張明坤，王哲，楊柳，侯蘭，張聚良

（中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 甲乳血管外科，陜西 西安 710032）

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020 年全球約有1 930 萬新增癌癥病例和1 000 萬癌癥死亡病例，其中發(fā)病數(shù)最多的是女性乳腺癌（226 萬例）[1]。保乳手術(shù)能夠保留患者的乳房外形，極大地改善患者術(shù)后的心理狀態(tài)和生活質(zhì)量現(xiàn)已成為乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方式之一。van Maaren 等[2]研究表明，接受保乳手術(shù)及術(shù)后放療的乳腺癌患者的10 年總生存及10 年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存均優(yōu)于接受乳房全切治療的患者。1988—1998 年，美國(guó)的保乳率從18.7% 升至64.5%[3]。但在我國(guó)，僅有5.5% 的醫(yī)院保乳率在40% 以上，有50% 的醫(yī)院保乳率不到20%，有16.3%的醫(yī)院保乳率不到10%，而且保乳率高低與醫(yī)院所在地區(qū)人均GDP 和醫(yī)院年手術(shù)量呈正相關(guān)[4]。目前，我國(guó)保乳率低的主要原因是醫(yī)師對(duì)保乳治療經(jīng)驗(yàn)不足，擔(dān)心保乳術(shù)后局部復(fù)發(fā)率增加，將保乳治療的適應(yīng)證控制得過于嚴(yán)格，由于我國(guó)在保乳治療方面起步相對(duì)較晚，所以即便是在我國(guó)的一些城市地區(qū)保乳經(jīng)驗(yàn)缺乏仍屬于普遍現(xiàn)象，農(nóng)村地區(qū)更是如此[5]。因此，分析保乳術(shù)后乳腺癌患者局部復(fù)發(fā)的高危因素，并建立相關(guān)臨床預(yù)測(cè)模型，對(duì)于提高保乳率，改善患者術(shù)后生活治療有重要意義。

遺傳性乳腺癌占所有乳腺癌病例的5%～10%[6]。在遺傳性乳腺癌中，BRCA1/2 突變是最常見的致病突變，并以常染色體顯性方式遺傳[7]。BRCA1/2 是與乳腺癌密切相關(guān)的易感基因，到70 歲時(shí)，BRCA1 突變使乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加65%，BRCA2 突變使乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加45%[8]。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，BRCA1/2 突變并不影響乳腺癌患者的總生存，但BRCA1/2 突變對(duì)于保乳術(shù)后同側(cè)乳腺腫瘤復(fù)發(fā)的影響尚有爭(zhēng)議[9]，NCCN 指南[10]中也僅將BRCA1/2突變列為保乳手術(shù)的相對(duì)禁忌證。本研究回顧性分析了189 例接受保乳手術(shù)乳腺癌患者的BRCA1/2突變及相關(guān)臨床病理因素與局部復(fù)發(fā)的相關(guān)性，并構(gòu)建列線圖模型來預(yù)測(cè)患者的無局部復(fù)發(fā)生存（local recurrence free survival，LRFS）率，為患者的手術(shù)方式選擇及個(gè)體化診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料收集

收集2014 年6 月—2016 年6 月中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的189 例乳腺癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 病理確診為乳腺癌的女性患者；⑵ 接受保乳手術(shù)，并接受標(biāo)準(zhǔn)方案的術(shù)后放療；⑶ 接受系統(tǒng)性的全身治療，包括化療，內(nèi)分泌治療，靶向治療等；⑷ 有完整的臨床病理及隨訪資料。本研究獲得了所有參與者的知情同意，并經(jīng)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：KY20212051-C-1。

1.2 方法

1.2.1 BRCA1/2 檢測(cè) ⑴ 樣本采集與提取：EDTA抗凝管采集患者外周靜脈血2 mL，（-20±5）℃條件下低溫保存。應(yīng)用廈門艾德新鮮血液核酸提取試劑盒對(duì)全血樣本進(jìn)行DNA 提取，洗脫體積為100 μL，樣本濃度>5 ng/μL，總量>450 ng。⑵ 文庫構(gòu)建：應(yīng)用廈門艾德人類BRCA1 基因和BRCA2基因突變檢測(cè)試劑盒體外定性檢測(cè)患者外周血樣本DNA 中BRCA1/2 的突變情況。檢測(cè)范圍包括BRCA1 基因和BRCA2 基因的全編碼區(qū)（BRCA1 基因外顯子2、3、5～24，BRCA2 基因外顯子2～27）及外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)、UTR 區(qū)（非翻譯區(qū)）和啟動(dòng)子區(qū)的點(diǎn)突變和插入缺失突變。⑶ 測(cè)序及分析：使用Illumina MiSeq Dx 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)應(yīng)用人類12 基因高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件（ADXBRCA 模塊）進(jìn)行分析。

1.2.2 隨訪 隨訪方式為門診隨訪和電話隨訪，隨訪時(shí)間為47～71 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間61 個(gè)月。隨訪截止至2021 年6 月。隨訪內(nèi)容：腫瘤有無局部復(fù)發(fā)，及復(fù)發(fā)的時(shí)間，生存狀況。死亡患者需記錄死亡時(shí)間及死因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R 軟件（4.0.3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制列線圖。采用χ2檢驗(yàn)和Fisher 精確檢驗(yàn)比較不同臨床病理特征下BRCA1/2 突變的差異，對(duì)于等級(jí)資料進(jìn)行Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)，連續(xù)資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier 法計(jì)算LRFS 率，Log-rank 法檢驗(yàn)評(píng)價(jià)各變量的不同亞組生存差異。通過單因素及多因素Cox 等比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響保乳術(shù)后乳腺癌患者局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，通過C-index、校準(zhǔn)曲線和臨床決策曲線分析（decision curve analysis，DCA）驗(yàn)證模型的可靠性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BRCA1/2 基因突變?nèi)橄侔┗颊叩呐R床病理特征

189 例患者中有16 例BRCA1/2 致病突變陽性，其中BRCA1 突變14 例，BRCA2 突變2 例。未突變組的平均年齡為54 歲，突變組的平均年齡為44 歲，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）。突變組和未突變組的分子分型進(jìn)行比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（表1）。

表1 BRCA1/2突變和未突變患者的臨床病理特征[n（%）]Table 1 Clinicopathologic features of BRCA1/2 mutant and non-mutant patients [n (%)]

2.2 BRCA1/2 突變及其他因素對(duì)保乳術(shù)后乳腺癌患者局部復(fù)發(fā)的影響

在189 例患者中，對(duì)BRCA1/2 突變及其他因素進(jìn)行Cox 單因素分析，結(jié)果顯示：BRCA1/2 突變、腫瘤分級(jí)、腫瘤大小、N 分期及分子分型等5 個(gè)變量是保乳術(shù)后乳腺癌患者LRFS 率的影響因素（P<0.1）。將單因素Cox 回歸篩選的5 個(gè)變量納入多因素Cox 回歸模型，經(jīng)向后法逐步回歸AIC 分析后結(jié)果顯示：BRCA1/2 突變、腫瘤大小、N 分期及分子分型等4 個(gè)變量是保乳術(shù)后乳腺癌患者LRFS 率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）（表2）?；贙aplan-Meier和Log-rank 檢驗(yàn)方法，利用Cox 風(fēng)險(xiǎn)模型繪制出各主要變量的生存曲線（圖1）。

圖1 篩選因素對(duì)患者LRFS率影響的生存曲線分析Figure 1 Survival curve analysis of influences of the main variables on the LRFS of patients

表2 影響保乳術(shù)后乳腺癌患者LRFS 率的單因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of factors for LRFS in breast cancer patients undergoing breast conserving surgery

2.3 保乳術(shù)后乳腺癌患者LRFS 率列線圖模型的構(gòu)建

基于Cox 等比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析的結(jié)果（圖2），構(gòu)建保乳術(shù)后乳腺癌患者LRFS 率的列線圖預(yù)測(cè)模型（圖3）。將列線圖中各個(gè)變量所得分值相加的總分可預(yù)測(cè)保乳術(shù)后乳腺癌患者3 年和5 年的LRFS 率。

圖2 LRFS率高危因素的森林圖Figure 2 Forest map of high-risk factors of LRFS

圖3 LRFS率列線圖預(yù)測(cè)模型Figure 3 Nomogram prediction model of LRFS

2.4 列線圖預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證

構(gòu)建模型的C-index 為0.86，經(jīng)bootstrap 法自助抽樣1 000 次內(nèi)部驗(yàn)證C-index 為0.81，顯示模型具有較好的區(qū)分度。對(duì)保乳術(shù)后乳腺癌患者3 年及5 年的LRFS 率預(yù)測(cè)進(jìn)行ROC 曲線分析，曲線下面積（area under curve，AUC）分別為：0.89 和0.85，顯示模型具有較好的準(zhǔn)確度（圖4）。為評(píng)估模型是否存在過度擬合，在模型中，分別根據(jù)患者的3 年和5 年LRFS 率繪制校準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示所有的校正曲線均與理想曲線有較好的吻合度，提示模型預(yù)測(cè)有較好的校準(zhǔn)度和準(zhǔn)確性（圖5）。

圖4 模型的3、5年LRFS率的ROC曲線分析Figure 4 ROC curve analysis of the model on 3-and 5-year LRFS

圖5 模型的3、5年LRFS率的校準(zhǔn)曲線Figure 5 Calibration curves of the model on 3-year and 5-year LRFS

2.5 列線圖預(yù)測(cè)模型的臨床決策曲線分析

針對(duì)列線圖模型的3 年及5 年的LRFS 率分別繪制DCA 曲線，其中黑色橫線代表所有樣本均為陰性、獲益為0，灰色斜線表示所有樣本均為陽性，虛線為模型的凈獲益情況，無論是3 年還是5 年的預(yù)測(cè)LRFS 率，模型的臨床凈獲益均較高，顯示模型的臨床效能較好（圖6）。

圖6 保乳術(shù)后乳腺癌患者的3年和5年LRFS率的DCA曲線Figure 6 DCA curve of 3-and 5-year LRFS in breast cancer patients undergoing breast conserving surgery

3 討 論

大多數(shù)文獻(xiàn)[11-14]報(bào)道中，BRCA1/2 基因在乳腺癌患者中的突變率約為0.85%～3.0%,而本研究中，BRCA1/2 突變率為8.47%，這可能與我國(guó)乳腺癌患者平均年齡較低有關(guān) 。研究[15]表明，乳腺癌患者的年齡越小，BRCA1/2 基因的突變率越高，于洗河等[16]研究顯示，中國(guó)女性乳腺癌的發(fā)病高峰年齡為55～59 歲，而本研究中，所有患者的平均年齡為52 歲，均遠(yuǎn)低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的65～74 歲[17]。同時(shí)，在本研究中，BRCA1/2 突變患者的平均年齡為44 歲，明顯小于BRCA1/2 未突變的患者的54 歲，這與Zhang 等[18]研究相符合。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者不同的分子分型中BRCA1/2 基因的突變率有明顯差異，其中，三陰性乳腺癌中BRCA1/2 突變率高達(dá)26%，明顯高于其他各分型，這與北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺中心實(shí)驗(yàn)室的研究[19]結(jié)果相符，該研究中發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)年輕乳腺癌患者和三陰性乳腺癌患者BRCA1/2 基因的突變率分別可達(dá)23% 和20%。BRCA1/2 基因突變與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，BRCA1/2 蛋白在細(xì)胞分裂過程中對(duì)染色體結(jié)構(gòu)和基因序列的完整性起到監(jiān)護(hù)作用，從而預(yù)防腫瘤的發(fā)生[20-21]。BRCA1/2 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)HR 修復(fù)不可或缺的因子，當(dāng)BRCA1/2 缺失時(shí)，DNA 損傷會(huì)引發(fā)非忠實(shí)性修復(fù)，如非同源末端鏈接修復(fù)（nonhomologous end joining，NHEJ）或微同源末端鏈接修復(fù)（microhomology-mediated endjoining，MHEJ）[22-23]。

保乳手術(shù)已成為乳腺癌的重要手術(shù)方式之一，如何在提高保乳率，改善患者的生活質(zhì)量的同時(shí)減少患者術(shù)后的局部復(fù)發(fā)率是乳腺癌治療的重大挑戰(zhàn)，如果能在術(shù)前預(yù)測(cè)出乳腺癌患者接受保乳手術(shù)后的局部復(fù)發(fā)率，將對(duì)手術(shù)方式的選擇提供重要的科學(xué)依據(jù)。列線圖是多因素預(yù)后模型的圖形表現(xiàn)形式，可用來個(gè)體化預(yù)測(cè)特點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)患者的生存情況[24]。列線圖作為一種新型預(yù)測(cè)模型，與傳統(tǒng)預(yù)測(cè)方法相比，準(zhǔn)確性更高，適應(yīng)性更廣，并且易于推廣[25]。已被廣泛應(yīng)用于口咽癌[26]、胃癌[27]、乳腺癌[28]和肺癌[29]等多種癌癥的預(yù)后預(yù)測(cè)。本研究中，構(gòu)建了列線圖模型來預(yù)測(cè)接受保乳手術(shù)的乳腺癌患者術(shù)后的局部復(fù)發(fā)率，并通過C-index、ROC 曲線、校準(zhǔn)曲線以及DCA 曲線分析來評(píng)估模型的區(qū)分度和準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，構(gòu)建的列線圖模型具有較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)能力，能夠有效地指導(dǎo)臨床決策。

Vallard 等[30]研究顯示，BRCA1/2 突變的患者，無論是接受保乳手術(shù)還是乳房全切手術(shù)，局部復(fù)發(fā)率和總生存率都沒有明顯差異。但Davey 等[31]研究表明，BRCA1/2 突變的乳腺癌患者接受保乳手術(shù)與乳房全切手術(shù)相比，局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增了4.54 倍（95%CI=2.77～7.42，P<0.001）。本研究結(jié)果與Davey等[31]的研究結(jié)果相符，本研究顯示BRCA1/2 突變是保乳術(shù)后乳腺癌患者局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，腫瘤大小、N 分期及分子分型也是保乳術(shù)后乳腺癌患者局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。腫瘤越大，N 分期越高，患者的局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)越高；三陰性乳腺癌的局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也明顯高于其他類型的乳腺癌，這與既往的研究結(jié)果相符[32]。

綜上所述，本研究通過分析189 例接受保乳手術(shù)的乳腺癌患者的臨床病理資料及BRCA1/2 突變情況，確立了BRCA1/2 突變、腫瘤大小、N 分期和分子分型是保乳術(shù)后乳腺癌患者局部復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，將這些因素納入并構(gòu)建列線圖預(yù)測(cè)模型，能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的3、5 年LRFS 率，為臨床的個(gè)體化診療提供科學(xué)依據(jù)。但本研究仍存在一些局限性，由于本研究的樣本量較少，導(dǎo)致BRCA1/2突變陽性的樣本也較少，這些都會(huì)影響臨床預(yù)測(cè)模型的區(qū)分度和準(zhǔn)確性，同時(shí)，由于本研究中分析的都是2014—2016 年的患者，時(shí)間較為久遠(yuǎn)，一些重要的影響預(yù)后的因素未能納入，例如是否進(jìn)行新輔助化療、新輔助治療的方案及腫瘤退縮模式等，可能會(huì)增加偏倚的風(fēng)險(xiǎn)。因此，未來可能需要更大樣本量的研究，進(jìn)行更全面的分析，對(duì)模型進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。