彭思源，呂 軍，邱立新，李奔奔，李新文，葉 姍，丁 中*

1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙410128；2湖南省平江縣植保植檢站，湖南 岳陽 414500；3湖南省植保植檢站，湖南 長沙410006

水稻OryzasativaL．是世界上最重要的糧食作物之一，在我國糧食生產(chǎn)中占有極其重要的地位。據(jù)報道,危害水稻生產(chǎn)的植物寄生線蟲主要有35個屬300多種(Upadhyayetal.,2014)，其中擬禾本科根結(jié)線蟲Meloidogynegraminicola(Golden and Birchfield)被認(rèn)為是對水稻危害最大的線蟲之一(Duttaetal.,2012)。該線蟲于1965年在美國路易斯安那州的禾本科雜草及燕麥AvenasativaL.上被發(fā)現(xiàn)(Golden &Birchifield,1965)，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在旱稻、灌溉地水稻、低洼地水稻、深水稻、水稻苗床上均可侵染危害，發(fā)病癥狀主要為植株矮小稀疏、葉片黃化(Plowright &Bridge,1990;Soriano &Reversal,2003)，造成的產(chǎn)量損失可達(dá)11%～80% (de Waele &Elsen,2007)。該線蟲原主要在海南、廣東、廣西等我國的南部沿海各省危害。近年來隨著氣候變化、水稻種植模式的轉(zhuǎn)變以及跨區(qū)作業(yè)的大型聯(lián)合收割機(jī)的遠(yuǎn)程傳播，且生產(chǎn)上缺乏抗性品種以及高效、低毒的化學(xué)藥劑的使用，該病害在湖南、江西、福建、江蘇、湖北等我國南方水稻主產(chǎn)區(qū)發(fā)生面積和危害逐年增加(馮輝等,2017;Songetal.,2017;Wangetal.,2017)，嚴(yán)重威脅我國的糧食安全。

湖南是我國的水稻大省，稻谷面積和總產(chǎn)量均居全國前列。近年來，湖南衡陽、益陽、岳陽、常德、株洲和長沙等多地發(fā)現(xiàn)水稻根結(jié)線蟲病且危害日益嚴(yán)重(姚思敏等，2018)。呂軍等(2019)對岳陽平江縣水稻根結(jié)線蟲的發(fā)生及病原種類進(jìn)行了初步調(diào)查和鑒定，發(fā)現(xiàn)平江23個鄉(xiāng)鎮(zhèn)中有5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)生了水稻根結(jié)線蟲病，并通過rDNA-ITS擴(kuò)增、測序和比對將其鑒定為擬禾本科根結(jié)線蟲。但沒有對其病原形態(tài)特征做觀察鑒定，且在平江的詳細(xì)分布、發(fā)生危害情況尚不清楚。為此，本研究于2020年4—6月進(jìn)一步對水稻根結(jié)線蟲在平江縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的發(fā)生危害、分布情況再次進(jìn)行了調(diào)查與種類鑒定，并調(diào)查了感病稻田的栽培方式及土壤的土種、土質(zhì)，以期為平江水稻根結(jié)線蟲病的科學(xué)防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

平江是典型的山區(qū)農(nóng)業(yè)大縣，是國家級產(chǎn)糧基地縣，位于湖南省東北部，地處汨水、羅水上游，汨羅江自東向西貫穿全境，境內(nèi)河網(wǎng)密布。平江縣地貌以山地和丘陵為主，平均海拔298 m。土壤類型以山地紅壤和黃紅壤為主。地勢東南部和東北部高，西南部低。平江氣候?qū)俚湫偷膩啛釒Ъ撅L(fēng)濕潤區(qū)，多年平均降雨量為1575 mm，多年平均溫度為18.98 ℃(徐志鵬等，2020)。

1.2 調(diào)查與樣品采集

2020年4—6月，對湖南省岳陽市平江縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)不同栽培模式下的水稻根結(jié)線蟲發(fā)生情況、發(fā)生頻率及危害程度進(jìn)行田間調(diào)查，通過與當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)局植保站技術(shù)人員交流、走訪水稻種植戶以及實地采樣等方式，記載水稻種植時間、栽培規(guī)模以及根結(jié)線蟲病發(fā)生歷史情況等。調(diào)查了安定、龍門、上塔等共24個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)隨機(jī)選取1～3個地點進(jìn)行采樣，每個采樣地采10塊田，5點法取樣，各點采集2叢水稻，將各個點的樣品混合后一起裝入塑料袋中，并記錄采樣地點、土質(zhì)、土種、栽培方式、播期和GPS信息等。

洗凈當(dāng)天采集的水稻，檢查具根結(jié)的水稻發(fā)病株數(shù)，統(tǒng)計田塊病株率、各地病株率和各地病田率；按分級標(biāo)準(zhǔn)計算田塊根結(jié)指數(shù)和各地根結(jié)指數(shù)。病情分級標(biāo)準(zhǔn)采用0～10級的分級標(biāo)準(zhǔn)(Sharma-poudyaletal.,2005)。0級:健康，無根結(jié)；1級:根結(jié)小且數(shù)量極少，不易觀察；2級:根結(jié)小，根結(jié)數(shù)量稍多，易觀察；3級:根結(jié)小，數(shù)量較多且盤繞，根系功能未受影響；4級:根結(jié)數(shù)量較多，有較大根結(jié)，大部分根系功能健康；5級:25%～49%的根系上有根結(jié)，小部分根系功能未受影響；6級:50%～74%的根系上有根結(jié)，根系正常功能受到影響；7級:75%以上根系有根結(jié)，失去根系功能；8級:無健康根系，植株仍存活；9級:整個根系出現(xiàn)腐爛，植株趨于死亡；10級:植株死亡。

田塊病株率/%=(田塊病株數(shù)/田塊總株數(shù))×100；

各地病株率/%=田塊病株率總和/各地田塊數(shù)；

各地病田率/%=(病田數(shù)/調(diào)查田塊總數(shù))×100；

田塊根結(jié)指數(shù)=[∑(各級病株數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值)]×100；

各地根結(jié)指數(shù)=當(dāng)?shù)馗魈飰K根結(jié)指數(shù)總和/當(dāng)?shù)靥飰K數(shù)。

1.3 供試蟲源與單卵囊擴(kuò)繁

將平江15個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的水稻病株帶回實驗室進(jìn)行單卵囊擴(kuò)繁。在體式顯微鏡下破開根結(jié)，收集卵囊，將單卵囊孵化的線蟲接種到培養(yǎng)的水稻上，接種20 d后收集卵粒，30 ℃黑暗條件下孵化；反復(fù)接種以擴(kuò)繁種群。

1.4 平江根結(jié)線蟲的種類鑒定

1.4.1 分子鑒定 對平江縣15個發(fā)生水稻根結(jié)線蟲病鄉(xiāng)鎮(zhèn)的線蟲分別進(jìn)行分子鑒定，以南方根結(jié)線蟲M.incongnita(Kofold &White) Chitwood作空白對照，單條線蟲的DNA提取方法參照吳文濤等(2014)。rDNA ITS基因片段(369 bp)擴(kuò)增鑒定引物Mg-F3 (5′-TTATCGCATCATTTTATTTG-3′)、Mg-R2 (5′-CGCTTTGTTAGAAAATGACCCT-3′)及程序參照Htayetal.(2016)。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離出來的2齡幼蟲熱殺死固定后，采用甘油-乙醇快速脫水法對線蟲進(jìn)行脫水，將脫水后的線蟲挑入甘油滴中，用石蠟封片，制作成玻片。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察并拍照以進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，并采用de Man公式對線蟲進(jìn)行測計。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

運用SPSS 20.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 平江水稻根結(jié)線蟲病田間癥狀和線蟲形態(tài)特征

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，水稻直播或移栽后20 d左右，發(fā)病田塊水稻呈區(qū)域黃化、稀疏狀，發(fā)病水稻長勢差，嚴(yán)重時黃化，纖弱矮小(圖1A)，在田埂邊的發(fā)生概率高于水田中部；受害水稻根系發(fā)育受阻，長有根結(jié)，幼根根結(jié)膨大后彎曲成棒狀、鉤狀或紡錘狀并伴有大量須根，老根變棕褐色易腐爛(圖1B)。

圖1 擬禾本科根結(jié)線蟲危害癥狀Fig.1 Symptoms in M. graminicola in fested fieldsA:田間癥狀;B:根部根結(jié)。A:Field symptoms;B:Roots showing severe root galling.

2.1.1 形態(tài)特征分析 會陰花紋：橢圓形至近圓形，背弓高、近方形，未見側(cè)線，線紋連續(xù)、細(xì)密、環(huán)繞會陰，尾尖明顯，尾端及肛門附近有明顯紋線，陰門區(qū)一般無線紋(圖2A)。

2齡幼蟲：蠕蟲狀，熱殺死后蟲體腹略彎或僵直，體長為442～504 μm (圖2B)；頭架較弱，口針纖細(xì)，基部球小，中食道球及瓣門明顯(圖2C)，橢圓形；食道腺覆蓋腸腹面；尾部細(xì)、長，尾末端呈細(xì)棍棒狀(圖2D)。

雄蟲：蟲體蠕蟲狀(圖2E)，頭架中等發(fā)達(dá)，頭冠低、圓，與蟲體連接處縊縮不明顯；口針基桿圓柱狀，基部球卵圓形，前緣平或略后斜(圖2F)；精巢長、單條(圖2G)；交合刺發(fā)達(dá)，引帶桿狀；尾短、鈍圓(圖2H)。

雌蟲：蟲體梨形或圓形，有明顯的細(xì)頸(圖2I)，口針纖細(xì)(圖2J)。

2齡線蟲測量值和de Man參數(shù)值見表1，平江各地理群體測量值略有差異。其中長壽鎮(zhèn)群體的平均體長最長，為504.2 μm，福壽山鎮(zhèn)群體的平均體長最短，為442.6 μm；木金鄉(xiāng)群體的體寬值最大，為23.0 μm，福壽山鎮(zhèn)群體的體寬值最小，為16.9 μm。平江線蟲體寬均較相似緯度的浙江富陽、福建政和的測量值偏大，平江各群體的尾長較富陽、政和的偏短(劉國坤等，2011;劉樂樂等，2018)。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 對各地采集的樣品利用rDNA ITS特異性引物進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果表明，從安定鎮(zhèn)、龍門鎮(zhèn)居、福壽山鎮(zhèn)和加義鎮(zhèn)等15個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的樣品中均擴(kuò)增出369 bp的DNA片段(圖3)。由此確定，平江縣安定鎮(zhèn)、龍門鎮(zhèn)居、福壽山鎮(zhèn)和加義鎮(zhèn)15個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的水稻根系上發(fā)現(xiàn)的根結(jié)線蟲均屬于擬禾本科根結(jié)線蟲。

圖2 擬禾本科根結(jié)線蟲形態(tài)特征Fig.2 Morphological characters of M. graminicolaA:會陰花紋;B:2齡幼蟲;C:2齡幼蟲頭部;D:2齡幼蟲尾部;E:雄蟲;F:雄蟲頭部;G:雄蟲精巢;H:雄蟲尾部;I:雌蟲;J:雌蟲頭部；A～J比例尺：50、100、50、50、200、100、50、100、100、20 μm。A:Female perineal patterns ;B:Second-stage juvenile (J2);C:Head of J2;D:J2 tail region;E:Male;F Head of male;G:Male testis;H:Male tail region;I:Female;J:Head of female;A-J scale bar:50,100,50,50,200,100,50,100,100,20 μm.

表1 擬禾本科根結(jié)線蟲平江分離群體2齡幼蟲形態(tài)特征測計值Table 1 Morphological characters of second-stage juveniles of M. graminicola of Pingjiang isolates

圖3 擬禾本根結(jié)線蟲特異性ITS引物PCR擴(kuò)增片段電泳檢測結(jié)果Fig.3 PCR amplification patterns for 15 M. graminicola populations generated with the specific rDNA-ITS primersM:Marker;1～15:大洲、岑川、加義、龍門、三陽、向家、三市、伍市、梅仙、木金、福壽山、上塔、長壽、安定、虹橋;N：陰性對照。

2.2 平江縣水稻根結(jié)線蟲病的發(fā)生和分布

調(diào)查結(jié)果表明，安定鎮(zhèn)、龍門鎮(zhèn)等15個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的田塊中發(fā)現(xiàn)水稻根結(jié)線蟲病，發(fā)生率達(dá)63%。不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的發(fā)生程度也存在差異，其中長壽、安定的病田率達(dá)100%，岑川、梅仙等地的病田率低于20%；同時長壽、安定的病株率分別為51%、55%；安定、福壽山和長壽等3地水稻的根結(jié)指數(shù)大于10，岑川鎮(zhèn)水稻受害較輕，根結(jié)指數(shù)為0.4(表2)。

全縣水稻根結(jié)線蟲病的發(fā)生在地理分布上呈現(xiàn)東南重、西北中等、中部輕的趨勢，南靠汨羅江兩岸的稻田水稻根結(jié)線蟲病發(fā)生較嚴(yán)重。

表2 平江縣水稻根結(jié)線蟲病的發(fā)生情況Table 2 Occurrence of the rice root-knot nematode in Pingjiang County

2.3 平江縣不同生態(tài)條件水稻根結(jié)線蟲病危害比較

比較平江縣不同生態(tài)條件下水稻根結(jié)線蟲病危害情況，發(fā)現(xiàn)直播、拋秧田平均根結(jié)指數(shù)值(7.0、7.8)顯著高于手插和機(jī)插田塊的根結(jié)指數(shù)(0.7、0.4) (P<0.05)；不同土種田塊的病情指數(shù)差異不明顯，河沙泥、紅黃泥、麻沙泥和酸紫沙泥的水稻田的水稻根結(jié)線蟲病病情指數(shù)分別為6.7、8.8、5.4、7.4；種植于砂壤、中壤和重壤水稻的病情指數(shù)(8.2、8.8、9.3)明顯高于種植于黏土和輕壤水稻的病情指數(shù)(4.3、3.0)(表3)。

表3 水稻根結(jié)線蟲病在不同稻田的發(fā)生情況Table 3 Occurrence of rice root-knot nematode in fields with different cultivation mode

3 討論與結(jié)論

21世紀(jì)以來，隨著農(nóng)村勞動力的大量流失和勞動力成本的不斷上漲，水稻種植方式發(fā)生轉(zhuǎn)變，直播、拋秧等輕簡化栽培措施逐漸取代移栽，種植面積逐年擴(kuò)大(Farooqetal.,2011;Liuetal.,2015)。直播稻播種后一般不建立水層，且在水稻三葉期前保持田間土壤濕潤，這種水分管理模式有利于擬禾本科根結(jié)線蟲的發(fā)生和危害，并導(dǎo)致直播田根結(jié)線蟲的群體數(shù)量高于移栽田(Protetal.,1994)。直播田根結(jié)線蟲群體數(shù)量的常年積累，導(dǎo)致近些年來水稻根結(jié)線蟲病在直播稻種植區(qū)頻發(fā)(López-Fando &Bello,1995)。本研究發(fā)現(xiàn)，水稻根結(jié)線蟲病在平江縣的發(fā)現(xiàn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)已由2018年的5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)展到15個，呈蔓延趨勢。特別是平江縣東部和南部靠近汨羅江沿岸的鄉(xiāng)鎮(zhèn)水稻根結(jié)線蟲病發(fā)生嚴(yán)重，需對該病害引起足夠重視。

線蟲的口針、體長、尾長等是用于鑒定根結(jié)線蟲種類的重要參數(shù)。但擬禾本科根結(jié)線蟲不同地理群體的體長、口針長度等參數(shù)變異較大。本檢測結(jié)果表明，福壽山鎮(zhèn)山區(qū)群體的體長、體寬、尾長等值較其他鄉(xiāng)(鎮(zhèn))群體的值偏小，與Bellafiore &Brigcs (2010)結(jié)果相似，反映了不同地理群體存在一定的形態(tài)差異(Pokhareletal.,2010)，也表明了環(huán)境氣候條件及寄主可能是影響線蟲形態(tài)特征的重要因素(Jepson,1983)。

根結(jié)線蟲病作為一種土傳病害，土壤的質(zhì)地、溫度、pH值、氧化還原狀態(tài)和水分含量均能影響水稻根結(jié)線蟲病的發(fā)生(Sorianoetal.,2000;Winetal.,2011,2013)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，安定、長壽等水稻根結(jié)線蟲病嚴(yán)重發(fā)生地多為砂壤、中壤或重壤，且不保水，有利于水稻根結(jié)線蟲病發(fā)生(Bridgeetal.,2005)，而伍市鎮(zhèn)等地稻田土質(zhì)為黏土，保水性能較好，不利于線蟲的侵染和繁殖(Griffin &Darling,1964)，發(fā)病較輕。調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)，水稻根結(jié)線蟲病在當(dāng)?shù)氐脑?、中稻上發(fā)生較嚴(yán)重，晚稻上發(fā)生較輕，這可能與湖南6—8月份30 ℃以上高溫不利于根結(jié)線蟲卵的孵化(Rao &Israel,1973;Raoetal.,1971)及夏季翻曬降低了根結(jié)線蟲群體數(shù)量有關(guān)(Khan &Singh,2008;Singhetal.,2005)。