陳 慧 王曉靜 湯福想

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院(450014)

有報(bào)道[1]顯示，激活的白激酶C受體1(RACK1)在惡性腫瘤中高表達(dá)，但也有報(bào)道[2]顯示其可穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白(β-catenin)復(fù)合物，抑制腫瘤發(fā)生，在腫瘤組織中低表達(dá)。IQ序列三磷酸鳥苷酶激活蛋白(IQGAPl)是具有協(xié)調(diào)細(xì)胞粘附、遷移作用的一種支架蛋白，能與多種信號(hào)分子結(jié)合，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于其與宮頸癌病理特征關(guān)系的報(bào)道不多[3]。以往報(bào)道[4]顯示，宮頸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征與患者預(yù)后關(guān)系密切，而宮頸癌呈現(xiàn)不同病理特征，可能是多種分子作用的結(jié)果，明確宮頸癌組織RACK1、IQGAP1表達(dá)及與臨床病理特征關(guān)系，有助于為宮頸癌的靶向治療提供參考?；诖?，本文選取近年治療的宮頸癌患者臨床資料，探究宮頸癌組織RACK1、IQGAP1表達(dá)及與臨床病理特征和β-catenin的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月-2020年12月在本院行宮頸癌手術(shù)治療的患者為研究對(duì)象106例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2018癌癥報(bào)告：宮頸癌新分期及診治指南》中宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，術(shù)后病理組織檢查確診；②簽署知情同意書；③具手術(shù)指征；④術(shù)前未接受任何放、化等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤或復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移性宮頸癌；②嚴(yán)重心腦血管、肝、腎等功能障礙；③認(rèn)知功能障礙或精神性疾??；④妊娠或哺乳期。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器和試劑

RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR等試劑盒由上海聯(lián)邁生物工程有限公司生產(chǎn)，紫外分光光度計(jì)(B500型)上海元析儀器有限公司生產(chǎn)，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。一抗兔抗人抗體由上海田源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，二抗由北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，免疫組化試劑盒等試劑盒均由上海西唐生物生產(chǎn)，蘇木精由上?？婆d商貿(mào)有限公司生產(chǎn)。

1.3 RACK1、IQGAP1、β-catenin表達(dá)

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)①提取總RNA：取碾磨好的組織標(biāo)本，采用RNA提取試劑盒(Invitrogen)提取總RNA，紫外分光光度計(jì)顯示吸光度(A)比值A(chǔ)260/A280 ≥1.8，表示提取的總RNA純度濃度合格。②逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。③RT-PCR擴(kuò)增：cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參照，采用RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)程序：95℃ 30s預(yù)變性，95℃ 5s變性，55℃ 30s退火，72℃ 30s延伸，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.2免疫組織化取宮頸癌手術(shù)組織標(biāo)本，固定、脫水、透明、浸蠟后，石蠟包埋和連續(xù)切片，酒精、二甲苯脫蠟，100%、90%、80%、70%梯度酒精脫水，微波高壓熱修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，3%雙氧水溶液孵育10min，PBS沖洗，加入兔抗人一抗(抗RACK1、IQGAP1、β-catenin)，滴加羊抗兔二抗，室溫孵育30min，PBS反復(fù)沖洗3次。加入二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片后顯微鏡下觀察染色情況。PBS代替一抗為陰性對(duì)照。RACK1染色定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，IQGAP1染色定位于細(xì)胞膜，β-catenin染色定位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占比半定量法分析評(píng)估染色結(jié)果，見(jiàn)圖1(見(jiàn)插頁(yè))。陽(yáng)性細(xì)胞占比，<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～100%為3分；染色強(qiáng)度，無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色或黑色為3分。染色強(qiáng)度×陽(yáng)性占比評(píng)分>3分為陽(yáng)性，≤3分為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 基本臨床資料

患者年齡(46.9±10.2)歲(33～69歲)；分化程度高分化19例，中分化34例，低分化53例；病理類型鱗癌87例，腺癌29例；TNM分期I期39例，II期45例，III期22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例，無(wú)轉(zhuǎn)移39例；腫瘤直徑≥4cm58例，<4cm 48例。

2.2 宮頸癌組織中RACK1、IQGAP1、β-catenin mRNA的相對(duì)表達(dá)量

RT-PCR結(jié)果顯示，RACK1 mRNA在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，IQGAP1 mRNA、β-catenin mRNA在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同組織標(biāo)本中各蛋白 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 宮頸組織中RACK1、IQGAP1、β-catenin蛋白陽(yáng)性率比較

宮頸癌組織中RACK1蛋白陽(yáng)性率低于癌旁組織，IQGAP1、β-catenin蛋白陽(yáng)性率高于癌旁組織(均P<0.05)。見(jiàn)圖1(封三)、表3。

表3 不同組織中各蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較(%)

2.4 RACK1、IQGAP1表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

RACK1在高分化、TNM分期為I期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中陽(yáng)性率高于中低分化、TNM分期為II-III期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織(P<0.05)，但在不同年齡、病理類型、腫瘤直徑宮頸組織中陽(yáng)性率比較未見(jiàn)差異(P>0.05)；IQGAP1在中低分化、TNM分期為II-III期的宮頸癌組織中陽(yáng)性率高于高分化、TNM分期為I期組織(P<0.05)，但在不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸組織中陽(yáng)性率比較未見(jiàn)差異(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 RACK1、IQGAP1表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系[例(%)]

2.5 宮頸癌組織RACK1、IQGAP1表達(dá)與β-catenin的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，宮頸癌組織RACK1表達(dá)與β-catenin呈負(fù)相關(guān)(r=-0.405，P=0.000)，與β-catenin呈正相關(guān)(r=0.346，P=0.000)。

3 討論

宮頸癌為常見(jiàn)的一種生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，一旦診斷或治療延遲，易導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，甚至死亡[6]。目前宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚不完全清晰，多項(xiàng)研究顯示，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展影響因素較多，與多基因多信號(hào)通路蛋白表達(dá)異常有關(guān)[7-8]。

RACK1為調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的重要信號(hào)因子，可調(diào)控Src/NF-kB、PI3K/AKTA、Rho A/Rho、Src/Akt等多個(gè)信號(hào)通路[9]。既往報(bào)道顯示，RACK1在口腔鱗癌[10]、乳腺癌[11]中高表達(dá)，且與預(yù)后關(guān)系密切。本研究分析顯示，RACK1 mRNA在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，且RACK1蛋白陽(yáng)性率低于癌旁組織，提示RACK1在宮頸癌組織中低表達(dá)，與周小慶等[2]研究結(jié)果一致，但在胡娟等報(bào)道中，RACK1蛋白在宮頸癌中高表達(dá)，說(shuō)明RACK1在宮頸癌中的表達(dá)存在一定爭(zhēng)議，并且可能在不同惡性腫瘤中發(fā)揮不同作用。本研究進(jìn)一步分析顯示，RACK1在高分化、TNM分期為I期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中陽(yáng)性率高于中低分化、TNM分期為II-III期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但在不同年齡、病理類型、腫瘤直徑宮頸組織中陽(yáng)性率差異不顯著，提示RACK1表達(dá)與宮頸癌的發(fā)展、分化、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。

IQGAP1主要是由RasGTP酶活化蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域、鈣蛋白同源域、蛋白結(jié)構(gòu)域、C末端RasGAP相關(guān)結(jié)構(gòu)域及IQ域組成，在進(jìn)化過(guò)程中可與多種重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路結(jié)合，參與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等活動(dòng)[13]。本研究顯示，IQGAP1 mRNA在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率均高于癌旁組織，說(shuō)明IQGAP1可能通過(guò)高表達(dá)的方式參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步分顯示，IQGAP1在中低分化、TNM分期為II-III期的宮頸癌組織中陽(yáng)性率高于高分化、TNM分期I期組織，但在不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移宮頸組織中陽(yáng)性率差異不顯著，提示RACK1表達(dá)與宮頸癌的發(fā)展、分化等有關(guān)。其原因可能為IQGAP1可與原癌基因結(jié)合，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌，促進(jìn)血管生成，而新生血管可為腫瘤細(xì)胞的增殖、分裂提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)。

β-catenin為一種多功能細(xì)胞膜內(nèi)黏著蛋白，可調(diào)控腫瘤經(jīng)典途徑Wnt信號(hào)通路，而Wnt信號(hào)一旦激活可促進(jìn)細(xì)胞遷移、極化，從而誘發(fā)腫瘤[14]。既往研究[15]顯示，RACK1可調(diào)控Wnt/β-catenin通路，使β-catenin降解，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究中宮頸癌組織中RACK1表達(dá)與β-catenin呈負(fù)相關(guān)。既往研究[16]顯示，IQGAP1表達(dá)與β-catenin有關(guān)。本研究顯示，IQGAP1表達(dá)與β-catenin呈正相關(guān)，與高薔[17]等報(bào)道結(jié)果一致。說(shuō)明IQGAP1與β-catenin在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能有協(xié)同作用，IQGAPl可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使β-catenin累積，從而刺激下游增殖相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

綜上所述，宮頸癌組織中RACK1低表達(dá)，IQGAP1高表達(dá)；RACK1蛋白表達(dá)異?？赡芘c分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及β-catenin表達(dá)有關(guān)，IQGAP1蛋白表達(dá)異?？赡芘c分化程度、TNM分期及β-catenin表達(dá)有關(guān)。本研究仍有一定局限性，如研究樣本量較小，可能會(huì)影響RACK1、IQGAP1表達(dá)及與某些臨床病理特征的相關(guān)性；未分析RACK1、IQGAP1表達(dá)與β-catenin表達(dá)的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步探究。