高金會,王 然,宋 振,鄆玲玲,付衛(wèi)東,王忠輝,馬 濤,王 伊,張國良
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所,北京 100081
少花蒺藜草CenchrusspinifexCav.為禾本科Poaceae蒺藜草屬Cenchrus一年生草本植物,原產(chǎn)北美洲及熱帶沿海地區(qū)(高曉萍和楊旋,2008),我國于20世紀30年代首次發(fā)現(xiàn),現(xiàn)主要分布在遼寧、內(nèi)蒙古、吉林等省(自治區(qū))(徐軍,2011)。少花蒺藜草具有高抗逆性、高繁殖力、傳播途徑多樣和高侵染力等特點,適應(yīng)能力極強,可在短時間內(nèi)形成單一優(yōu)勢群落,降低草場生物多樣性,加劇土壤沙化;其刺苞表面密被許多小刺,會對人及牲畜造成傷害,影響農(nóng)牧生產(chǎn)(杜廣明等,1995;高曉萍和楊旋,2018)。
外來入侵植物定殖成功后,迅速形成單優(yōu)群落,降低本地生態(tài)系統(tǒng)的群落多樣性(Bajwaetal.,2016)。入侵植物與土壤微生物之間的互作在其定殖、擴散過程中發(fā)揮重要作用(Wardleetal.,2004)。研究表明,外來入侵植物能夠改變?nèi)肭值赜袡C質(zhì)、氮磷鉀等養(yǎng)分含量(薛敬意等,2002;Wangetal.,2018),同時影響土壤的微生物群落組成(祁小旭等,2019;Battenetal.,2006),如糖蜜草MelinisminutifloraP.Beauv.(Ribeiroetal.,2017)、紫莖澤蘭Ageratinaadenophora(Spreng.) R.M.King et H.Rob.(戴蓮等,2012;于文清等,2014;Niuetal.,2007)、加拿大一枝黃花SolidagocanadensisL.(周振榮,2010;Wangetal.,2018)。研究表明,根際解鉀菌數(shù)量較為豐富,且大多具有較高解鉀活性,可能對其鉀富集具有重要貢獻(閆雅楠等,2019)。黃頂菊Flaveriabidentis(L.) Kuntze.入侵后土壤中有效磷的含量降低(Huangetal.,2015;Shaheen,2015),并且可顯著增加解磷細菌的數(shù)量(紀巧鳳,2014)。rep-PCR結(jié)果顯示,與萬壽菊TageteserectaL.對比,黃頂菊顯著增加了入侵地根際解有機磷細菌、解無機磷細菌的數(shù)量(宋振等,2016)。
少花蒺藜草具有化感作用,其根系及根際土壤水提液對馬唐Digitariasanguinalis(L.) Scop.胚根生長均表現(xiàn)高濃度抑制、低濃度促進作用(王坤芳等,2017),從而利于自身生長。目前,對少花蒺藜草入侵影響土壤養(yǎng)分的研究已有報道,如少花蒺藜草入侵可使土壤中的有機質(zhì)及速效養(yǎng)分含量隨著生長期的變化有不同程度的下降,與小葉楊PopulussimoniiCarr.和黃柳SalixgordejeviiY.L.Chang et Skv.相比,少花蒺藜草入侵降低了土壤有機質(zhì)、速效磷含量(周立業(yè)等,2014),但對少花蒺藜草對土壤磷元素高效吸收利用機制的研究尚未見報道。本研究采用高通量測序技術(shù),分析了少花蒺藜草與冰草Agropyroncristatum(L.) Gaertn.、狗尾草Setariaviridis(L.) Beauv.根際土壤及空白對照土壤中解磷菌的組成差異以及與環(huán)境因子之間的關(guān)系,研究了少花蒺藜草入侵對根際土壤解磷菌的影響,以期為揭示其入侵機制提供理論依據(jù)。
1.1.1 試驗種子 少花蒺藜草種子于種子成熟期采于遼寧省彰武縣阿爾鄉(xiāng)白音花農(nóng)場,冰草、狗尾草種子購于北京金土地農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所種子銷售處。挑取健康飽滿的種子,用2%NaClO溶液消毒10 min后,用蒸餾水反復(fù)沖洗至澄清,室內(nèi)晾干,供后續(xù)試驗使用。
1.1.2 試驗用土 供試土壤取自少花蒺藜草的發(fā)生地遼寧省彰武縣阿爾鄉(xiāng)白音花農(nóng)場,去除雜草等雜物,去除表層2 cm土層,采集2~10 cm土壤帶回實驗室,過2 mm篩,作為后期盆栽用土。
以上述土壤為基質(zhì),將種子播于花盆(花盆大小23 cm×18.4 cm)內(nèi),設(shè)置4個處理:分別種植少花蒺藜草、冰草、狗尾草和空白對照(裸土),每個處理5個重復(fù)。出苗后間苗處理,每盆保留10株健康植株,其間保持培養(yǎng)條件一致,室內(nèi)溫度10~30 ℃,光照度10~25 klx,濕度30%~60%。培養(yǎng)50 d后采集土壤樣本,去掉表層土壤(3 cm左右),采用抖根法獲得植物根際土壤樣本。
參照鮑士旦(2000)測定土壤pH(電極法)、有機質(zhì)(重鉻酸鉀容量法)、全氮(半微量開氏法)、全磷(碳酸氫鈉鉬藍法)、全鉀(火焰光度法)、速效磷(碳酸氫鈉法)、速效鉀(聯(lián)合浸提-比色法)等理化指標。土壤磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法測定(邢培茹,2014)。
1.4.1 土壤DNA的提取 采用土壤基因組DNA提取試劑盒(北京,Solarbio公司)提取土壤樣品總基因組DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳及超微量紫外分光光度法檢測DNA純度。
1.4.2 PCR擴增 按指定測序區(qū)域,合成帶有barcode的特異引物,或合成帶有錯位堿基的融合引物。采用TransGen AP221-02 PCR反應(yīng)體系:TransStart Fastpfu DNA Polymerase 20 μL,DNA模板10 ng,上、下游引物(5 μmol·L-1)各0.4 μL,dNTP(2.5 mmol·L-1) 2 μL,F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL,5×FastPfu buffer 4 μL,補充ddH2O至20 μL。PCR擴增程序:95 ℃預(yù)變性 2 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個循環(huán);最后于72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。每個樣品3個重復(fù),將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。
1.4.3 Miseq文庫構(gòu)建 連接“Y”字形接頭;使用磁珠篩選去除接頭自連片段;利用PCR擴增進行文庫模板的富集;氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段。
1.4.4 Miseq上機測序 DNA片段的一端與引物堿基互補,固定在芯片上;另一端隨機與附近的另外一個引物互補,也被固定住,形成“橋(bridge)”;PCR擴增,產(chǎn)生DNA簇;DNA擴增子線性化成為單鏈;加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP,每次循環(huán)只合成一個堿基;用激光掃描反應(yīng)板表面,讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類;將“熒光基團”和“終止基團”化學(xué)切割,恢復(fù)3′端黏性,繼續(xù)聚合第二個核苷酸;統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果,獲知模板DNA片段的序列。
采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素(one-way ANOVA)和Duncan法進行方差分析和多重比較(α=0.05)。
Miseq測序得到的PE reads先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接,同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾。由于不同樣本間的reads數(shù)不同,因此在分析多樣性和群落組成前,先依據(jù)最低reads數(shù)進行標準化。區(qū)分樣品后進行OTU (operational taxonomic unit)聚類分析和物種分類學(xué)分析,基于OTU進行物種多樣性指數(shù)分析?;诜诸悓W(xué)信息,在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。在上述分析的基礎(chǔ)上,進行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等的統(tǒng)計學(xué)和可視化分析。使用FLASH v 1.2.7對下機數(shù)據(jù)進行拼接,得到OTUs數(shù)據(jù)(raw tags),利用Trimmomatic (v 0.33)對Raw Tags質(zhì)控過濾,得到clean tgs,進行數(shù)據(jù)分析?;?7%相似度,利用Qiime (version 1.8.0)在Silva數(shù)據(jù)庫進行OTU物種分類學(xué)分析和聚類分析(uparse聚類法)。Chao 1指數(shù)為土壤細菌群落豐富度指標,用以估計群落中OTU數(shù)目,Chao1指數(shù)越小群落豐富度越高(Chao,1984),Shannon指數(shù)為用來估算樣品中細菌群落多樣性指標,Shannon值越大群落多樣性越高(Shannon,1948)。利用Qiime (version 1.8.0)對Chao1和Shannon指數(shù)進行分析Alpha多樣性,用t檢驗分析Alpha多樣性指數(shù)差異,然后用R作圖;利用柱形圖表示細菌群落組成;PCA分析 (principal component analysis),即主成分分析,通過分析不同樣本群落組成可以反映樣本間的差異和距離,可以有效地找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu),樣本組成越相似,在PCA圖中的距離越近;各樣本差異物種組成通過one-way ANOVA單因素方差分析,先使用LEfSe軟件non-parametric factorial Kruskal-Wallis (KW) sum-ranktest(非參數(shù)因子克魯斯卡爾-沃利斯秩和驗檢)檢測顯著豐度差異特征,并找到與豐度有顯著性差異的類群,然后采用線性判別分析(LDA)來估算每個組分(物種)豐度對差異效果影響的大小;通過RDA (redundancy analysis)分析,可以明確植物根際解磷細菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系,利用Canoco軟件作圖。
試驗土壤的基本理化性質(zhì):pH8.5、全氮含量0.016%、全磷含量0.002%、全鉀含量2.52%、有機質(zhì)含量5.4 g·kg-1、有效磷含量7.58 mg·kg-1、速效鉀含量63.2 mg·kg-1。
各處理土壤理化性質(zhì)指標如表1所示。結(jié)果顯示,不同處理的土壤pH均呈堿性;3個種植植物處理的根際土壤有機質(zhì)含量都顯著高于空白對照,為15.60~20.3 g·kg-1,且少花蒺藜草處理顯著低于狗尾草、冰草植物處理;不同處理的速效磷含量之間表現(xiàn)出了顯著的統(tǒng)計學(xué)差異,從高到低依次為狗尾草>空白對照>冰草>少花蒺藜草,少花蒺藜草處理速效磷含量顯著低于其他處理;各處理之間全磷含量的大小關(guān)系為冰草>狗尾草>少花蒺藜草>CK,少花蒺藜草處理與CK顯著低于冰草與狗尾草處理,而少花蒺藜草與CK之間差異不顯著。磷酸酶活性從高到低依次為少花蒺藜草>狗尾草>冰草>CK,少花蒺藜草處理顯著高于其他處理。
表1 不同處理根際土壤理化性質(zhì)Table 1 The physical and chemical properties of different treatment
通過對20個樣本高通量測序,經(jīng)拼接和過濾處理后,以97%的序列相似性作為閾值進行OTU劃分,共產(chǎn)生20499個根際土壤解磷菌OTU(圖1)。其中4個處理中共有的解磷菌OTU為1519個,僅占所有總數(shù)的7.41%,不同處理之間解磷細菌存在較大差異。少花蒺藜草處理的解磷菌OTU總數(shù)最高,為9289個;CK次之,為9239個;冰草處理的OTU總數(shù)最低,為8621個。各處理中CK特有的解磷菌OTU最高,且顯著高于種植植物的處理,為5819個;少花蒺藜草在種植植物處理中所特有的解磷菌OTU數(shù)目最高,為1919個。另外,在3個種植植物的處理中,少花蒺藜草與CK共有的解磷菌OTU數(shù)目最高,為2747個;狗尾草處理次之,為2319個;冰草處理數(shù)目最低,為2172個。
圖1 細菌OTUs分布維恩圖Fig.1 Venn graph of bacteria OTUs distributionCK:空白土壤;cp:少花蒺藜草;ac:冰草;sv:狗尾草。
2.3.1 Shannon多樣性分析 由圖2可知,CK的Shannon指數(shù)最高,少花蒺藜草處理在3個種植植物的處理中Shannon指數(shù)值最高,冰草處理次之,狗尾草處理最低。表明少花蒺藜草根際土壤解磷菌的群落多樣性顯著高于其他植物處理的根際土壤(P<0.05)。
2.3.2 Chao1指數(shù) Chao1指數(shù)箱型圖結(jié)果如圖3所示,其趨勢與Shannon指數(shù)值相似,CK的Chao1指數(shù)值最低,3種植物樣本中少花蒺藜草處理的Chao1指數(shù)值最高,冰草處理次之,狗尾草處理指數(shù)值最低。表明在不同種植植物的處理中,少花蒺藜草處理的根際土壤具有最低的細菌群落多樣性。
將樣本結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進行對比分析,統(tǒng)計在各個分類水平下的解磷菌群落組成,others為占比較低、不足1%的物種,將未得到生物學(xué)注釋的物種歸為unidentified。
對4種處理的土壤樣品序列進行分析,選取在門水平上豐度前5名的物種,繪制物種相對豐度柱形累積圖。由圖4可知,各土壤樣品的細菌組成基本相似但比例有所不同,各處理中的優(yōu)勢菌門為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、厚壁菌門Firmicutes、浮霉菌門Planctomycetes,個別菌群所占的比例在不同處理之間有不同程度的差異。3種種植植物的處理中根際土壤變形菌門所占的比例明顯高于CK,而少花蒺藜草處理的變形菌門所占比例在3個處理中最高;厚壁菌門和浮霉菌門在各樣本中所占的比例未表現(xiàn)出明顯變化。
圖2 不同處理之間Shannon指數(shù)箱型圖 圖3 不同處理之間Chao1指數(shù)箱型圖
圖4 不同樣本細菌在門分類水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria from different samples at phylum levelCK:空白土壤;cp:少花蒺藜草;ac:冰草;sv:狗尾草。CK:Soil without plants;cp:C. spinifex;ac:A. cristatum;sv:S. viridis.
2.5.1 PCA分析 主成分分析(PCA)結(jié)果顯示(圖5),種植植物的處理位于PC1正半軸,而CK位于PC1負半軸,說明種植植物處理給土壤微生物組成帶來了較大變化;少花蒺藜草與狗尾草處理位于PC2的正半軸且距離非常接近,而冰草處理位于PC2的負半軸,說明少花蒺藜草與狗尾草處理微生物群落結(jié)構(gòu)相似值最高,與冰草處理相似性較低。
2.5.2 UPGMA聚類樹 基于Bray-Curtis算法,將20組樣品做出相應(yīng)的UPGMA聚類樹,聚類樹中的樣品越靠近,其枝長越短,則說明2組樣品之間的物種組成越相似。從圖6可知,少花蒺藜草處理與狗尾草處理最為靠近且枝長較短,二者聚為一類,冰草次之,而CK位于另一個分枝且枝長較長,說明少花蒺藜草處理與狗尾草處理的根際土壤解磷菌組成具有較高的相似性,而冰草與這二者存在一定的相似性,CK與另外三者物種組成相似性最低,與主成分分析結(jié)果一致。
通過LEfSe分析(圖7),得到在少花蒺藜草處理中顯著富集且與其他處理有顯著性差異的5個解磷菌類群,進一步分析得到,它們分別是α-變形菌綱Alphaproteobacteria、海洋鏈霉菌Streptomyces_sp_ZFG47、鏈霉菌目Streptomycetales、鏈霉菌科Streptomycetaceae、鏈霉菌屬Streptomyces。這說明α-變形菌、鏈霉菌在少花蒺藜草對于磷的吸收中可能起較為重要的作用。
圖5 20個土壤樣品微生物PCA分析 圖6 基于Unweighted unifrac距離矩陣的UPGMA聚類樹 Fig.5 PCA analysis of bacteria in 20 soil samples Fig.6 UPGMA based on Unweighted unifrac distance matrix
圖7 LEfSe多級物種層級樹圖 Fig.7 LEfSe hierarchical tree of species
通過RDA分析明確植物根際解磷細菌群落與土壤因子之間的關(guān)系(圖8)。放線菌門落在速效磷箭頭的正方向上,說明土壤中速效磷含量越高,放線菌門的豐富度越高;浮霉菌門、藍細菌Cyanobacteria落在速效磷箭頭的反方向上,說明土壤中速效磷含量越高,2種細菌的豐富度越低;后壁菌門與速效磷幾乎垂直,相關(guān)性較低。變形菌門落在全氮、全鉀、有機質(zhì)箭頭的正方向上,說明土壤中全氮、全鉀、有機質(zhì)的含量越高,變形菌門的豐富度越高。
圖8 土壤樣品中門水平下的細菌豐度和土壤因子的冗余分析Fig.8 Redundancy analysis (RDA)of abundant bacteria phyla and soil properties of soil samples
由表2可以得出,第一排序軸揭示了各處理樣本中63.5%的變異,第二排序軸揭示了樣本中11.4%的變異,前2個排序軸一共解釋了74.9%的樣本總變異。第一排序軸與pH、有機質(zhì)、全氮、全鉀有較強的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)分別為0.7691、-0.8159、-0.8487、-0.8279),第二軸與速效磷、速效鉀有較強的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)分別為0.448、-0.5445)。
表2 冗余分析結(jié)果Table 2 Summary of the results of redundancy analysis
外來入侵植物定殖成功后,會在入侵地迅速形成單一優(yōu)勢群落,破壞當?shù)厣锶郝浣Y(jié)構(gòu),使本地物種生物多樣性大大降低,并且影響入侵地的土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)與功能,使其更適合自己的生長發(fā)育而不利于本地植物的生長(Wangetal.,2018)。本試驗中,少花蒺藜草根際土壤有效磷含量遠低于空白對照土壤和本地植物(冰草、狗尾草)土壤,可能由于少花蒺藜草對磷的吸收能力強,導(dǎo)致土壤中磷含量過低,從而對周圍植物的生長產(chǎn)生不利影響。劉紅梅等(2012)研究發(fā)現(xiàn),黃頂菊入侵后土壤中的速效磷含量低于本地對照植物處理,與本研究結(jié)果類似。而楊國慶等(2014)研究表明,入侵植物紫莖澤蘭入侵地相比周圍未入侵地的有效磷含量顯著提高,這可能與不同入侵植物對磷的利用方式不同有關(guān)。
越來越多的研究表明,外來入侵植物對入侵地土壤微生物群落的改變是其能夠成功入侵的重要原因之一(Bowenetal.,2017;Niuetal.,2007;Reinhart &Callaway,2006)。外來植物從原生地傳播擴散到入侵地后,會進行大量的繁殖擴散,與本地植物競爭生存空間、水分光照等條件,入侵植物通過改變?nèi)肭值赝寥览砘再|(zhì)與微生物的群落組成來影響抑制本地植物的生長與擴散,通過破壞本地植物與土壤微生物之間的相互關(guān)系,間接有利于自身群落的生長。在這個過程中,土壤微生物群起到了重要的“橋梁”作用(Battenetal.,2006;Kourtevetal.,2002;Lietal.,2006)。本研究中,根際土壤解磷菌OTU分類學(xué)及Alpha多樣性分析結(jié)果表明,少花蒺藜草處理具有最高的OTU總數(shù),所特有OTU在種植植物處理中的數(shù)量也最高;且在種植植物的各處理中,少花蒺藜草的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)高于其他處理。這說明相比于其他植物,少花蒺藜草入侵后提高了根際土壤解磷菌群落豐富度,降低了根際解磷菌的群落多樣性。
相比于空白對照處理,種植植物處理都使根際土壤解磷菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了不同程度的變化。PCA與UPGMA聚類結(jié)果表明,各處理之間少花蒺藜草處理與狗尾草處理具有最大的物種組成相似性。LEfSe分析發(fā)現(xiàn),少花蒺藜草處理中顯著富集且有顯著性差異的5個解磷菌類群,其中α-變形菌與鏈霉菌(尤其是鏈霉菌)在少花蒺藜草入侵過程中可能起著較為重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn),外來植物薇甘菊MikaniamicranthaKunth和三葉鬼針草BidenspilosaL.入侵后,入侵地土壤微生物群落的優(yōu)勢菌群與α-變形菌綱具有很近的親緣關(guān)系(陳亮等,2011);入侵植物紫莖澤蘭在紅壤、黃壤和紫色土3種土壤條件下的根際微生物優(yōu)勢菌屬都有鏈霉菌(劉海等,2018)。在放線菌中起解磷作用的主要是鏈霉菌(李阜棣和胡正嘉,2000),F(xiàn)arhatetal.(2015)對鏈霉菌屬細菌解磷機制研究表明,鏈霉菌屬菌株主要的解磷機制是葡萄酸的分泌。環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,放線菌門與土壤中速效磷含量具有相關(guān)關(guān)系,變形菌門與土壤中全氮、全鉀、有機質(zhì)具有正相關(guān)關(guān)系。胡靜(2015)也發(fā)現(xiàn)變形菌門和浮霉菌門與大針茅StipagrandisP.A.Smirn.根際土壤磷含量顯著相關(guān)。植物根際微生物的群落結(jié)構(gòu)除了受到土壤理化性質(zhì)的影響,植物根系的分泌物,如有機酸、磷酸酶、化感物質(zhì)等也會影響其群落的分布及結(jié)構(gòu);微生物群落反過來也會影響這些因素,二者是相輔相成的關(guān)系。所以少花蒺藜草根際解磷菌群落結(jié)構(gòu)的獨特性也說明了少花蒺藜草在根系分泌物方面可能存在其獨特性。
與對照植物相比,少花蒺藜草入侵顯著降低了土壤速效磷和全磷含量,顯著提高了土壤解磷菌的活性和土壤解磷菌的群落多樣性。在各處理中種植少花蒺藜草的根際土壤具有最高的OTU總數(shù),所特有OTU數(shù)在種植植物處理中的數(shù)量也最高;且在種植植物的各處理中,少花蒺藜草的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)高于其他處理。
與空白對照相比,種植植物處理都使根際土壤解磷菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了不同程度的變化。PCA與UPGMA聚類結(jié)果表明,少花蒺藜草處理的根際土壤解磷菌與狗尾草處理具有最大物種組成相似性。LEfSe多級物種差異判別分析結(jié)果表明,少花蒺藜草處理中顯著富集且與其他處理有顯著性差異的解磷菌類群為α-變形菌、鏈霉菌,其在少花蒺藜草對于磷的吸收中可能起較為重要的作用。變形菌門、浮霉菌門和放線菌與少花蒺藜草根際土壤中的全磷含量呈顯著正相關(guān),放線菌與少花蒺藜草根際土速效磷含量有緊密聯(lián)系。少花蒺藜草通過改變?nèi)肭值馗H土壤的解磷菌群落結(jié)構(gòu)間接影響根際土壤的磷素環(huán)境,從而利于自身的生長。