王雪偉 歐承剛 黃建新 劉星 郝衛(wèi)東 趙志偉 孔小平 莊飛云*

〔1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司，北京 100081；3 西寧市蔬菜技術(shù)服務(wù)中心，青海西寧 810016〕

胡蘿卜（DaucuscarrotL.）屬于傘形科胡蘿卜屬兩年生草本植物，富含α、β-胡蘿卜素，是人類維生素A 的主要來源（方智遠(yuǎn)，2017）。胡蘿卜種子為不規(guī)則小粒種子，多為長扁形，外表有細(xì)小毛刺，流動(dòng)性差，種子胚小，頂土能力弱（楊亮等，2021）。胡蘿卜種子生產(chǎn)方式主要有兩種：一種是種子—種子，即種子前一年播種并露地過冬，翌年抽薹開花收種；另一種是根—種子，即種子前一年播下后收取肉質(zhì)根越冬貯藏，翌年種植肉質(zhì)根后抽薹開花收種（Rubatzky et al.，1999；方智遠(yuǎn)，2017）。目前胡蘿卜規(guī)模化種植基地基本都采用精量化播種方式，如種繩、丸?；龋瑢ΨN子質(zhì)量提出了較高的要求。除了發(fā)芽率，種子形狀、大小和千粒重等都會(huì)影響胡蘿卜播種及出苗的整齊度和一致性，但目前尚無胡蘿卜種子粒形和千粒重的遺傳研究報(bào)道。

在小麥、水稻、玉米中的研究表明種子相關(guān)性狀為多基因控制的數(shù)量性狀，已鑒定到多個(gè)與之相關(guān)的主效QTL 位點(diǎn)。Feng 等（2021）采用F2和F2∶3群體，對水稻粒長、粒寬、粒長寬比、粒厚和千粒重5 個(gè)粒形性狀進(jìn)行QTL 定位，共鑒定出分布在1、2、3、6、7、8 號染色體上的12 個(gè)相關(guān)QTL，在7 號染色體上還存在1 個(gè)F2和F2∶3群體重疊區(qū)間，表型貢獻(xiàn)率在15.09%～16.30%之間；Kumari 等（2018）選擇了1 個(gè)含有106 個(gè)株系的RIL 群體對小麥粒長、粒寬、粒長寬比、千粒重和粒周長進(jìn)行QTL 定位，發(fā)現(xiàn)了13 個(gè)分布在1A、2B、4A、5A、6A、7A、7D 染色體上的QTL，表型貢獻(xiàn)率在7.66%～63.66%之間；Wang 等（2020）通過不同環(huán)境下培育F2及其F2∶3群體，探尋控制玉米粒長（KL）、粒寬（KW）的穩(wěn)定QTL，最終在3 種不同環(huán)境中定位到2 個(gè)穩(wěn)定QTL（qKW-1和qKL-2）。由于粒形不僅影響種子產(chǎn)量，也影響出苗和發(fā)育，多項(xiàng)對甘藍(lán)型油菜種子粒形和粒重的QTL 定位研究紛紛展開。Quijada 等（2006）利用種植在兩個(gè)不同環(huán)境中的DH 群體定位到3 個(gè)與粒重相關(guān)QTL 位點(diǎn)；Zhao 等（2016）對8 個(gè)不同環(huán)境中種植的DH 群體進(jìn)行粒形和粒重的QTL 定位，鑒定到25 個(gè)相關(guān)QTL，并且在A7 和C1 染色體上均存在重疊區(qū)間，表型貢獻(xiàn)率均大于10%。隨著多個(gè)QTL 位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，已成功克隆與粒形性狀相關(guān)的基因逾100 個(gè)，如GW2（控制粒寬和千粒重）（Song et al.，2007）、GS3（控制粒長）（Fan et al.，2006）、BSG1（控制粒長和粒厚）（Yan et al.，2013）、GL4（控制粒長）（Wu et al.，2017）和GW5（控制粒寬）（Liu et al.，2017）等。通過對基因結(jié)構(gòu)和分子特性研究發(fā)現(xiàn)這些基因主要通過泛素-蛋白酶體途徑、IKU 途徑、G-蛋白信號途徑、MAPK 途徑、植物激素途徑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子途徑或者其他途徑來調(diào)控種子粒形和千粒重（Li &Li，2016）。本試驗(yàn)基于前期構(gòu)建的回交重組自交系（backcross inbred line，BIL），對胡蘿卜種子粒長、粒寬、長寬比和千粒重進(jìn)行遺傳分析，基于胡蘿卜全基因組測序構(gòu)建的高密度遺傳圖譜進(jìn)行相關(guān)性狀QTL 定位，旨在為最終克隆粒形和千粒重的遺傳調(diào)控基因奠定基礎(chǔ)，也為胡蘿卜種子性狀的改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所胡蘿卜課題組前期以親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的白色胡蘿卜品種松滋野生（Ws）和橘色栽培品種Amsterdam（Af）為親本進(jìn)行雜交，以Af 為輪回親本，經(jīng)2 代回交，再單株自交6 代，得到了包含200 個(gè)株系的BIL 群體（BC2S6）。2019 年8 月上旬在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南口農(nóng)場進(jìn)行露地播種，11 月初采收，每個(gè)BIL 株系隨機(jī)選取20 個(gè)肉質(zhì)根越冬貯藏，2020 年3 月種植春化后的肉質(zhì)根，5 月進(jìn)行自交授粉，7 月收獲各株系種子進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 性狀測量與數(shù)據(jù)分析

從BIL 群體中隨機(jī)選取110 個(gè)株系，每個(gè)株系隨機(jī)選取30 粒種子，使用ImageJ 軟件進(jìn)行粒長和粒寬的測定，并計(jì)算長寬比，3 次重復(fù)，取平均值作為該性狀表型值；每個(gè)株系隨機(jī)選取1 000 粒種子，使用萬分之一天平稱重，3 次重復(fù)，取平均值作為千粒重。使用SPSS 22 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)和相關(guān)性分析。

1.3 遺傳圖譜構(gòu)建及QTL 定位

在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所胡蘿卜課題組前期構(gòu)建BIL 群體的遺傳圖譜基礎(chǔ)上（Ou et al.，2022），利 用Windows QTL Cartographer（WinQTL）v2.5 軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法（CIM）（Wang et al.，2011），95%置信區(qū)間在全基因組范圍內(nèi)檢測種子粒長、粒寬、長寬比和千粒重的QTL，QTL 命名遵照McCouch（2008）建議的規(guī)則命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜種子粒形與千粒重的表型分析

從表1 可以看出，親本W(wǎng)s 種子粒長為2.37 mm，粒寬為1.35 mm，長寬比為1.76，千粒重為1.10 g；Af 粒長為2.67 mm，粒寬為1.43 mm，長寬比為1.87，千粒重為1.61 g；兩親本種子粒長、粒寬、長寬比和千粒重差值分別為0.30 mm、0.08 mm、0.11 和0.51 g。BIL 群體種子粒長平均值3.05 mm，變異范圍為2.09～4.26 mm；粒寬平均值1.54 mm，變異范圍為0.97～2.20 mm；長寬比平均值1.99，變異范圍為1.30～2.64；千粒重平均值1.96 g，變異范圍為0.68～3.63 g。

表1 胡蘿卜親本、BIL 群體種子粒形性狀表型分布

從BIL 群體種子粒長、粒寬、長寬比和千粒重的頻次分布結(jié)果可知（圖1），這4 個(gè)與胡蘿卜種子粒形相關(guān)的性狀均呈偏正態(tài)分布，可進(jìn)行QTL定位以及作圖。

圖1 胡蘿卜BIL 群體種子粒長、粒寬、長寬比、千粒重頻次分布

2.2 胡蘿卜種子粒形與千粒重的相關(guān)性分析

對胡蘿卜BIL 群體種子粒長、粒寬、長寬比和千粒重等4 個(gè)性狀進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明（表2），千粒重與粒長和粒寬均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.661 和0.715；粒長與粒寬亦呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.659；長寬比與粒長呈極顯著正相關(guān)，與粒寬呈極顯著負(fù)相關(guān)，但與千粒重不相關(guān)。

表2 胡蘿卜BIL 群體種子粒形性狀的相關(guān)性分析結(jié)果

2.3 胡蘿卜種子粒形與千粒重的QTL 分析

對胡蘿卜BIL 群體種子粒長、粒寬、長寬比和千粒重進(jìn)行QTL 分析，共獲得6 個(gè)QTL 位點(diǎn)（表3）。3 個(gè)粒長QTL 分別位于8、9 號染色體上，LOD 值分別為2.61、2.72 和2.89，表型貢獻(xiàn)率分別為12.0%、9.7%和9.6%，命名為qGL8、qGL9-1 和qGL9-2；粒寬QTL 有1 個(gè)，位于8 號染色體上，LOD 值為2.68，表型貢獻(xiàn)率為11.0%，命名為qGW8；千粒重QTL 有2 個(gè)，分別位于1、9 號染色體上，LOD 值分別為5.54 和4.02，表型貢獻(xiàn)率分別為18.3%和8.8%，命名為qTGW1 和qTGW9；沒有得到與長寬比相關(guān)的QTL 位點(diǎn)。

表3 胡蘿卜BIL 群體種子粒形相關(guān)性狀的QTL 定位

2.4 候選基因分析

通過定位共得到6 個(gè)QTL 位點(diǎn)，基于胡蘿卜參考基因組注釋信息（Iorizzo et al.，2016），共在顯著候選區(qū)間內(nèi)檢索到399 個(gè)具有功能注釋的基因，其中10 個(gè)可能與種子粒長、粒寬和千粒重相關(guān)（表4）。qGL8 位點(diǎn)鑒定到2 個(gè)可能參與調(diào)控粒長的基因，LOC108199762是編碼富含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因，作為脫落酸（ABA）信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)ABA 依賴性基因的表達(dá)來調(diào)控種子長短（Pernas et al.，2007）；LOC108198581主要通過引導(dǎo)花粉管的生長來影響種子的大?。╓ang et al.，2016）。qGW8 位點(diǎn)鑒定到1 個(gè)可能參與調(diào)控粒寬的基因，LOC108199012是AP2 基因家族轉(zhuǎn)錄因子，AP2 控制胚乳的發(fā)育，擬南芥中ap2突變體種子比野生種子更大（Ohto et al.，2009）。qTGW1位點(diǎn)鑒定到7個(gè)可能參與調(diào)控千粒重的基因，LOC108203830和LOC108226269主要編碼E3 泛素連接酶，通過作用于不同受體蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和防御機(jī)制來控制種子大小（Marino et al.，2013；Xia et al.，2013）；LOC108226660主要編碼G-蛋白，作為調(diào)節(jié)劑或轉(zhuǎn)導(dǎo)劑參與各種跨膜信號系統(tǒng)，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖來調(diào)節(jié)種子大?。∕udgil et al.，2009）；LOC108212357和LOC108226394與ARF 有關(guān)，ARF 是一種多效性發(fā)育調(diào)節(jié)劑，通過限制種子珠被中的細(xì)胞增殖來控制種子大?。⊿chruff et al.，2006）；LOC108205141編碼富含絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，負(fù)調(diào)控ABA（Pernas et al.，2007）。LOC108208217編碼MYB 轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)雄蕊的發(fā)育以響應(yīng)茉莉酸信號傳導(dǎo)，負(fù)調(diào)節(jié)ABA（Cui et al.，2013）。

表4 胡蘿卜種子粒形相關(guān)性狀QTL 位點(diǎn)顯著區(qū)間內(nèi)相關(guān)預(yù)測基因

3 討論與結(jié)論

出苗率高、一致性好是胡蘿卜獲得高產(chǎn)和優(yōu)良商品性的前提和基礎(chǔ)。為節(jié)省勞動(dòng)力和種子成本，目前規(guī)?；}卜種植基地基本都采用精量化播種方式，例如使用種繩或進(jìn)行丸?；?，這便對胡蘿卜種子的發(fā)芽率和萌發(fā)一致性提出了更高的要求。因此，明確胡蘿卜種子相關(guān)性狀的遺傳調(diào)控機(jī)理，不僅是對種子性狀進(jìn)行遺傳改良的理論基礎(chǔ)，更對建立規(guī)范化的胡蘿卜種子繁育與加工體系具有十分重要的意義。本試驗(yàn)中，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的2 個(gè)親本松滋野生（Ws）和Amsterdam（Af）種子粒長和粒寬差異較小，但是千粒重存在較大差異。BIL 群體在種子粒長、粒寬、長寬比和千粒重中均表現(xiàn)出較大分離，特別是粒長和千粒重變異較大，分別為2.09～4.26 mm 和0.68～3.63 g；相關(guān)性分析表明粒長、粒寬與千粒重兩兩之間均呈極顯著正相關(guān)，長寬比與粒長呈極顯著正相關(guān)、與粒寬呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明粒長和粒寬均能夠影響千粒重，這與在小麥和水稻中的研究結(jié)果相似（Kumari et al.，2018；Xue et al.，2019）。因此，在對胡蘿卜種子性狀進(jìn)行改良時(shí)，也要注意粒長、粒寬與千粒重之間要協(xié)同改良。

種子粒形相關(guān)性狀均為數(shù)量性狀，受多基因控制（Xing &Zhang，2010；Huang et al.，2013），目前在胡蘿卜種子粒形與千粒重的QTL 分析方面幾乎空白。申琪等（2018）利用與本試驗(yàn)相同的遺傳圖譜，對胡蘿卜BIL 群體的始花期、主薹高和單株種子量進(jìn)行QTL 分析，分別得到2、4、2 個(gè)相關(guān)QTL 位點(diǎn)，表型貢獻(xiàn)率在14.6%～23.8%之間。本試驗(yàn)繼續(xù)對該群體的種子粒長、粒寬和千粒重進(jìn)行QTL 分析，獲得了3、1、2 個(gè)相關(guān)QTL 位點(diǎn)，表型貢獻(xiàn)率在8.8%～18.3%之間，每個(gè)性狀之間沒有位點(diǎn)重疊，說明胡蘿卜種子粒形和千粒重性狀是獨(dú)立遺傳的。這是首次對胡蘿卜種子粒形和千粒重進(jìn)行遺傳分析和QTL 定位，不僅為后續(xù)進(jìn)行精細(xì)定位和挖掘功能基因奠定了理論基礎(chǔ)，還可以更加有效的借助分子標(biāo)記技術(shù)對胡蘿卜種子粒形和千粒重進(jìn)行改良，改善種子質(zhì)量。

Li 和Li（2016）將已克隆出來的與種子性狀相關(guān)基因劃分為6 種途徑：IKU 途徑、泛素-蛋白酶體途徑、G-蛋白信號途徑、MAPK 途徑、植物激素途徑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子途徑，包括控制水稻粒寬和千粒重的基因GW2（Song et al.，2007）、控制水稻粒長的基因GS3（Fan et al.，2006）、控制水稻粒長和粒厚的基因BSG1（Yan et al.，2013）、控制玉米千粒重的基因GRMZM2G039934（Chen et al.，2013）、控制小麥粒寬和千粒重的基因TaDA1（Liu et al.，2020）等。本試驗(yàn)通過對顯著區(qū)間進(jìn)行候選基因篩選，檢索到參與其中4 種調(diào)控途徑上的9 個(gè)基因和其他因素引起的1 個(gè)基因。泛素化在影響種子大小方面起著重要的作用（Song et al.，2007；申琪 等，2018）。在水稻中，已經(jīng)被克隆的GW5、GW2均是編碼E3 泛素連接酶的基因，通過正向和反向調(diào)節(jié)種子粒寬和粒重來調(diào)控種子大?。╔ia et al.，2013；Choi et al.，2018）。本試驗(yàn)鑒定到的LOC108203830和LOC108226269為主要編碼E3 泛素連接酶的基因，推測可能與種子千粒重有關(guān)。LOC108226660是一個(gè)編碼G-蛋白β 亞基的基因，G-蛋白信號是一個(gè)保守的分子信號，參與多個(gè)信號調(diào)控通路，包括G-蛋白α 亞基、β 亞基和γ 亞基（Mudgil et al.，2009）。在擬南芥中，α 亞基和β 亞基參與花發(fā)育的調(diào)控，γ 亞基控制花芽、角果的發(fā)育及籽粒大小（Chakravorty et al.，2011；Li et al.，2012）。在水稻中發(fā)現(xiàn)β 亞基表達(dá)量降低也會(huì)引起籽粒變?。║rano et al.，2016）。因此LOC108226660可能與胡蘿卜種子大小有關(guān)。LOC108199762和LOC108205141編碼富含絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，是ABA 信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)劑，但LOC108199762通過調(diào)節(jié)ABA 依賴性基因的表達(dá)來控制種子粒長，而LOC108205141通過負(fù)調(diào)控ABA，影響花粉發(fā)育來控制種子千粒 重（Pernas et al.，2007）；LOC108212357和LOC108226394與多效性發(fā)育調(diào)節(jié)劑ARF 有關(guān)，通過限制種子珠被中的細(xì)胞增殖來控制種子大?。⊿chruff et al.，2006）。ABA 是通過影響細(xì)胞增殖和擴(kuò)張來調(diào)節(jié)籽粒大小的重要因素（Krishnan &Dayanandan，2003）。LOC108199012為AP2基因家族轉(zhuǎn)錄因子，AP2 控制胚乳的發(fā)育，在擬南芥中ap2突變體的種子比野生種子更大（Ohto et al.，2009）；LOC108208217編碼MYB 轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)雄蕊的發(fā)育以響應(yīng)茉莉酸信號傳導(dǎo)，負(fù)調(diào)節(jié)ABA（Cui et al.，2013）。轉(zhuǎn)錄因子也被稱作基因表達(dá)調(diào)控因子，不僅參與植物細(xì)胞中的反應(yīng)，在控制種子大小方面也有一定影響（Xiao et al.，2006；Chae et al.，2008；Ramamoorthy et al.，2008；Sun et al.，2010）。此外，本試驗(yàn)還得到1 個(gè)主要通過引導(dǎo)花粉管的生長來影響種子大小的基因LOC108198581。這些基因通過不同途徑對胡蘿卜種子粒形和千粒重起著不同程度的作用，是后續(xù)基因功能研究的候選基因。