王雅玲 徐靜 趙鵬 孫偉紅 彭達(dá) 馬學(xué)真

(青島大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266042 1 腫瘤中心； 2 病理科； 3 生物治療中心)

肺癌的發(fā)病率和死亡率在全世界惡性腫瘤中居首位[1]。根據(jù)病理特征肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC約占所有肺癌的85%，主要包括肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞未分化癌3種類型，肺腺癌是NSCLC最常見(jiàn)的亞型[2]。肺腺癌患者術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[3]。P21活化激酶5(PAK5)是P21活化激酶(PAKs)家族最新發(fā)現(xiàn)的成員，主要定位于細(xì)胞線粒體內(nèi)，位于20p12染色體上，編碼相對(duì)分子質(zhì)量80 000蛋白質(zhì)[4]。研究發(fā)現(xiàn)PAK5在卵巢癌、骨肉瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中均呈高表達(dá)，具有潛在的促癌作用[5-8]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是位于細(xì)胞膜的跨膜糖蛋白，由16q22.1號(hào)染色體上的CDH1基因編碼[9]。研究顯示E-cadherin表達(dá)降低可導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附能力減弱以及腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞容易脫離、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。PAK5可通過(guò)調(diào)控E-cadherin的表達(dá)水平參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[11-13]。目前關(guān)于PAK5在肺腺癌中的表達(dá)情況及PAK5與E-cadherin的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)肺腺癌組織中PAK5以及E-cadherin的表達(dá)情況，并對(duì)PAK5與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性及兩者與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，旨在探討PAK5和E-cadherin表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，為肺腺癌的治療及預(yù)后評(píng)估提供新思路或參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取青島大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院2014年1月—2015年12月確診為肺腺癌的患者61例，所有患者臨床資料完整，術(shù)前未行放化療及其他抗腫瘤治療。男27例，女34例；年齡≤60歲者26例，>60歲者35例；吸煙者19例，未吸煙者42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例，無(wú)轉(zhuǎn)移者39例；按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟第8版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ期24例；T1～T2期44例，T3～T4期17例。所有患者均行根治性手術(shù)，術(shù)后治療方式相同，均為1個(gè)月內(nèi)開(kāi)始常規(guī)化療，一個(gè)化療周期21 d，化療方案為培美曲塞+奈達(dá)鉑，共化療4個(gè)周期，均未接受放療、抗血管生成及靶向藥物等治療。隨訪時(shí)間截至2019年4月1日，記錄所有患者的總生存期(OS)和無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)，OS為從手術(shù)日至與肺癌相關(guān)死亡日或隨訪結(jié)束日或最后一次隨訪日之間的時(shí)間，PFS是從手術(shù)日到腫瘤進(jìn)展的時(shí)間，若沒(méi)有進(jìn)展，則終點(diǎn)是死亡日或最后一次隨訪日。本研究通過(guò)了青島大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的審批。

1.2 IHC染色檢測(cè)PAK5和E-cadherin的表達(dá)

所有患者于手術(shù)過(guò)程中留取肺腺癌組織標(biāo)本，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診為肺腺癌。標(biāo)本應(yīng)用40 g/L甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。采用SP-9000法進(jìn)行IHC染色檢測(cè)PAK5和E-cadherin的表達(dá)，操作嚴(yán)格按檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。兔抗人PAK5多克隆抗體(ab110069，1∶100稀釋)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，兔抗人E-cadherin單克隆抗體(3195s，1∶600稀釋)購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 結(jié)果判讀

由兩位病理學(xué)專家利用光學(xué)顯微鏡(BX-51，日本Olympus公司)對(duì)標(biāo)本染色結(jié)果進(jìn)行盲評(píng)，并取平均值作為最后得分。每個(gè)切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(200倍)，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比綜合評(píng)分進(jìn)行結(jié)果判讀。以腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為PAK5染色陽(yáng)性，以腫瘤細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為E-cadherin染色陽(yáng)性。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分；同時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：0～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，綜合得分計(jì)算方法為：綜合得分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分。PAK5表達(dá)綜合得分≥6分為高表達(dá)，<6分則為低表達(dá)[12]。E-cadherin表達(dá)綜合得分>4分為高表達(dá)，≤4分則為低表達(dá)[14]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0版軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)性分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺腺癌組織中PAK5和E-cadherin的表達(dá)水平與患者臨床病理特征間的關(guān)系

PAK5陽(yáng)性顆粒定位于肺腺癌細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，呈淡黃色或棕黃色；E-cadherin陽(yáng)性顆粒定位于肺腺癌細(xì)胞膜，呈淡黃色或棕黃色(圖1)。61例肺腺癌組織標(biāo)本中PAK5高表達(dá)者38例(62.3%)，E-cadherin高表達(dá)者43例(70.5%)；PAK5以及E-cadherin的表達(dá)水平均與腫瘤T分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(χ2=4.037～16.108，P<0.05)，但是與患者年齡、性別及是否吸煙無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 PAK5和E-cadherin表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

A:肺腺癌組織中PAK5高表達(dá)；B:肺腺癌組織中PAK5低表達(dá)；C:肺腺癌組織中E-cadherin高表達(dá)；D:肺腺癌組織中E-cadherin低表達(dá)。IHC染色，200倍

2.2 PAK5與E-cadherin表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

患者的隨訪時(shí)間為10～64個(gè)月，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示PAK5高表達(dá)及低表達(dá)患者3年總生存率分別為71.0%、95.7%，3年無(wú)進(jìn)展生存率分別為67.7%、82.6%；E-cadherin高表達(dá)及低表達(dá)患者3年總生存率分別為86.0%、67.0%，3年無(wú)進(jìn)展生存率分別為81.4%、52.7%；Log-Rank檢驗(yàn)顯示，PAK5低表達(dá)患者3年總生存率以及3年無(wú)進(jìn)展生存率均大于高表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.893、3.920,P<0.05)；E-cadherin高表達(dá)患者3年總生存率以及3年無(wú)進(jìn)展生存率均大于低表達(dá)者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.849、7.363,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

A、B分別為PAK5表達(dá)高低與患者總生存率及無(wú)進(jìn)展生存率的關(guān)系，C、D分別為E-cadherin表達(dá)高低與患者總生存率及無(wú)進(jìn)展生存率的關(guān)系

2.3 肺腺癌組織中PAK5與E-cadherin表達(dá)水平的相關(guān)性

本研究的分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織中PAK5與E-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.355，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 肺腺癌組織中PAK5與E-cadherin表達(dá)水平的相關(guān)性(例)

3 討 論

近年來(lái)，隨著分子靶向藥物在肺腺癌中的廣泛應(yīng)用，肺腺癌的治療取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但由于目前的早期診斷方法缺乏特異度和靈敏度，肺腺癌患者確診時(shí)大多已為晚期，5年存活率很低[15]。PAKs家族屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類，同時(shí)也是與細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cdc42)/Ras相關(guān)的C3肉毒素底物(Rac)的下游效應(yīng)分子[16]。PAKs根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)被分為兩類，第Ⅰ類包括PAK1、PAK2、PAK3，第Ⅱ類包括PAK4、PAK5、PAK6，均具有激酶結(jié)構(gòu)域和Cdc42/Rac結(jié)合域[17]。PAK5最初發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)組織中[18]，在小腦、大腦皮質(zhì)以及嗅球組織中均呈高表達(dá)[19]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)PAK5在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且與骨肉瘤、卵巢癌、宮頸癌以及胃癌等惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)[6,11-12,20]。PAK5是多種信號(hào)通路的核心分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等細(xì)胞生物學(xué)行為[21]。PAK5的激酶結(jié)構(gòu)域與第Ⅱ類中其他PAKs的激酶結(jié)構(gòu)域相似，與PAK6有至少80%的同源性，與PAK4有85%的同源性，但是與第Ⅰ類中的PAKs僅僅有約52%～57%的同源性[19,22]。CAI等[23]研究顯示，PAK4的高表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后不良有關(guān)系。RAJA等[24]研究認(rèn)為PAK6是一種有前途的新型NSCLC治療靶點(diǎn)。FAWDAR等[25]發(fā)現(xiàn)PAK5在5%～10%的肺癌中發(fā)生了突變，并且通過(guò)MEK/ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡。HAN等[26]發(fā)現(xiàn)PAK5在骨肉瘤中高表達(dá)，可以作為骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)。上述研究表明PAK5可能在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用。本研究結(jié)果顯示，有38例(62.3%)肺腺癌組織PAK5高表達(dá)，與先前的研究結(jié)果基本一致[12,26]；同時(shí)PAK5表達(dá)水平與腫瘤T分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，T3～T4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期的患者中PAK5高表達(dá)率顯著高于T1～T2期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的患者，表明PAK5高表達(dá)可能促進(jìn)肺腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。另外本研究中，PAK5低表達(dá)患者3年總生存率和3年無(wú)進(jìn)展生存率均顯著高于高表達(dá)患者，表明PAK5高表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)，也與先前研究結(jié)果基本一致。因此PAK5高表達(dá)在肺腺癌中可能起促癌作用，PAK5有望成為肺腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞失去極性，成為具有浸潤(rùn)能力和游走遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程，EMT會(huì)促進(jìn)包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及化療耐藥，E-cadherin是維持上皮細(xì)胞極性及細(xì)胞間黏附連接的主要分子，在EMT中表達(dá)下調(diào)[27]。既往研究發(fā)現(xiàn)PAK5會(huì)促進(jìn)宮頸癌、卵巢癌和結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT[11-13]，E-cadherin的表達(dá)水平與肺腺癌分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[28]。本研究結(jié)果顯示，有43例(70.5%)肺腺癌組織E-cadherin高表達(dá)，在T3～T4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ期的患者中E-cadherin高表達(dá)率顯著低于T1～T2期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期的患者，考慮可能與E-cadherin表達(dá)降低使癌細(xì)胞間的黏附能力減弱有關(guān)，從而引起肺腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。本研究還顯示E-cadherin低表達(dá)與肺腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，這與既往的研究結(jié)果基本一致[29]。PAK5與E-cadherin的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，提示PAK5高表達(dá)可能也與肺腺癌的EMT有關(guān)，并間接影響肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。

總之，PAK5高表達(dá)和E-cadherin低表達(dá)與肺腺癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)，且PAK5可能是通過(guò)調(diào)控EMT促進(jìn)肺腺癌的進(jìn)展。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步探討PAK5和E-cadherin在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為肺腺癌的防治提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻(xiàn)：所有作者共同參與了論文的研究設(shè)計(jì)、寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions：All the authors have participated in the research design, writing and revision of the manuscript.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.