丁娜 袁陽 王明山 張高峰 陳懷龍 時(shí)飛 孫曉鵬

(1 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院麻醉科，山東 青島 266071； 2 青島市西海岸新區(qū)區(qū)立醫(yī)院麻醉科)

目前，人群中缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)的發(fā)病率、致死率、致殘率均較高[1]，急性期溶栓是較為有效的治療方法，但恢復(fù)腦血流會(huì)導(dǎo)致缺血再灌注(I/R)損傷[2]，其中細(xì)胞線粒體是該病理過程的中繼站和放大器，維持線粒體形態(tài)功能對(duì)細(xì)胞的存活至關(guān)重要[3]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，電針預(yù)處理可抑制大鼠腦I/R時(shí)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的線粒體分裂，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用[4]。線粒體融合蛋白2(Mfn2)分布于線粒體外膜，在線粒體融合分裂中發(fā)揮著重要作用，可以調(diào)控線粒體的形態(tài)和功能[5]。因此，本研究通過分析電針預(yù)處理對(duì)大鼠I/R時(shí)腦皮質(zhì)缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體上Mfn2蛋白表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討電針預(yù)處理對(duì)大鼠腦I/R損傷可能的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源及分組

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠93只，8～12周齡，體質(zhì)量200～300 g，購自青島大任富城畜牧有限公司[許可證號(hào)：SCXKL(魯)2014-007]。在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，12-12 h明暗交替環(huán)境。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、腦缺血再灌注組(I/R組)、電針預(yù)處理組(E組)，每組31只。

1.2 各組大鼠的處理

S組大鼠僅暴露頸部血管，不進(jìn)行阻閉。I/R組用線栓法[6]制作大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型。E組于造模前連續(xù)5 d電針刺激大鼠百會(huì)穴[4]，最后一次針刺結(jié)束24 h后同I/R組處理。

1.3 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的評(píng)定

于再灌注6、24、48 h時(shí)隨機(jī)取9只大鼠，按Longa評(píng)分法對(duì)其行神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分[7]，1～3分為造模成功。造模成功后行以下指標(biāo)檢測。

1.4 大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的計(jì)算

按照Tunel試劑盒(碧云天生物科技研究所)說明書要求的步驟檢測大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況[8]。于再灌注6、24和48 h時(shí)隨機(jī)選取4只大鼠，斷頭取腦，取左側(cè)腦皮質(zhì)缺血半暗區(qū)組織制作石蠟切片，選用二甲苯、乙醇脫蠟，蛋白酶K消化，PBS沖洗后置入過氧化氫溶液中孵育，DAB顯色后切片。細(xì)胞核呈棕褐色的為Tunel細(xì)胞，即凋亡神經(jīng)細(xì)胞。參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]計(jì)算大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率：在各組玻片組織中隨機(jī)選取5張切片，于400倍光鏡下拍照，利用IPP 6.0軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=Tunel細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 大鼠標(biāo)本細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

于再灌注24 h時(shí)隨機(jī)取4只大鼠，以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉(0.4 mg/kg)后，生理鹽水灌注循環(huán)系統(tǒng)，直至心耳變?yōu)榘咨?，右心房流出的液體由血色變?yōu)榍宄?。灌注固定后，取腦皮質(zhì)缺血半暗區(qū)，剪成約1 mm3的小塊，浸入 30 g/L戊二醛前中固定，10 g/L 鋨酸后固定；梯度乙醇脫水后，浸透、包埋、切片；常規(guī)醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，通過透射電鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞中線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 Western blot 法檢測腦皮質(zhì)缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體上Mfn2及胞漿中Cyt C的表達(dá)水平

于再灌注6、24和48 h時(shí)每組隨機(jī)取5只大鼠，斷頭取腦，取缺血半暗區(qū)腦組織，4 ℃條件下制成勻漿。用組織線粒體分離試劑盒(碧云天生物科技研究所)采用差速離心法分離線粒體和胞漿[10]。提取的線粒體加入線粒體裂解液離心后取上清液，上清液含線粒體蛋白。然后配置10%和5%丙烯酰胺的分離膠和濃縮膠，加樣線粒體上清液蛋白或胞漿蛋白進(jìn)行電泳濃縮、分離，半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，印跡膜封閉2 h后，線粒體上清液蛋白中加入Mfn2一抗(稀釋度1∶1 000，上海恪敏生物科技公司)，胞漿蛋白中加入Cyt C一抗(稀釋度1∶1 000，上海恪敏生物科技公司)。室溫孵育1 h后，TBST洗膜，曝光、洗片。以IMAGE J軟件分析灰度值，Mfn2以COX-IV作為內(nèi)參照，Cyt C 以β-actin作為內(nèi)參照，Mfn2和Cyt C分別與其內(nèi)參照蛋白灰度值的比值表示相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

時(shí)間、時(shí)間與分組交互作用對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均無明顯影響(P>0.05)，分組對(duì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分有明顯影響(F=235.53，P<0.05)。與S組比較，I/R組和E組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著升高(F=79.17～109.35，P<0.01)；與I/R組比較，E組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著降低(P<0.01)。見表1。

2.2 3組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較

時(shí)間、分組、時(shí)間與分組交互作用對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率有明顯影響(F=13.71～328.20，P<0.05)。組內(nèi)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，I/R組和E組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率差異均有顯著性(F=28.08、30.82，P<0.01)。組間比較，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)I/R組和E組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均顯著高于S組(F=30.79～213.91，P<0.01)，E組均顯著低于I/R組(P<0.01)。見表1。

2.3 各組大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體上Mfn2及胞漿中Cyt C蛋白水平比較

時(shí)間、分組、時(shí)間與分組交互作用對(duì)線粒體上Mfn2及胞漿中Cyt C蛋白水平均有明顯影響(F=22.00～2 019.71，P<0.05)。組內(nèi)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，I/R組和E組線粒體上Mfn2表達(dá)水平比較差異均有顯著性(F=181.57、19.64，P<0.01)，I/R組和E組胞漿中Cyt C蛋白水平比較差異均具有顯著意義(F=87.29、54.40，P<0.01)。組間比較，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)I/R組和E組線粒體上Mfn2表達(dá)水平均顯著低于S組(F=94.86～453.95，P<0.01)，E組均顯著高于I/R組(P<0.01)；組間比較，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)I/R組和E組胞漿內(nèi)Cyt C蛋白水平均顯著高于S組(F=279.81～1 297.13，P<0.01)，E組均顯著低于I/R組(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)指標(biāo)比較

2.4 3組大鼠大腦皮質(zhì)缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)比較

電鏡下S組神經(jīng)細(xì)胞中線粒體呈短棒狀，結(jié)構(gòu)清晰完整。I/R組和E組中可見不同程度的線粒體分裂，膜間隙腫脹，基質(zhì)包含物沉積，空泡形成，嵴模糊或消失，與I/R組比較E組病變較輕(圖1)。

A：S組，B：I/R組，C：E組。枸櫞酸鉛電子染色，100 000倍

3 討 論

研究顯示，電針預(yù)處理可激發(fā)機(jī)體適度應(yīng)激，合成和釋放一些內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)進(jìn)行自我反饋調(diào)節(jié)，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過多通道、多靶點(diǎn)誘導(dǎo)腦缺血耐受，改善腦I/R損傷[11]。但其機(jī)制尚未完全闡明，本研究從Mfn2介導(dǎo)的線粒體形態(tài)改變出發(fā)，進(jìn)一步探討電針預(yù)處理的腦保護(hù)機(jī)制。

本研究中，通過短暫栓塞大鼠大腦中動(dòng)脈，制備大鼠腦I/R損傷模型，再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高，大腦皮質(zhì)缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增高，說明模型制備成功。電針預(yù)處理后，神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低，提示電針預(yù)處理減輕了大鼠腦I/R損傷。

線粒體為細(xì)胞提供能量，并可通過交換基因組促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)[12]。生理狀態(tài)下線粒體不斷融合分裂，并依靠融合分裂平衡來維持其穩(wěn)態(tài)和正常功能，其中Mfn2是調(diào)節(jié)線粒體融合分裂水平的重要蛋白之一[13]。細(xì)胞代謝過程中，線粒體分裂和融合在維持細(xì)胞功能中起關(guān)鍵作用。ROCHA等[14]的研究顯示，Mfn2基因突變引起線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)缺陷，從而誘發(fā)遺傳性的2A型Charcot-Marie-Tooth病。HAN等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)，Mfn2缺失會(huì)引起細(xì)胞凋亡。既往研究表明，在I/R等應(yīng)激狀態(tài)下，小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體融合減少，分裂增加，膜電位消失，通透性轉(zhuǎn)換孔開放，膜間隙中的Cyt C等促凋亡遞質(zhì)釋放增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。Cyt C是第一個(gè)被證明在凋亡細(xì)胞線粒體中釋放的蛋白，線粒體中Cyt C的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞的不可逆凋亡。本研究結(jié)果顯示，電鏡下I/R時(shí)大鼠大腦皮質(zhì)缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)改變，膜間隙腫脹，空泡形成，嵴模糊或消失,Cyt C釋放增加，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加，而電針預(yù)刺激后線粒體腫脹變形減輕，雙層膜結(jié)構(gòu)較完整，嵴形態(tài)和數(shù)目趨于完整，Cyt C釋放減少，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率減低。提示電針預(yù)刺激會(huì)提高神經(jīng)細(xì)胞對(duì)I/R的耐受。

研究顯示，PBDE-47可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性，而促進(jìn)線粒體融合通過恢復(fù)線粒體穩(wěn)態(tài)和抑制過度細(xì)胞凋亡減輕PBDE-47損傷[17]。與青年小鼠相比，老年大鼠肝臟因缺乏Sirt1和Mfn2表達(dá)，更容易遭受I/R損傷[18]。在細(xì)胞凋亡的過程中，Mfn2的表達(dá)及其水平能反映細(xì)胞凋亡的程度。ZHANG等[19]的研究結(jié)果顯示，特異性靶向缺失Mfn2會(huì)導(dǎo)致線粒體端?？s短，從而增加細(xì)胞凋亡。PATRUSHEV等[20]研究顯示，抑制Mfn2表達(dá)后，線粒體形態(tài)大小不一，各不相同，碎片化程度加重。本研究中I/R損傷后細(xì)胞線粒體上Mfn2表達(dá)水平下降，線粒體融合降低，Cyt C釋放增加。而經(jīng)過電針預(yù)處理，大鼠在同樣經(jīng)歷I/R損傷后，細(xì)胞線粒體上Mfn2表達(dá)下降程度降低，線粒體形態(tài)改變減輕，Cyt C釋放減少。

綜上所述，電針預(yù)處理大鼠百會(huì)穴可以減輕腦I/R損傷后神經(jīng)損傷癥狀，減輕細(xì)胞凋亡，其腦保護(hù)機(jī)制可能與上調(diào)Mfn2表達(dá)，增強(qiáng)線粒體融合有關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest: All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2019008)。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》進(jìn)行。

EthicsApprovalandAnimalRight: All animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by The Ethics Committee of Qingdao University Faculty of Medicine(Approval Letter No.2019008).All experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of Implementation Rules for The Management of Medical Laboratory Animals.

作者貢獻(xiàn)：丁娜、袁陽、時(shí)飛、孫曉鵬、王明山參與了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；丁娜、張高峰、陳懷龍參與了論文寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該最終稿件。

Contributions: The study was designed byDINGNa,YUANYang,SHIFei,SUNXiaopeng, andWANGMingshan.The manuscript was drafted and revised byDINGNa,ZHANGGaofeng, andCHENHuailong.Model establishment and indicators detection were implemented by.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.