韓瑩 曲有樂(lè)

1（山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西太原 030000）

2（浙江海洋大學(xué)，浙江舟山 316000）

將紫貽貝粗多糖以不同劑量濃度給小鼠灌胃，以環(huán)磷酰胺模型組和正常組小鼠為對(duì)照，比較不同組間小鼠的免疫器官重量、小鼠血常規(guī)、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α 的差別，分析紫貽貝多糖對(duì)不同免疫因子的影響。

1 材料和設(shè)備

1.1 材料

Balb/c 小鼠，體重在18 g～22 g，雄性，購(gòu)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。飼養(yǎng)條件：25 ℃左右，每12 h晝夜間斷性照明。

紫貽貝粗多糖，由本課題組提取，除去蛋白總糖含量為62.8%。

1.2 試劑

環(huán)磷酰胺、白細(xì)胞介素2（IL-2）ELISA 試劑盒、白細(xì)胞介素4（IL-4）ELISA 試劑盒、白細(xì)胞介素10（IL-10）ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA 試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

BT125D 電子天平，塞利多斯科學(xué)儀器有限公司；THERMO酶標(biāo)儀，上海輔澤商貿(mào)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 免疫抑制模型的建立

2.1.1 小鼠分組

將Balb/c 小鼠在清潔安靜溫度適宜的動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天后取50 只，雄性，體重在18 g～22 g，隨機(jī)分成5 組，每組10 只，即為空白對(duì)照組、紫貽貝粗多糖低劑量、紫貽貝粗多糖中劑量、紫貽貝粗多糖高劑量和環(huán)磷酰胺模型。

2.1.2 給藥方法

用左手抓緊小鼠背部和頭部的皮毛，使其固定，并使其頭部后仰，與身體成水平直線，將針頭自口腔右側(cè)沿上顎垂直緩慢下行，灌藥0.2 mL，觀察小鼠呼吸正常與否。

2.1.3 造模

空白組小鼠每只每天注射0.2 mL 0.9%的生理鹽水，模型組小鼠前11 天每天每只注射0.2 mL 0.9%生理鹽水。低劑量多糖組每天注射125 mg/kg紫貽貝粗多糖溶液，中劑量組多糖組每天注射250 mg/kg紫貽貝粗多糖溶液，高劑量多糖組每天注射500 mg/kg紫貽貝粗多糖溶液。第12 天，采用皮下注射方式，給多糖組和模型組每只小鼠每天注射0.1 mL 50 mg/kg的環(huán)磷酰胺，連續(xù)注射3天。

2.2 紫貽貝粗多糖對(duì)免疫抑制小鼠血液中白細(xì)胞數(shù)的影響

2.2.1 采血

采血前12 h 禁食，采血1 h 前禁水，每組任意選3 只小鼠采血，選用眼球摘除采血法采血。摘除小鼠眼球后，小鼠血液應(yīng)立即放入抗凝管中，混勻后，4 h內(nèi)完成檢測(cè)。

2.2.2 血樣檢測(cè)

選用血液自動(dòng)分析儀對(duì)小鼠血液樣本進(jìn)行檢測(cè)。每組任意選3只小鼠的血液樣本做重復(fù)性試驗(yàn)。

2.3 紫貽貝粗多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響

2.3.1 采血

在解剖前一晚斷糧，不斷水。第2 天，稱重，活體摘除眼球取血，每只取1 mL，在4 ℃冰箱低溫保存，靜置24 h，4 000 r/min 離心10 min，收集血清。放于-20 ℃冰箱備用。

2.3.2 小鼠血清的IL-2、IL-4、IL-10 和TNF-α 檢測(cè)方法

試驗(yàn)前將小鼠血清和試劑盒取出解凍，溫度恢復(fù)至室溫。加入1 mL 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，待完成溶解后，靜置15 min 混勻，之后按1 000μL、500μL、250μL、125μL、62.5μL、31.25μL、15.625μL 進(jìn)行稀釋。根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量和標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量決定所需的板條數(shù)，并增加1 孔作為空白對(duì)照孔。將標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)放入孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃烘箱孵育90 h。加入相應(yīng)試劑，于450 nm處測(cè)吸光度值。

2.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用()x±s表示。當(dāng)P＜0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著，當(dāng)P＜0.01，統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著；P＞0.05，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 對(duì)免疫抑制小鼠血液中白細(xì)胞數(shù)的影響

通過(guò)血液檢測(cè)，對(duì)正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環(huán)磷酰胺模型組小鼠血液中血紅蛋白數(shù)進(jìn)行分析比較，測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

圖1 紫貽貝粗多糖對(duì)免疫抑制小鼠白細(xì)胞數(shù)量的影響

免疫抑制造模后，環(huán)磷酰胺模型組白細(xì)胞數(shù)量顯著小于正常組。低劑量組與中劑量組小鼠白細(xì)胞數(shù)量比環(huán)磷酰胺模型組多，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，高劑量組可大大促進(jìn)小鼠白細(xì)胞的產(chǎn)生；與正常組相比，高劑量組小鼠白細(xì)胞雖比正常組多，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低劑量組極其顯著低于中劑量組和高劑量組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果表明，紫貽貝粗多糖可刺激小鼠血液中白細(xì)胞的產(chǎn)生，對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用明顯。紫貽貝粗多糖含量越高，免疫調(diào)節(jié)作用越好，但低劑量、中劑量多糖對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用有限。

3.2 對(duì)小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10 和TNF-α 的影響

3.2.1 給藥14天小鼠血清IL-2的水平變化

3.2.1.1 IL-2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

標(biāo)準(zhǔn)品按原液1∶2∶4∶8∶16∶32 比例用50μL、100μL 微量加樣器加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，空白孔加入50μL原始濃度空白對(duì)照液，以IL-2標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖略）。得出線性方程為y=0.004x+0.018，R2=0.993 4。

3.2.1.2 小鼠血清IL-2的水平變化

采用白細(xì)胞介素2（IL-2）ELISA 試劑盒對(duì)正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環(huán)磷酰胺模型組小鼠血清中IL-2含量進(jìn)行分析比較，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 紫貽貝多糖對(duì)小鼠血清IL-2水平的影響

免疫抑制造模后，環(huán)磷酰胺模型組血清IL-2含量顯著低于正常組。低劑量組比模型組高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中劑量和高劑量組與模型組相比，均可大大增加小鼠血清中IL-2含量。高劑量組與正常組相比，含量大于正常組。低劑量組極其顯著低于中劑量組和高劑量組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖2 可以看出，小鼠血清IL-2水平隨著粗多糖含量的增高而增高，且中劑量和高劑量組小鼠血清IL-2水平高于正常組。而只注射環(huán)磷酰胺的模型組明顯低于正常組和多糖組。

結(jié)果表明，低劑量粗多糖對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用有限。紫貽貝粗多糖在250 mg/kg 和500 mg/kg 可明顯提高小鼠血清IL-2含量，提高小鼠免疫力，且紫貽貝粗多糖調(diào)節(jié)作用與多糖含量成正比。

3.2.2 給藥14天小鼠血清IL-4的水平變化

3.2.2.1 IL-4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

IL-4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定同3.2.1.1，根據(jù)測(cè)定結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.002x+0.078 6，R2=0.999 4。

3.2.2.2 小鼠血清IL-4的水平變化

采用白細(xì)胞介素4（IL-4）ELISA 試劑盒對(duì)正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環(huán)磷酰胺模型組小鼠血清中IL-4 含量進(jìn)行分析比較，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 紫貽貝多糖對(duì)小鼠血清IL-4水平的影響

免疫抑制造模后，環(huán)磷酰胺模型組血清IL-4含量顯著低于正常組。低劑量組小鼠血清IL-4比模型組高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，中劑量和高劑量紫貽貝粗多糖可大大增加小鼠血清IL-4 含量。高劑量組與模型組和正常組相比，小鼠血清IL-4 含量大于正常組和模型組。低劑量組與中劑量組和高劑量組相比含量極其顯著低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖3 可以看出，小鼠血清IL-4 水平隨著粗多糖含量的增高而增高，且中劑量和高劑量組小鼠血清IL-4水平高于正常組，而只注射環(huán)磷酰胺的模型組明顯低于正常組和粗多糖組。

結(jié)果表明，低劑量粗多糖對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用有限。紫貽貝粗多糖為250 mg/kg 和500 mg/kg 時(shí)可明顯提高小鼠血清IL-4含量，具有提高小鼠免疫力的作用，且調(diào)節(jié)作用與粗多糖含量成正比。

3.2.3 給藥14天小鼠血清IL-10的水平變化

3.2.3.1 IL-10標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

IL-10標(biāo)準(zhǔn)線曲線的制定同3.2.1.1，根據(jù)測(cè)定結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=0.003 4x+0.039 4，R2=0.999 4。

3.2.3.2 小鼠血清IL-10的水平變化

采用白細(xì)胞介素10（IL-10）ELISA 試劑盒對(duì)正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環(huán)磷酰胺模型組小鼠血清中IL-10 含量進(jìn)行分析比較，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

免疫抑制造模后，環(huán)磷酰胺模型組血清IL-10含量顯著低于正常組和粗多糖組。低劑量組小鼠血清IL-10 含量顯著比模型組高。中劑量組和高劑量組與模型組相比，均可大大增加小鼠血清IL-10 的含量。高劑量多糖組小鼠血清IL-10 含量大于正常組。低劑量組極其顯著低于中劑量組和高劑量組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖4 可以看出，小鼠血清IL-10水平隨著粗多糖含量的增高而增高，而只注射環(huán)磷酰胺的模型組，小鼠血清IL-10 水平明顯低于正常組和粗多糖組。

圖4 紫貽貝多糖對(duì)小鼠血清IL-10水平的影響

結(jié)果表明，低劑量多糖對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用有限。紫貽貝粗多糖在250 mg/kg 和500 mg/kg 濃度下可明顯提高小鼠血清IL-10 含量，具有提高小鼠免疫力的作用，且調(diào)節(jié)作用與粗多糖含量成正比。

3.2.4 給藥14天小鼠血清TNF-α的水平變化

3.2.4.1 TNF-α標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)線曲線的制定同3.2.1.1，根據(jù)測(cè)定結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.004x+0.018，R2=0.993 4。

3.2.4.2 小鼠血清TNF-α的水平變化

采用腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA 試劑盒對(duì)正常組、低劑量粗多糖組、中劑量粗多糖組、高劑量粗多糖組和環(huán)磷酰胺模型組小鼠血清中TNF-α含量進(jìn)行分析比較，測(cè)定結(jié)果如圖5所示。

免疫抑制造模后，模型組血清TNF-α 含量顯著低于正常組。低劑量組小鼠血清TNF-α 含量顯著比模型組高。與模型組相比，中劑量和高劑量組可大大增加小鼠血清TNF-α 含量。高劑量組與正常組相比，高劑量粗多糖組小鼠血清TNF-α 含量高于正常組。低劑量組極其顯著低于中劑量組和高劑量組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由圖5 可以看出，小鼠血清TNF-α 水平隨著粗多糖含量的增高而增高，而只注射環(huán)磷酰胺的模型組，小鼠血清TNF-α 水平明顯低于正常組和粗多糖組。

圖5 紫貽貝多糖對(duì)小鼠血清TNF-α水平的影響

結(jié)果表明，低劑量多糖對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用有限。紫貽貝粗多糖在250 mg/kg 和500 mg/kg 時(shí)可明顯提高小鼠免疫力的作用，紫貽貝粗多糖調(diào)節(jié)作用與粗多糖含量成正比。

4 結(jié)論

白細(xì)胞是具有防御和免疫功能的無(wú)色有核球形細(xì)胞，免疫低下造模對(duì)小鼠血液中的白細(xì)胞影響顯著，也會(huì)影響小鼠自身的防御和免疫功能。IL-2 最重要的作用是誘導(dǎo)T 淋細(xì)胞的分化，從而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用。IL-4 可增強(qiáng)B 細(xì)胞抗原提呈能力，使免疫系統(tǒng)對(duì)小量抗原刺激發(fā)生免疫應(yīng)答。IL-10 可促進(jìn)肥大細(xì)胞和胸腺細(xì)胞增殖，IL-10 也是淋巴結(jié)、脾臟細(xì)胞生長(zhǎng)的復(fù)合因子，從而提高發(fā)揮免疫抑制或免疫刺激作用。TNF-α 可以增強(qiáng)IL-2 依賴的胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞增殖能力，從而起到免疫抑制作用。由試驗(yàn)結(jié)果可知，中高劑量粗多糖可增加免疫抑制小鼠血清中的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α 含量。紫貽貝多糖對(duì)小鼠的具有免疫調(diào)節(jié)作用，且紫貽貝粗多糖的免疫調(diào)節(jié)力隨著粗多糖含量的增加而增加。綜上所述，紫貽貝粗多糖對(duì)免疫抑制小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用，粗多糖含量越高，免疫調(diào)節(jié)作用越好。