。

1.2 方法

1.2.1 外周血采集

在簽署知情同意書后，取患兒及其母親外周血2mL，乙二胺四乙酸鈉(EDTA)抗凝。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 羊水樣本采集

術(shù)前對受檢孕婦進(jìn)行遺傳咨詢，孕婦及家屬簽署知情同意書。嚴(yán)格無菌消毒，在B超定位引導(dǎo)下，經(jīng)腹壁進(jìn)行羊膜腔穿刺，棄去最初的2mL羊水后再抽出羊水10mL。

“教師的語言修養(yǎng)在極大的程度上決定著學(xué)生在課堂上的腦力勞動的效率。我們深信，高度的語言修養(yǎng)是合理利用時間的重要條件。”這句話來自于蘇聯(lián)蘇霍姆林斯基。好的語言表達(dá)能力，能夠讓教師自如地在課堂上表達(dá)自己的觀點(diǎn)想法，自如地與學(xué)生的交流溝通。

1.3 基因組DNA提取

采用先征者、家屬的外周血樣本及羊水樣本，采用天根生化科技股份有限公司DNA純化試劑盒提取外周血和羊水DNA，包括標(biāo)本裂解、蛋白沉淀、過柱、兩次洗滌、DNA洗脫，最后取部分DNA樣本用紫外分光光度儀進(jìn)行定量和純度檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 羊水標(biāo)本母體污染檢測

采用廣州達(dá)瑞非整倍體試劑盒擴(kuò)增孕婦及其羊水標(biāo)本 DNA，檢測胎兒標(biāo)本是否含有母體成分，以確保結(jié)果準(zhǔn)確性。

1.5 MLPA檢測分析

MLPA技術(shù)是檢測DMD基因缺失/重復(fù)突變的主要方法[3-4]。

對DMD家系患者及其母親DMD基因79個外顯子進(jìn)行缺失或重復(fù)分析，具體參考文獻(xiàn)[5]。采用MLPA試劑盒（MRC Holland)SALSA P034、P035檢測標(biāo)本DMD基因79個外顯子缺失或重復(fù)情況，按照試劑說明書進(jìn)行變性、雜交、連接和擴(kuò)增，產(chǎn)物在ABI3130分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，數(shù)據(jù)采用 Coffffalyser軟件分析。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：對應(yīng)峰值在 0.7~1.3提示拷貝數(shù)正常，0.3~0.7提示雜合性缺失，1.3~1.7提示雜合性重復(fù)，0提示純合缺失，1.7~2.3提示重復(fù)突變[6]。

1.6 連鎖分析

選用DMD基因內(nèi)STRMP、STR44、STR49結(jié)合AMEL四個位點(diǎn)進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列STR多態(tài)位點(diǎn)連鎖分析，判斷胎兒是否與先征者相同基因型。

1.7 隨訪

每半年通過電話進(jìn)行隨訪。

2 結(jié)果

2.1 1號家庭

先征者，在DMD基因（NM_004006.2）上存在10~44號外顯子缺失，該變異是缺失突變，母親為攜帶，其羊水產(chǎn)前診斷男性胎兒存在同樣的致病性突變10~44號外顯子缺失。（圖1）

圖1 1號家庭先征者10~44號外顯子缺失圖

2.2 2號家庭

孕婦，羊水DMD基因外顯子45號雜合缺失突變，孕婦本人攜帶DMD基因外顯子45號缺失。孕婦曾生育患兒已死亡，現(xiàn)在無法獲得其樣本（圖2/圖3）。應(yīng)用STR位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，攜帶致病基因突變的孕婦，可以通過STR位點(diǎn)來判斷胎兒的性別和攜帶的單體型，輔助基因診斷結(jié)果。結(jié)果提示，致病突變胎兒與先征者具有相同單體型。

圖2 2號家庭孕婦羊水DMD基因外顯子45缺失突變圖

圖3 2號家庭孕婦羊水DMD基因外顯子45缺失突變圖

3 討論

DMD是由于DMD基因突變導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白結(jié)構(gòu)和功能改變所致。該基因位于Xp21.2，是人類最大的基因之一，共79個外顯子，包含3685個氨基酸，組成位于肌細(xì)胞質(zhì)膜面的抗肌萎縮蛋白(dystrophin)，其能增強(qiáng)肌纖維強(qiáng)度、穩(wěn)定性和功能。基因突變導(dǎo)致患者抗肌萎縮蛋白表達(dá)缺陷或功能喪失，造成肌纖維不穩(wěn)，導(dǎo)致細(xì)胞膜不穩(wěn)定[8]，細(xì)胞內(nèi)的肌酸激酶等外漏，肌細(xì)胞壞死，導(dǎo)致脂肪組織和纖維結(jié)締組織增生，最終造成肌纖維的變性和壞死，從而出現(xiàn)肢體近端骨骼肌進(jìn)行性萎縮、無力等臨床表現(xiàn)。基因突變是否會破壞閱讀框結(jié)構(gòu)決定了患者病情的嚴(yán)重程度，因此對DMD基因突變的檢測是控制和降低DMD發(fā)病率的關(guān)鍵。

DMD基因的突變類型三種類型：外顯子缺失或重復(fù)突變、點(diǎn)突變（包括堿基的置換、重復(fù)、缺失或插入）和剪切區(qū)突變，以外顯子缺失或重復(fù)為主[9]。約60.2%出現(xiàn)一個或多個大片段缺失，最常見的缺失區(qū)為第3~22外顯子區(qū)及第45~54外顯子[10]；本研究1號家庭，先征者存在10~44號外顯子缺失，該變異是缺失突變，在部分熱點(diǎn)區(qū)域里，與文獻(xiàn)報道的一致。研究發(fā)現(xiàn)，中國人群中最普遍的單外顯子缺失為45號和51號[12]。本研究的2號家庭，孕婦本人和羊水胎兒均為DMD基因外顯子45號雜合缺失突變，這與文獻(xiàn)報道基本一致。

MLPA基因檢測技術(shù)作為一種靈敏度較高的相對定量技術(shù)，可準(zhǔn)確、快速地檢測DMD基因外顯子的缺失或重復(fù)突變，但無法檢測染色體的平衡易位及非探針覆蓋范圍的微小突變。而針對基因內(nèi)部外顯子和側(cè)翼區(qū)域點(diǎn)突變，常用的方法為Sanger測序，應(yīng)用于DMD基因點(diǎn)突變檢測成本高，耗時長。值得注意的是，綜合應(yīng)用MLPA和基因測序，仍有約6.9%的患者找不到致病基因[13]。應(yīng)考慮以下可能性：（1）突變位于內(nèi)含子深處或表達(dá)調(diào)控區(qū)；（2）患者臨床診斷不準(zhǔn)確，需重新進(jìn)行評估，必要時因進(jìn)行肌肉活檢。

DMD的風(fēng)險評估和預(yù)防很重要。遺傳方式?jīng)Q定患者的父親通常不是攜帶者，不會有癥狀，患者的母親通常是攜帶者。對于既往生育過DMD患兒的婦女或女性攜帶者，其生育DMD男性的風(fēng)險為25%[14]。因此，需對該孕婦進(jìn)行絨毛活檢術(shù)取胎兒樣本或羊水穿刺取羊水進(jìn)行DMD基因診斷，可以根據(jù)男性胎兒樣本在DMD基因上是否攜帶與母親同樣致病的突變，來推測胎兒患病風(fēng)險。值得注意的是，如果未發(fā)現(xiàn)母親攜帶與患者相同致病變異，其仍有可能由于生殖腺嵌合再次生育患病的后代，因此再次生育時均應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

對于DMD的診斷主要依靠典型的臨床表現(xiàn)、肌肉活檢以及其他相關(guān)檢查，最終的確診需要DMD基因的檢測結(jié)果。

DMD的治療主要是多學(xué)科的對癥治療，包括藥物治療、康復(fù)治療、呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥治療等，基于中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會的指南，目前DMD患者尚無治愈方法，因此基因治療已經(jīng)引起國際上的重視，但目前我國尚無獲批的DMD基因治療藥物，主要依靠激素類藥物。

綜上所述，由于DMD男性患者常在3～5歲間發(fā)病，嬰兒期無臨床癥狀，女性攜帶者大部分無癥狀，極易出現(xiàn)漏診。然而早期診斷與明確患者的致病基因，對于最終診斷、治療以及提供進(jìn)一步的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢至關(guān)重要[15]，從而提高出生人口的質(zhì)量。