賈松華，鄧海清，杜閃，張艷紅，尹珊珊，劉建凱

流感嗜血桿菌（haemophilus influenzae，Hi）為革蘭氏陰性桿菌，隸屬嗜血桿菌屬，威脅的主要人群為 5 歲以下兒童，是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。在常規(guī)使用疫苗前，流感嗜血桿菌造成的所有侵入性疾病中 95% 是由 b 型流感嗜血桿菌（haemophilus influenzae type b，Hib）引起[1-3]。多聚磷酸核糖基核糖醇（polyribosylribitol phosphate，PRP）是 b 型流感嗜血桿菌莢膜多糖的主要組成部分，也是制備 Hib 疫苗有效的抗原成分[4]，結(jié)構(gòu)見圖 1。本公司制備的 Hib 結(jié)合疫苗通過將純化的PRP 與破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）共價(jià)結(jié)合為結(jié)合態(tài)多糖，增加了 Hib 疫苗的免疫原性，將免疫應(yīng)答類型由 T 細(xì)胞非依賴性轉(zhuǎn)換為具有免疫記憶的 T 細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答，對于預(yù)防 Hib引起的腦膜炎及肺炎等疾病具有重要意義。在 Hib結(jié)合疫苗中，與載體蛋白結(jié)合的處于結(jié)合態(tài)的PRP，即為 Hib 結(jié)合態(tài)多糖；而未與載體蛋白結(jié)合的處于游離狀態(tài)的 PRP，即為 Hib 游離多糖。Guo 等[5]研究結(jié)果表明游離多糖含量高的 Hib 疫苗免疫小鼠的抗體水平差。多項(xiàng)研究表明，Hib 游離多糖含量是評價(jià)疫苗效價(jià)的重要質(zhì)量控制指標(biāo)，Hib 游離多糖含量過高會顯著影響疫苗的免疫原性[1,5-6]。

目前，《中華人民共和國藥典》2020 版（三部）（簡稱《中國藥典》）推薦使用乙醇分步沉淀法[7]測定 Hib 結(jié)合疫苗中的游離多糖含量。乙醇分步沉淀法作為測定游離多糖含量的經(jīng)典方法，其穩(wěn)定性、線性、準(zhǔn)確度、精密度等均得到廣泛驗(yàn)證，但該方法操作繁瑣，操作要求高，且試驗(yàn)周期長，對于游離多糖含量低的樣品，可能因含量低于測定下限造成誤差[6]。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法（high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）用于檢測 Hib 疫苗中多糖含量備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)擬利用 HPAEC-PAD 法測定凍干 Hib 疫苗游離多糖含量，探討不同條件對供試品水解效果的影響，最終確定了最佳水解條件，并初步確定凍干 Hib 結(jié)合疫苗中游離多糖含量分離的最適方法。為 Hib結(jié)合疫苗的游離多糖質(zhì)量控制提供了參考，為疫苗中該項(xiàng)測定提供了檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品和標(biāo)準(zhǔn)品 PRP 國際標(biāo)準(zhǔn)品（批號：12/306，4.904 mg/瓶）購自英國國家生物制品檢定所；凍干 Hib 結(jié)合疫苗（批號：D20200901-1，復(fù)溶后 0.5 ml/劑）、凍干 Hib 結(jié)合疫苗原液（批號：34-20094001、34-21064001、34-21064002、34-21064003）、Hib 結(jié)合疫苗（批號：E20201235，劑型為液體，0.5 ml/劑）和Hib 結(jié)合疫苗原液（批號：34-20113035）均由本公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要試劑及儀器 離子色譜儀 ICS-6000（配 ED 電化學(xué)檢測器，變色龍 7.0 工作站）、CarboPac PA10 型分析柱（2 mm × 250 mm）和CarboPac PA10 型保護(hù)柱（2 mm × 50 mm）均購自美國 Dionex 公司；搖床 HYG-A 購自太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；恒溫水浴鍋 SAP18 購自 Grant 公司；超速離心機(jī) OptimaTMMAX-XP（轉(zhuǎn)頭型號TLA-120.2）、超速離心管（型號 343778）均購自美國 Beckman 公司；214SPE3000 C4 固相萃取柱（5 ml）購自 VydacBioSelect 公司。

50% 氫氧化鈉溶液（HPLC 級）購自美國Thermo Fisher 公司；醋酸鈉（NaAc，純度 ≥ 99%）購自美國 Sigma 公司；甲醇（HPLC 級）、氯化鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm，由默克 Milli-Q IQ 7000 超純水儀制備。

1.1.3 溶液制備 PRP 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：將凍干的PRP 國際標(biāo)準(zhǔn)品室溫放置約 1 h，1 ml 超純水復(fù)溶，再取適量超純水稀釋至 19.616 μg/ml，即為PRP 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

1 mol/L NaAc/250 mmol/L NaOH 淋洗液：量取 13.1 ml 50% NaOH，稱取 NaAc 82.03 g，加入超純水至 1 L，氮?dú)馀艢?，混勻，使用時(shí)在線稀釋。

0.9% 氯化鈉：稱取氯化鈉 0.45 g，加入超純水 50 ml，混勻。

供試品前處理：用超純水將供試品按照合適的比例進(jìn)行稀釋，使 PRP 濃度在 0.1962～19.616 μg/ml范圍內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 添加適量的超純水系列稀釋 PRP 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，得到質(zhì)量濃度分別為0.1962、0.3923、0.9808、1.9616、3.9232、9.8080、15.6928 和 19.616 μg/ml 的系列標(biāo)準(zhǔn)品工作液（STD1～STD8）。經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后依次進(jìn)樣，記錄色譜圖，以 PRP 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。

1.2.2 色譜條件 采用 CarboPac PA10 型分析柱（2 mm × 250 mm）和 CarboPac PA10 型保護(hù)柱（2 mm × 50 mm）。脈沖安培檢測器，Au 工作電極，Ag/AgCl 參比電極，波形為 Carboh-ydrates。梯度洗脫條件：0～5 min，10% 淋洗液；5～10 min，10%～25% 淋洗液；10～15 min，25% 淋洗液；15～20 min，25%～35% 淋洗液；20～25 min，35%～10% 淋洗液；25～36 min，10% 淋洗液[8]。進(jìn)樣體積為 20 μl，流速為 0.25 ml/min。

1.2.3 水解條件的確定 量取供試品 0.5 ml 于1.5 ml 離心管中，向所有離心管中加入不同濃度的NaOH 溶液 0.5ml，混勻，不同溫度下水解供試品（水解條件詳見表 1）[9]。所有樣品經(jīng) 0.22 μm 尼龍膜過濾后，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，色譜條件見“1.2.2”。

表1 水解方法Table 1 Hydrolysis methods

1.2.4 游離多糖的分離

1.2.4.1 乙醇分步沉淀法 參照《中國藥典》[7]，乙醇分步沉淀法分離 Hib 游離多糖。

1.2.4.2 C4 固相萃取法 3 ml 甲醇活化 C4 固相萃取柱，10 ml 超純水沖洗。取 1 ml 供試品過C4 固相萃取柱，取 1 ml 0.9% 氯化鈉溶液過 C4固相萃取柱，收集全部濾過液，補(bǔ) 0.9% 氯化鈉至2 ml，得 Hib 游離多糖[10]。按照“1.2.3”優(yōu)化后的條件進(jìn)行水解，色譜條件見“1.2.2”。

1.2.4.3 超速離心法 參考文獻(xiàn)[11-12]，優(yōu)化超速離心條件分離游離多糖。在批號 34-21064001 產(chǎn)品中加入 PRP 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，加標(biāo)制備成 3 個(gè)濃度的 PRP 多糖溶液（質(zhì)量濃度分別為 0、0.9808、3.9232 μg/ml）。取 0.75 ml 加標(biāo)供試品于超速離心管中，12 ℃ 超速離心，離心力和離心時(shí)間詳見表 2。離心結(jié)束后立刻小心吸取 0.4 ml 上層溶液得 Hib 游離多糖，備用。按照“1.2.3”優(yōu)化后的條件進(jìn)行水解，色譜條件見“1.2.2”，計(jì)算各離心條件下 Hib 游離多糖中的加標(biāo)回收率，并按下式計(jì)算回收率（%）。通過游離多糖的加標(biāo)回收率試驗(yàn)篩選出僅沉淀結(jié)合態(tài)多糖而不沉淀游離多糖的最佳超速離心條件。

表2 超速離心條件優(yōu)化匯總Table 2 Summary of optimization of ultracentrifugation conditions

回收率（%）=（加標(biāo)后的游離多糖含量 -加標(biāo)前的游離多糖含量）/加標(biāo)多糖值 × 100%

1.2.5 方法的驗(yàn)證

1.2.5.1 系統(tǒng)適用性和專屬性 以 3.9232 μg/ml的 PRP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液為樣品，按上述選擇的條件測定，連續(xù)進(jìn)樣 5 次，記錄目的峰面積、保留時(shí)間和理論塔板數(shù)。同時(shí)記錄多糖供試品溶液、游離多糖供試品溶液（批號均為 34-21064001）、空白對照多糖含量色譜圖。

1.2.5.2 線性 將 PRP 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用超純水稀釋至 0.1962、0.3923、0.9808、1.9616、3.9232、9.8080、15.6928、19.616 μg/ml，按優(yōu)化條件將上述濃度的 PRP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)行 3 次多糖含量測定，根據(jù)目的峰峰面積與濃度的線性關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.3 精密度 以批號 34-21064001、34-21064002、34-21064003 為樣品，采用優(yōu)化的方法將各樣品平行測定 6 次，以建立的 PRP 校正曲線計(jì)算游離多糖重復(fù)測定的 RSD；各樣品按優(yōu)化條件在不同時(shí)間分 3 次檢測游離多糖含量，驗(yàn)證方法的中間精密度。

1.2.5.4 準(zhǔn)確性 分別在 3 批稀釋后的凍干Hib 結(jié)合疫苗原液（批號：34-21064001、34-21064002、34-21064003）中加入已知濃度的 PRP標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，制備成 3 個(gè)濃度的 PRP 多糖溶液，其質(zhì)量濃度分別為 0、0.9808、3.9232 μg/ml，按優(yōu)化條件測定樣品中游離 PRP 含量，計(jì)算游離多糖的平均加標(biāo)回收率均值和 RSD。

2 結(jié)果

2.1 水解條件的確定

方法 a、b2、c2 水解供試品的目的峰面積達(dá)最大（圖 2）；與 a 和 c2 相比，方法 b2 的水解溫度低且 NaOH 濃度相對小，因此確定方法 b2 水解供試品：即取供試品（PRP 濃度 0～19.616 μg/ml）0.5 ml 于 1.5 ml 離心管中，向離心管中加入 0.8 mol/L NaOH 溶液 0.5 ml，混勻，37 ℃ 下振蕩水解 1.5 h。

圖2 供試品的最佳水解條件Figure 2 Optimal hydrolysis conditions for the test article

2.2 C4 固相萃取法分離游離多糖

在測定凍干 Hib 結(jié)合疫苗和凍干 Hib 結(jié)合疫苗原液的游離多糖含量時(shí)，乙醇分步沉淀法的測定結(jié)果分別為 9% 和 7%；C4 固相萃取法的測定結(jié)果分別為 32.7%～56.3%、40.6%～46.8%；而在測定 Hib 結(jié)合疫苗和 Hib 結(jié)合疫苗原液的游離多糖含量時(shí)，乙醇分步沉淀法的測定結(jié)果分別為8% 和 7%；C4 固相萃取法的測定結(jié)果分別為2.9%～3.6%、2.6%～3.2%。與乙醇分步沉淀法相比，C4 固相萃取法測得的凍干 Hib 結(jié)合疫苗和凍干Hib 結(jié)合疫苗原液的游離多糖含量顯著偏高，而測得的 Hib 結(jié)合疫苗和 Hib 結(jié)合疫苗原液的游離多糖含量略低。

2.2 超速離心法的條件優(yōu)化

不同離心條件下游離多糖供試品中的加標(biāo)回收率見圖 3，游離多糖的加標(biāo)回收率接近 100% 所對應(yīng)的離心條件即為最佳條件。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定分離 Hib 游離多糖的超速離心條件為 550 000 ×g、30 min。

圖3 供試品的最佳超速離心條件Figure 3 Optimal ultracentrifugation conditions for the test article

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適用性和專屬性 PRP 目的峰的理論塔板數(shù)均高于 10000，PRP 標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和保留時(shí)間測定值的 RSD 分別為 2.3%、0.1%（表 3）；PRP 標(biāo)準(zhǔn)品、多糖供試品及游離多糖供試品在相應(yīng)位置處均可見明顯色譜峰，而空白溶液未見對應(yīng)色譜峰（圖 4）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法具有良好的系統(tǒng)適用性和專屬性。

圖4 專屬性驗(yàn)證色譜圖（A：空白溶劑；B：PRP 標(biāo)準(zhǔn)品；C：游離多糖供試品；D：多糖供試品）Figure 4 Specificity verification chromatogram (A: Blank solvent;B: PRP standard;C: Free polysaccharide test artcle;D: Polysaccharide test artcle)

表3 系統(tǒng)適用性驗(yàn)證結(jié)果Table 3 System suitability verification results

2.3.2 線性 將 8 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)行 3 次測定，PRP 濃度在 0.1962～19.616 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，R2均大于 0.99，見表 4。

表4 線性回歸方程及決定系數(shù)Table 4 Linear regression equation and coefficient of determination

2.3.3 精密度 3 批供試品重復(fù)測定 6 次游離多糖的 RSD 分別為 4.1%、2.3%、3.3%（表 5）；不同時(shí)間測得中間精密度的 RSD 分別為 8.3%、3.6%、9.1%（表 6）；結(jié)果表明方法具有很好的精密度。

表5 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果（游離多糖含量，μg/ml）Table 5 Repeatability verification results (free polysaccharide content,μg/ml)

表6 不同時(shí)間中間精密度驗(yàn)證結(jié)果（游離多糖含量，μg/ml）Table 6 Intermediate precision validation results at different times (free polysaccharide content,μg/ml)

2.3.4 準(zhǔn)確性 用優(yōu)化后的超速離心法測定三批樣品的游離多糖回收率（表 7）。34-21064001、34-21064002、34-21064003 的平均加標(biāo)回收率分別為 102.9%、94.3%、92.0%，RSD 分別為 3.9%、8.7%、5.3%。結(jié)果表明，優(yōu)化后的超速離心法具有良好的準(zhǔn)確度。

表7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Spiked recovery test result

2.4 超速離心法分離游離多糖

不同方法測定樣品中游離多糖含量，乙醇分步沉淀法的結(jié)果分別為 7%、8%、9%；超速離心法的結(jié)果分別為 17.6%～19.4%、20.8%～21.6%、16.4%～20.9%。與乙醇分步沉淀法相比，超速離心法測得的凍干 Hib 結(jié)合疫苗原液的游離多糖含量略高。

3 討論

游離多糖含量過高會顯著影響 Hib 疫苗的免疫原性，因此監(jiān)測游離多糖水平是 Hib 疫苗生產(chǎn)中質(zhì)量控制和穩(wěn)定性研究的重要指標(biāo)。HPAEC-PAD 法[13-14]用于檢測 Hib 疫苗中多糖含量備受關(guān)注。與藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法地衣酚法[15]相比，該方法選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確度好、靈敏度高（可精確到 pmol），可作為地衣酚法的替代方法檢測Hib 疫苗中多糖含量。目前已報(bào)道的 Hib 游離多糖分離方法主要有疏水作用色譜（HIC）法[10]、乙醇分步沉淀法[7]、冷酚抽提法[16]、脫氧膽酸鈉法[5,6,17]、超速離心法[12,18]等。冷酚抽提法和乙醇分步沉淀法分離游離多糖時(shí)因額外引入化學(xué)沉淀劑會對 HPAEC-PAD 測定多糖含量中的色譜柱造成損傷，縮短壽命甚至干擾測定[11]。脫氧膽酸鈉法在分離時(shí)最大的困擾就是結(jié)合態(tài)多糖和游離多糖均為帶電荷的兩性物質(zhì)，在溶液中形成的非特異性吸附可能造成游離多糖共沉，導(dǎo)致游離多糖含量測定值偏離真實(shí)值[19]。

3.1 C4 固相萃取法

疏水作用色譜（HIC）法根據(jù)載體蛋白中含有的疏水性殘基與 HIC 柱固定相產(chǎn)生的疏水性相互作用而實(shí)現(xiàn) Hib 游離多糖分離[10]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)HIC 法借助 C4 固相萃取柱分離 Hib 游離多糖。結(jié)果表明，與乙醇分步沉淀法相比，C4 固相萃取法測得的 Hib 結(jié)合疫苗和 Hib 結(jié)合疫苗原液的游離多糖含量偏低。究其原理發(fā)現(xiàn)，乙醇分步沉淀法的測定結(jié)果表征的是低分子質(zhì)量結(jié)合多糖及游離多糖的總和，而 C4 固相萃取法的測定結(jié)果僅顯示游離多糖含量[11]，因此 C4 固相萃取法的測定結(jié)果理論上會低于乙醇分步沉淀法的測定結(jié)果。此外，研究還發(fā)現(xiàn) C4 固相萃取法測得的凍干Hib 結(jié)合疫苗游離多糖含量顯著高于乙醇分步沉淀法的測定結(jié)果，偏離 Hib 游離多糖的真實(shí)含量。本公司生產(chǎn)的凍干 Hib 結(jié)合疫苗與 Hib 結(jié)合疫苗的緩沖體系不同，根據(jù)供試品特點(diǎn)推測凍干Hib 結(jié)合疫苗的緩沖體系會干擾 C4 固相萃取柱分離 Hib 游離多糖，導(dǎo)致游離多糖分離失敗。說明 C4 固相萃取法不適用于本公司凍干 Hib 結(jié)合成品中游離多糖含量測定。Guo 等[5]提出 HIC 法會存在載體蛋白缺乏疏水性殘基或者個(gè)別游離多糖和 HIC 柱固定相結(jié)合而導(dǎo)致游離多糖分離失敗的可能。因此，HIC 法分離 Hib 游離多糖不具有普適性。

3.2 超速離心法

超速離心法根據(jù) Hib 結(jié)合物與游離多糖的分子大小、沉降系數(shù)等差異，借助超速離心機(jī)分離 Hib 游離多糖。與乙醇分步沉淀法相比，超速離心法測得的本公司凍干 Hib 結(jié)合疫苗原液的游離多糖含量略高。趙丹等[11]采用超速離心法測定的 Hib 游離多糖含量低于乙醇分步沉淀法結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道不同。推測原因：①兩種方法測定游離多糖時(shí)存在時(shí)間差，產(chǎn)品生產(chǎn)后即用乙醇分步沉淀法測定游離多糖含量，而超速離心法測定游離多糖含量時(shí)，樣品已在 2～8 ℃ 放置 1 年左右且期間因優(yōu)化需要已多次取樣振蕩；②超速離心法分離游離多糖需快速吸取上清實(shí)現(xiàn)游離多糖分離，對人員的操作要求很高，有待進(jìn)一步驗(yàn)證來確定原因。趙丹等[11]優(yōu)化的超速離心條件為500 000 ×g、30 min，Belfast 等[12]確定的超速離心條件為 600 000 ×g、30 min，而本研究優(yōu)化的超速離心條件為 550 000 ×g、30 min，三種超速離心法的離心條件存在差異。推測不同公司生產(chǎn)的 Hib結(jié)合物與游離多糖的分子大小、沉降系數(shù)差異可能會導(dǎo)致超速離心法的離心條件不同。

本研究驗(yàn)證結(jié)果表明，PRP 濃度在 0.1962～19.616 μg/ml 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，R2均大于 0.99，6 次重復(fù)測定游離多糖的 RSD均小于 5%，不同時(shí)間測定游離多糖的 RSD 均小于 10%，表明該方法具有良好的精密性。游離多糖的加標(biāo)回收率均在 80%～120% 范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。結(jié)果證明，該方法有很好的線性、精密度、準(zhǔn)確度及專屬性，可用于凍干 Hib疫苗中游離多糖含量檢測。

綜上所述，本研究初步建立了檢測凍干 Hib結(jié)合疫苗游離多糖含量的超速離心聯(lián)合HPAEC-PAD 法，可作為 Hib 結(jié)合疫苗游離多糖含量的檢測方法，對完善該疫苗游離多糖質(zhì)量控制具有很好的指導(dǎo)作用，同時(shí)也給其他多糖蛋白結(jié)合疫苗中游離多糖含量的檢測提供了參考。