宋創(chuàng)業(yè),孟艷林,劉冰,劉攀云,李偉,嚴(yán)麗,李曉武,苗建軍,尚培中
(中國人民解放軍陸軍第八十一集團(tuán)軍醫(yī)院 1.普通外科 2.疾病預(yù)防控制科 3.內(nèi)分泌科 4.病理科,河北 張家口 075000;5.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 腺體外科,河北 石家莊 050000)
甲狀腺癌(thyroid carcinoma,TC)是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率逐年遞增[1]。在臨床常見的4 種組織病理學(xué)分型中,甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)最為多發(fā),約占全部TC 的60%~70%[2]。絕大多數(shù)PTC 進(jìn)展緩慢、惡性度低、預(yù)后良好,但有少數(shù)患者仍可并發(fā)淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移,是造成患者術(shù)后復(fù)發(fā)、生存質(zhì)量下降的重要原因[3-5],此類患者放射性碘治療無效,預(yù)后較差[6]。臨床上把腫瘤直徑≤1 cm 的PTC 定義為甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma,PTMC)[7-8],雖生長緩慢,但常伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[9],對于術(shù)前查體及影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(cN0)的PTMC 患者,常規(guī)行預(yù)防性中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃,可以清除潛在的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),手術(shù)更加徹底并能降低再手術(shù)的發(fā)生率,但同時可導(dǎo)致神經(jīng)損傷、乳糜漏、甲狀旁腺功能減退等手術(shù)并發(fā)癥的增加。有學(xué)者[10-11]認(rèn)為,BRAFV600E突變及Wnt/β-catenin 信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)異常,可能與PTMC 發(fā)生發(fā)展、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究為進(jìn)一步探討cN0 期PTMC 中BRAFV600E突變及β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)情況與PTMC 的發(fā)生發(fā)展及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
選取2018 年3 月—2021 年9 月收治經(jīng)手術(shù)治療的cN0 期PTMC 患者120 例,留取癌灶組織、癌旁組織及淋巴結(jié)標(biāo)本,癌旁組織取自距癌灶邊緣2 cm 以上的正常甲狀腺組織,淋巴結(jié)為中央?yún)^(qū)(Ⅵ區(qū))組織。其中男31 例,女89 例;年齡23~76 歲,平均年齡(53.5±12.7)歲,病變位于甲狀腺左葉36 例,右葉69 例,雙葉均有病變15 例。手術(shù)方式:甲狀腺全切+雙側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)15 例,甲狀腺全切+患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)37 例,甲狀腺腺葉、峽部切除+患側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃術(shù)68 例。納入標(biāo)準(zhǔn):⑴ 首次就診;⑵ 術(shù)前查體、B 超、CT 等影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(cN0 期);⑶ 行甲狀腺切除術(shù)及pCLND;⑷ 切除甲狀腺組織經(jīng)病理證實(shí)為PTMC;⑸ 手術(shù)前后相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果無缺失。排除標(biāo)準(zhǔn):⑴ 非原發(fā)病變;⑵ 既往有PTMC 手術(shù)治療史;⑶ 合并其他惡性腫瘤;⑷ 伴有血液、免疫系統(tǒng)缺陷性疾?。虎?急慢性感染或近期應(yīng)用免疫抑制劑等相關(guān)治療藥物。
Ventana 全自動免疫組化染色儀(美國Ventana公司);兔單克隆陰性質(zhì)控抗體、鼠單克隆抗體試劑、OptiView IHC 檢測試劑盒及擴(kuò)增試劑盒(美國Roche 公司);兔抗人β-catenin、cyclin D1 多克隆抗體(美國Santa Cruz 公司);BenchMarkXT 全自動切片染色機(jī)(美國Ventana 公司)。
1.3.1 BRAFV600E蛋白檢測 采用Ventana 全自動免疫組化染色儀對標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色,檢測BRAFV600E蛋白的表達(dá)情況。取組織樣本用4%中性甲醛固定,常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋,進(jìn)行4 μm 切片。依據(jù)Ventana 全自動染色說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,蘇木精染色5 min 后,顯微鏡下觀察染色。結(jié)果判定:BRAFV600E陽性定位于細(xì)胞質(zhì),100 倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個視野,根據(jù)細(xì)胞著色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞占整張切片同類型細(xì)胞的百分比進(jìn)行分級。分別采用雙盲評分法及陽性細(xì)胞所占同型細(xì)胞的百分比進(jìn)行評分。細(xì)胞著色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn):0 分:無著色;1 分:淡黃色;2 分:棕黃色;3 分:棕褐色。陽性細(xì)胞所占百分比評分標(biāo)準(zhǔn):1 分:陽性細(xì)胞≤10%;2 分:陽性細(xì)胞占11%~49%;3 分:陽性細(xì)胞占50%~79%;4 分:陽性細(xì)胞占比≥80%。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):將兩種評分相乘進(jìn)行總體評分:0~4 分為低表達(dá),定義為陰性;5~12 分為高表達(dá),定義為陽性。
1.3.2 β-catenin、cyclin D1 蛋白檢測 取液氮凍存的PTMC 組織和癌旁組織放入預(yù)冷4%多聚甲醛固定24 h、制成石蠟切片,10%山羊血清室溫封閉1 h,分別滴加β-catenin、cyclin D1 抗體4 ℃孵育過夜,次日蒸餾水漂洗3 次,滴加二抗復(fù)合物室溫孵育1 h,二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木精復(fù)染或不復(fù)染,脫水、透明、封片,顯微鏡觀察并攝片。結(jié)果判定:β-catenin 主要定位于細(xì)胞質(zhì),而cyclin D1 定位于細(xì)胞核。染色陽性是指細(xì)胞核淡黃色至棕褐色著色,僅胞質(zhì)染色視為陰性。綜合判斷高倍鏡下陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度評分。按染色強(qiáng)度評分:無著色為0 分,淡黃色為1 分,棕黃色為2 分,棕褐色為3 分。按陽性細(xì)胞百分率評分:高倍鏡下隨機(jī)選取5 個視野取陽性細(xì)胞數(shù)之平均數(shù)為該例陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果,陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0 分,6%~25%為1 分,26%~50%為2 分,51%~75%為3 分,>75%為4 分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘:0~4 分為低表達(dá),定義為陰性;5~12 分為高表達(dá),定義為陽性。
采用IBM SPSS 23.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示,數(shù)據(jù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
檢測結(jié)果顯示:BRAFV600E蛋白定位于PTMC細(xì)胞質(zhì),在PTMC 組織中呈陽性表達(dá),在癌旁組織中呈陰性表達(dá);β-catenin 蛋白主要表達(dá)于PTMC細(xì)胞質(zhì)中,部分癌旁組織細(xì)胞核內(nèi)也可見表達(dá);cyclin D1 蛋白主要表達(dá)于PTMC 細(xì)胞核內(nèi),在癌旁組織中呈陰性表達(dá)(圖1)。
圖1 免疫組化檢測(×100)Figure 1 Immunohistochemical staining (×100)
在PTMC 組織中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白呈高表達(dá),陽性表達(dá)率分別為70%、35.8%、57.5%,在癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為31.7%、20.8%、34.2%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。
表1 PTMC和癌旁組織中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)比較Table 1 Comparison of BRAFV600E,β-catenin and cyclin D1 protein expression in PTMC and paracancer tissues
PTMC 組織中,BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白陽性表達(dá)與性別、年齡無關(guān)(均P>0.05);cyclin D1 蛋白陽性表達(dá)與腫瘤直徑有關(guān),BRAFV600E蛋白陽性表達(dá)與病灶數(shù)目有關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);而BRAFV600E、β-catenin 蛋白表達(dá)陽性率與腫瘤直徑無關(guān)(均P>0.05);β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)陽性率與病灶數(shù)目無關(guān)(均P>0.05);BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白陽性表達(dá)均與頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P<0.05)(表2)。
表2 BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1蛋白表達(dá)與PTMC臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]Table 2 Relations of BRAFV600E,β-catenin and cyclin D1 protein expressions with the clinicopathologic feature of PTMC [n(%)]
TC 是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,約占所有內(nèi)分泌腫瘤的95%,占全身實(shí)體惡性腫瘤的1%[12]。PTC 是臨床常見的TC 病理分型,生長緩慢,多見于年輕女性,預(yù)后良好,被稱為“良性癌癥”[13-14]。臨床上把腫瘤直徑≤1 cm 的PTC 稱為PTMC,在我國每年新發(fā)PTC 中約30%~40%的患者為PTMC,部分PTMC 病變可呈現(xiàn)出高侵襲性生物學(xué)行為,而并非單純的PTC 早期病變,且常伴有中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(central lymph node metastasis,CLNM),CLNM 發(fā)生率可高達(dá)30%以上[15-16]。有學(xué)者[17-20]認(rèn)為,PTMC 的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移可能與BRAFV600E基因突變、Wnt/β-catenin 信號通路蛋白表達(dá)異常有關(guān)。
BRAF 基因,即鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1),位于人類7 號染色體上,編碼RAF 家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(motigen-activated proteinkinase/extracelluar regulated protein kinase,MAPK/ERK)信號通路,影響細(xì)胞的分裂和分化,是人類最重要的原癌基因之一[21-22]。BRAFT1799A點(diǎn)突變是最常見的BRAF 基因突變類型,是指第15 位外顯子第1 799 位脫氧核苷酸上的胸腺嘧啶(T)被替換為鳥嘌呤(A),導(dǎo)致蛋白質(zhì)第600 位的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)所代替,即BRAFV600E突變,BRAFV600E突變可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的無限增殖和分化[23]。有研究[24]表明,PTC 病變組織中BRAFV600E突變率保持在較高水平,且有明顯的增長趨勢。另有學(xué)者[25-26]認(rèn)為,BRAF 基因是PTC 特異度較高的分子標(biāo)志物。本研究檢測結(jié)果顯示,BRAFV600E突變蛋白在PTMC 組病變組織中陽性率高達(dá)70.0%,而在癌旁組織中陽性率為31.8%(P<0.05);亦證實(shí)BRAFV600E突變在cN0 期PTMC 發(fā)生、進(jìn)展及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起重要作用(P<0.05)。
臨床上對Wnt/β-catenin 信號通路研究較多且較深入,Wnt/β-catenin 信號通路也叫經(jīng)典Wnt 信號途徑,具體過程是:當(dāng)經(jīng)典的Wnt 信號通路被激活后,分泌到細(xì)胞外的Wnt 與跨膜受體LRP5/6 以及Fzd 結(jié)合形成復(fù)合物并激活受體,進(jìn)而激活胞內(nèi)的Dishevelled 蛋白(Dsh),導(dǎo)致糖原合成酶3(glycogensynthasekinase-3,GSK-3,GSK-3)活性受到抑制使其從axin 上脫落,阻止β-catenin 降解復(fù)合體(主要由APC、axin、GSK-3 構(gòu)成)的形成,故β-catenin 也不會被磷酸化和降解,使胞內(nèi)β-catenin表達(dá)升高。當(dāng)胞內(nèi)β-catenin 達(dá)到一定水平時,游離β-catenin 發(fā)生核轉(zhuǎn)移,與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF 結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體,最終實(shí)現(xiàn)某些 特定基因(如C-myc、cyclin D1、MMP-7、CD44、survivin、PPAR-γ、生長因子等)表達(dá)的增強(qiáng)或減弱。Wnt/β-catenin 信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程中起著重要作用,亦是細(xì)胞生長增殖調(diào)控的關(guān)鍵途徑[27-28]。cyclin D1 是Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的靶基因,在多種腫瘤中cyclin D1 過表達(dá),β-catenin的異常表達(dá)均和Wnt 突變有密切聯(lián)系。有研究[29-31]證實(shí),Wnt/β-catenin 信號通路的異常激活在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,且惡性腫瘤組織中β-catenin、cyclin D1 蛋白陽性表達(dá)均顯著高于癌旁組織,其表達(dá)程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,在PTMC 組織中BRAFV600E、β-catenin、cyclin D1 蛋白呈高表達(dá),陽性率均高于癌旁組織,分別為70%、35.8%、57.5%,組間對比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),且β-catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)陽性與頸部中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),故二者可能促進(jìn)了PTMC 患者發(fā)生發(fā)展及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,提示β-catenin、cyclin D1 蛋白異常表達(dá),可作為cN0 期PTMC 可靠標(biāo)志物。
本研究納入的120 例PTMC 患者病理資料中,BRAFV600E表達(dá)陽性率70.0% 與汪杰等[32]報(bào)道的29%~83%基本一致。Zheng 等[33]研究發(fā)現(xiàn),PTMC原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中常檢測出BRAFV600E突變。姬巍等[34]研究結(jié)果顯示,BRAFV600E突變型PTMC 的組織侵襲力強(qiáng),容易侵犯甲狀腺周圍組織,臨床病理分期高;腫瘤多灶、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC 患者,BRAFV600E突變率更高。本研究中cyclin D1 蛋白陽性表達(dá)率為57.5%,腫瘤直徑≥5 mm、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC 與cyclin D1 表達(dá)明顯相關(guān)(P<0.05)。BRAFV600E基因突變者PTMC 組織中cyclin D1 呈高表達(dá),cyclin D1表達(dá)上調(diào)與BRAFV600E基因突變呈正相關(guān),可作為PTMC 臨床病理診斷的重要輔助指標(biāo),亦可作為評估PTMC 侵襲能力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)方式、術(shù)后放射性碘治療及內(nèi)分泌治療的重要參數(shù)。
綜上所述,cN0 期PTMC 組織中BRAFV600E突變及β -catenin、cyclin D1 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng);BRAFV600E突變及β-catenin、cyclin D1 蛋白高表達(dá)促進(jìn)了PTMC 的發(fā)生發(fā)展及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。