黃娟，蔡俊

（發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430068）

氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）是由葡萄糖的一個(gè)羥基被氨基取代形成的一種重要的功能性單糖[1-4]，其廣泛存在于細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、植物和動(dòng)物中[5]。作為生物體內(nèi)多糖的重要單體之一，GlcN可有效治療關(guān)節(jié)炎，參與肝腎解毒和護(hù)肝[6-8]，還能抗衰老、刺激嬰兒腸道內(nèi)雙歧桿菌的生長、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌[9]。

目前國內(nèi)外生產(chǎn)GlcN主要有由蝦蟹殼或者真菌菌絲體酸、酶解[10-14]，工程菌發(fā)酵與真菌發(fā)酵這3種方法，但酸、酶解存在原料來源會(huì)引起過敏反應(yīng)[15]以及酶成本高等問題。工程菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN[16-19]已有大量研究，產(chǎn)量高且發(fā)酵周期短，在經(jīng)濟(jì)上占有優(yōu)勢，但工程菌有著表達(dá)系統(tǒng)不穩(wěn)定，表達(dá)產(chǎn)物無活性、易被降解，食品市場難以接受等普遍性缺點(diǎn)。Hsieh等[5]比較發(fā)現(xiàn)野生菌株Aspergillus sp.BCRC 31742是產(chǎn)GlcN的最佳菌株，通過對該菌株發(fā)酵條件、菌絲體狀態(tài)以及刺激因子等多方面提高其生物量[20-21]或者利用生產(chǎn)檸檬酸的廢棄菌絲體[22]從而獲得菌絲體中GlcN的方法，對于不接受用工程菌產(chǎn)GlcN的醫(yī)藥、食品市場而言具有可行性，但從絲狀真菌菌絲體中提取GlcN仍存在純度低、酶成本高以及發(fā)酵周期長等問題。Papagianni等[23]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵早期的發(fā)酵液中存在GlcN，在絲狀真菌發(fā)酵初級階段，細(xì)胞內(nèi)大量合成的GlcN會(huì)分泌到胞外，該現(xiàn)象為GlcN的生產(chǎn)提供了新思路。因此本文提出從絲狀真菌早期發(fā)酵液中提取獲得GlcN。

本研究從養(yǎng)蝦廠采集土壤樣品進(jìn)行篩選分離，得到一株胞外GlcN含量為1.537 g/L的菌株，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子學(xué)鑒定后確定為Aspergillus piperis，發(fā)酵12 h后發(fā)酵液中GlcN含量達(dá)到2.687 g/L，實(shí)現(xiàn)了GlcN胞外生產(chǎn)和積累。該策略解決了絲狀真菌發(fā)酵周期長、GlcN提取工藝中存在環(huán)境污染以及工程菌危害的問題，為綠色便捷獲得GlcN提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在湖北省潛江市小龍蝦養(yǎng)殖池中采集土樣。葡糖胺（分析純）、對二甲氨基苯甲醛（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；D-氨基半乳糖鹽酸鹽（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；10×擴(kuò)增緩沖液（10×PCR buffer，含 Mg2+）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：美國賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）；引物 ITS1（10 μmol/L）、ITS4（10 μmol/L）：南京金斯瑞生物科技股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[24]：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、pH7.0。

高氏一號培養(yǎng)基[25]：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g。用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，加入其他成分，溶化后補(bǔ)水至1 L。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[21]：土豆200 g、葡萄糖20 g。土豆去皮切塊煮沸0.5 h，然后用紗布過濾，再加葡萄糖并定容至1 L。

水瓊脂培養(yǎng)基平板[26]：瓊脂20 g、水1 L。

查氏培養(yǎng)基[27]：NaNO32 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖 30 g。

1.3 儀器與設(shè)備

SYNERGY2酶標(biāo)儀：基因生物技術(shù)國際貿(mào)易（上海）有限公司；Veriti實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國賽默飛世爾科技公司；沃特世2767-2545液質(zhì)聯(lián)用儀（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）：沃特世科技（上海）有限公司。

1.4 產(chǎn)GlcN菌株的分離篩選

1.4.1 菌株分離純化

取1 g土樣接入50 mL 0.9%NaCl溶液中并于搖床30℃，180 r/min培養(yǎng)2 h。將土樣液體進(jìn)行稀釋，梯度稀釋至 10-9倍，取 200 μL 10-7、10-8、10-9倍的稀釋液涂布在牛肉膏蛋白胨、PDA及高氏培養(yǎng)基的平板上，分別置于37、30、30℃內(nèi)培養(yǎng)。平板劃線分離直到劃分出單菌落。

1.4.2 產(chǎn)GlcN菌株初篩

將無菌濾紙貼在水瓊脂培養(yǎng)基平板上，純化后得到的菌株點(diǎn)種[28]在濾紙后培養(yǎng)1 d，將濾紙取出晾干進(jìn)行茚三酮顯色[29]。觀察點(diǎn)樣點(diǎn)及其周圍有無紫紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)，將顯色菌株標(biāo)記并進(jìn)行菌株復(fù)篩。

1.4.3 產(chǎn)GlcN菌株復(fù)篩

將復(fù)篩的細(xì)菌活化后接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30℃、180 r/min培養(yǎng)16 h。然后按照接種量4%接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30℃、180r/min發(fā)酵培養(yǎng)24 h。復(fù)篩的真菌活化后接入PDA培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)20h后以接種量4%接入查氏培養(yǎng)基，于37℃、180r/min發(fā)酵48 h。用Elson-Morgon法與LC-MS聯(lián)用儀分別對初篩菌株的發(fā)酵液進(jìn)行GlcN定量與定性分析。

Elson-Morgon法[30-31]：GlcN 與氨基半乳糖（galcosamine，GalN）兩種氨基己糖在100℃和25℃下經(jīng)堿性乙?；c對二甲氨基苯甲醛[p-（dimethylamino）-benzaldehyde，PDABA]反應(yīng)后因乙酰化程度不同而導(dǎo)致生色原含量不同，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出樣品中總氨基己糖與GalN的含量，兩者差值即為樣品中GlcN的含量。

LC-MS聯(lián)用條件[32]：發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。色譜條件為AtlantisT3，5 μm，100 ?（10 mm×150 mm），檢測器為Waters 2489 UV檢測器。流動(dòng)相為乙腈-0.01%氨水溶液梯度洗脫，流速為8 mL/min，進(jìn)樣量100 μL。質(zhì)譜條件為電噴霧正離子化（electron spray ionization，ESI）；特定離子（SIM）和質(zhì)譜全掃檢測。溫度為600℃；錐孔電壓為25 V；掃描范圍為質(zhì)荷比150～250。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 The conditions of gradient elution

1.5 菌種鑒定

1.5.1 形態(tài)特征觀察

通過菌株分離純化確定曲霉11為產(chǎn)GlcN菌。將目的菌株在PDA固體培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋涂布，30℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察并記錄其菌落特征。

1.5.2 分子學(xué)鑒定

將菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)24h后過濾收集菌體。根據(jù)Solarbio真菌基因組DNA提取試劑盒提取獲得曲霉11的全基因組。將提取的全基因組與南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成的引物 ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板 1 μL，10×擴(kuò)增緩沖液（10×PCR buffer）2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，引物 ITS1、ITS4 各1 μL，rTaq 酶 0.5 μL，加超純水補(bǔ)至 25 μL。PCR 擴(kuò)增條件為 98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，循環(huán) 35次，72℃5min。將 3 μLPCR產(chǎn)物與3 μL10×上樣緩沖液混合，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并送至北京擎科生物有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI中用BLAST在線同源性查詢軟件與GenBank中已登錄的ITS區(qū)基因組進(jìn)行同源性比較，用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包MEGA5.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，并以Neighbor-Joinging法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該菌株的分類地位。

1.6 曲霉11生長曲線的繪制

曲霉11斜面經(jīng)PDA液體培養(yǎng)基活化后以接種量4%接入50 mL的PDA液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)，周期取樣測干重。以培養(yǎng)時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，干重（g）為縱坐標(biāo)繪制曲霉11的生長曲線。

1.7 曲霉11發(fā)酵條件優(yōu)化

通過對產(chǎn)GlcN菌種的篩選確定曲霉11的發(fā)酵液中GlcN含量為1.537 g/L，對曲霉11的發(fā)酵條件即發(fā)酵周期、發(fā)酵pH值、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、發(fā)酵溫度及接種量等方面進(jìn)行優(yōu)化以進(jìn)一步提高發(fā)酵液中的GlcN含量并探究發(fā)酵優(yōu)化過程中菌體的干重與發(fā)酵液中GlcN含量的關(guān)系。

1.8 數(shù)據(jù)處理

取3次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值并計(jì)算其誤差，用Origin 8.0軟件畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)GlcN菌株的分離篩選

2.1.1 菌株初篩結(jié)果

共分離得到菌種16株，其中在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基篩得菌株4種，高氏培養(yǎng)基篩得4種，PDA培養(yǎng)基種篩得8種。采用茚三酮顯色法對分離得到的16株菌種進(jìn)行產(chǎn)GlcN能力的初篩，結(jié)果見圖1。

圖1 GlcN標(biāo)樣顯色圖與各菌株紙層析顯色圖Fig.1 Color diagram of strains and GlcN standard sample

由圖1可知，共有10株菌種的周圍有紫紅色，這表明其產(chǎn)物能與茚三酮發(fā)生顏色反應(yīng)。因此選擇這10株菌進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

氨基己糖在100℃與25℃反應(yīng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各菌株胞外GlcN含量。

圖2 氨基己糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of hexosamine

初篩菌株胞外GlcN產(chǎn)量見表2。

表2 初篩菌株胞外GlcN產(chǎn)量Table 2 Yield of extracellular GlcN in selected strains

由表2可知，曲霉11胞外GlcN含量最高，為1.537 g/L，對曲霉11的發(fā)酵液進(jìn)行GlcN定性分析。

用LC-MS聯(lián)用儀對曲霉11的發(fā)酵液進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵液液相色譜-質(zhì)譜圖Fig.3 Liquid chromatograph-mass spectrometer of fermented liquid

由圖3可知，SIR檢測出0.9 min～1.3 min內(nèi)有質(zhì)荷比為180的離子峰，減去H+的質(zhì)量1，該時(shí)間段檢測物質(zhì)與GlcN標(biāo)品的分子量179相符，且該時(shí)間段質(zhì)譜出峰時(shí)間與液相色譜出峰時(shí)間對應(yīng)良好。

2.2 菌種鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征觀察

曲霉11菌落形態(tài)和顯微鏡下形態(tài)見圖4。

圖4 曲霉11形態(tài)Fig.4 Morphology of the strain 11

如圖4所示，曲霉11在PDA固體培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)48 h后，菌落開始為白色，菌落中央逐漸出現(xiàn)很淡的黃色，最后變?yōu)榇纸q狀黑色或黑褐色，背面淡黃色。曲霉11在顯微鏡下觀察菌體菌絲發(fā)達(dá)多分枝。分生孢子梗自基質(zhì)中伸出，頂部形成黑褐色放射狀球形頂囊。

2.2.2 分子學(xué)鑒定

曲霉11的PCR電泳見圖5。

由圖5比對可得曲霉11的ITS區(qū)基因片段大致為600 bp。

圖5 曲霉11的PCR電泳Fig.5 PCR electropherogram of strain 11

曲霉11的進(jìn)化樹分析結(jié)果見圖6。

圖6 曲霉11的進(jìn)化樹分析結(jié)果Fig.6 Phylogenetic tree of strain 11 based on ITS DNA sequences

由圖6可知，該菌株的ITS序列與Aspergillus piperis的基因序列同源性最高，為100%。結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)特征和分子學(xué)鑒定結(jié)果，可初步判定該菌株為曲霉屬。

2.3 曲霉11生長曲線

曲霉11的生長曲線見圖7。

圖7 曲霉11的生長曲線Fig.7 The growth curve of Strain 11

如圖7所示，8 h～32 h為此菌株的對數(shù)生長期，選擇生長到第32小時(shí)的菌液做為種子轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.4 曲霉11發(fā)酵條件與產(chǎn)GlcN含量的關(guān)系

發(fā)酵條件對曲霉11產(chǎn)氨基葡萄糖的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵條件對曲霉11產(chǎn)氨基葡萄糖的影響Fig.8 Effect of fermentation conditions on producing glucosamine by Aspergillus 11

由圖8A可知，發(fā)酵0～12 h時(shí)曲霉11發(fā)酵液中GlcN的含量急速增長，發(fā)酵12 h后GlcN含量迅速減少直至發(fā)酵72 h速度減緩。曲霉11的干重從8 h開始增長，到24 h后增長速度減緩直至96 h進(jìn)入平穩(wěn)期。發(fā)酵過程中測得12 h時(shí)發(fā)酵液中GlcN含量最高，為2.362 g/L，此時(shí)干重為0.16 g，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化其他發(fā)酵條件。由圖8B、圖8C、圖8D、圖8E、圖8F可知，隨著發(fā)酵pH值、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量、發(fā)酵溫度的增加，發(fā)酵液中GlcN的含量都先增后減，其中接種量對GlcN含量影響最明顯，搖床轉(zhuǎn)速幾乎無明顯影響，其他條件對GlcN含量影響較小。在優(yōu)化過程中，裝液量與發(fā)酵溫度對干重的影響比發(fā)酵pH值和搖床轉(zhuǎn)速對干重的影響要大。最終確定在發(fā)酵時(shí)間12 h、發(fā)酵 pH3.0、搖床轉(zhuǎn)速 180 r/min、裝液量 50 mL（250 mL）、發(fā)酵溫度25℃、接種量8%時(shí)，發(fā)酵液中GlcN的含量最高為2.687 g/L，干重為0.134 g。

發(fā)酵初期GlcN的大量合成導(dǎo)致干重的迅速增加，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長、干重的增加，發(fā)酵液中GlcN含量逐漸下降。發(fā)酵pH值過低會(huì)影響菌株的生長狀態(tài)以及物質(zhì)合成速度，當(dāng)發(fā)酵pH值逐漸適于菌株生長時(shí)，菌株的干重會(huì)逐漸增大，合成的GlcN會(huì)大量應(yīng)用于菌體生長。所以隨著發(fā)酵pH值的增加，發(fā)酵液中GlcN含量逐漸減少而干重增加。高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力、傳質(zhì)速度、溶氧度和高溫等條件都會(huì)影響菌體的生長狀態(tài)以及代謝產(chǎn)物的合成與積累，甚至?xí)?dǎo)致菌體自溶，因此搖床轉(zhuǎn)速、裝液量以及發(fā)酵溫度會(huì)明顯影響干重，但幾乎不影響GlcN含量。干重與GlcN含量隨著接種量的增大而明顯增大，但接種量過大會(huì)導(dǎo)致GlcN含量的減少且干重增長速度減緩。

3 結(jié)論與展望

本文通過茚三酮顯色初篩以及Elson-Morgon、液質(zhì)聯(lián)用的復(fù)篩試驗(yàn)從土壤中分離篩選得到一株胞外產(chǎn)GlcN量為1.537g/L的曲霉11，對該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察以及分子學(xué)鑒定，將其鑒定為Aspergillus piperis。通過測定曲霉11的生長曲線以及優(yōu)化曲霉11的發(fā)酵條件，最終使得曲霉11在發(fā)酵時(shí)間12 h、發(fā)酵pH3.0、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵溫度25℃、接種量8%的條件下GlcN產(chǎn)量為2.687 g/L，是優(yōu)化前的1.75倍。

在曲霉11發(fā)酵初期，細(xì)胞內(nèi)大量合成積累GlcN以用于曲霉11干重的增長，干重的增長相對于GlcN含量的增長具有滯后性而且干重的增長會(huì)導(dǎo)致GlcN胞外含量的減少。條件優(yōu)化時(shí)，發(fā)現(xiàn)在不利于菌體生長的條件（發(fā)酵pH值過低、發(fā)酵溫度較高）下，菌體的干重雖然較少但胞外GlcN含量并未減少。因此猜想胞外GlcN含量在不利于菌體生長的條件下也會(huì)有所提高。

本文根據(jù)黑曲霉產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵早期的發(fā)酵液中存在GlcN這一現(xiàn)象，通過菌種篩選及GlcN的定量、定性試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了絲狀真菌胞外提取GlcN并通過發(fā)酵條件優(yōu)化提高了胞外GlcN產(chǎn)量。在優(yōu)化過程中提出了胞外GlcN含量會(huì)在不利于菌體生長的條件下有所提高這一新想法，因此后續(xù)可從GlcN合成途徑的強(qiáng)化、GlcN合成途徑支路的抑制、抑制細(xì)胞壁合成等不利于菌體生長的條件下進(jìn)一步提高胞外GlcN的產(chǎn)量。