董俊杰，曾宇翔，富昊偉，張馨月，楊長登，李友發(fā)*

(1.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016；2.中國水稻研究所，浙江 杭州 311400)

水稻紋枯病是由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的一種土傳性真菌病害[1]。近年來，隨著氣候的變化、氮肥用量的增加以及矮稈、密植的高產(chǎn)栽培技術(shù)的推行，紋枯病的危害日趨加重。據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心統(tǒng)計(jì)，2020年我國紋枯病整體偏重發(fā)生(4級)，發(fā)病面積達(dá)0.173億hm2，位居三大病害之首。

目前，水稻紋枯病的防治主要依賴化學(xué)殺菌劑和栽培措施。從保護(hù)環(huán)境和節(jié)約成本的角度來看，培育穩(wěn)定的抗紋枯病的水稻品種是最根本的防治方法。近年來，隨著一些研究方法的改進(jìn)和新技術(shù)的應(yīng)用，水稻紋枯病抗性研究已取得了一些進(jìn)展。本文對水稻紋枯病菌的致病機(jī)制、抗性種質(zhì)資源的鑒定、抗性QTL定位以及抗性相關(guān)基因最新研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并對未來水稻紋枯病的研究進(jìn)行了展望，旨在為今后水稻紋枯病抗性育種提供重要參考。

1 水稻紋枯病致病病菌與致病機(jī)制

1.1 水稻紋枯病病菌的分類與特點(diǎn)

1858年，Julius Kühn首次在患病的馬鈴薯塊莖上發(fā)現(xiàn)了這種真菌，并將其命名為R.solani[2]。Parmeter等[3]根據(jù)不同菌株間菌絲的融合性對其進(jìn)行了分類。目前共報(bào)道了14個(gè)不同融合群(AG1-AG13和AGBI)，它們在菌落形態(tài)、寄主范圍、侵染性和營養(yǎng)需求等方面表現(xiàn)出較大的差異[4]。Sneh等[5]基于菌核的序列同源性和菌核的大小與形狀進(jìn)一步將AG1融合群細(xì)分為IA、IB和IC 3個(gè)亞組，其中立枯絲核菌(AG1-IA)作為主要類群最常被報(bào)道。立枯絲核菌具有寬寄主和強(qiáng)腐生性的特點(diǎn)，除引起水稻紋枯病外，還侵染玉米、大豆、花生、甘蔗、棉花、馬鈴薯等許多作物，其可以潛伏在土壤和茬口中越冬，當(dāng)氣候適宜時(shí)再次感染健康的水稻[6-7]。

1.2 水稻紋枯病菌的致病機(jī)制

立枯絲核菌在侵染過程中能形成專門的侵染結(jié)構(gòu)，便于其侵入寄主體內(nèi)。目前普遍認(rèn)同的是，其通過分泌細(xì)胞壁降解酶和毒素等，破壞宿主細(xì)胞壁，改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，影響寄主在惡劣環(huán)境中生存的能力[8]。在侵染后期，立枯絲核菌菌絲會(huì)產(chǎn)生胞外降解酶，比如，果膠分解酶(pectinolytic enzymes)、纖維素分解酶(cellulolytic enzymes)等，對水稻組織造成損傷，表現(xiàn)出葉鞘或葉片發(fā)黃的癥狀[9]。紋枯病菌產(chǎn)生的毒素主要是葡萄糖和半乳糖等糖類物質(zhì)，能在很低濃度下誘發(fā)植物病害，其進(jìn)入寄主后，本身不會(huì)建立新的生理生化過程，只是通過影響植物光合作用、水分運(yùn)輸及各種酶或蛋白質(zhì)的活性等，降低寄主對病原菌的抵抗能力[10]。Ghosh等[11]在感染葉片組織中觀察到葉綠體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，導(dǎo)致光合效率的降低，基于GC-MS的代謝產(chǎn)物譜顯示糖酵解和TCA循環(huán)中間產(chǎn)物的大量積累，顯示呼吸作用增強(qiáng)，一些芳香和脂肪族氨基酸以及苯丙中間體也被積累，表明在發(fā)病過程中誘導(dǎo)了次生代謝。隨著轉(zhuǎn)錄組和RNA測序技術(shù)的發(fā)展，已鑒定出大量的紋枯病菌與寄主互作的蛋白。Xia等[12]研究發(fā)現(xiàn)，紋枯病菌關(guān)鍵致病基因的選擇性剪接是其重要的致病調(diào)節(jié)手段，對不同感染時(shí)期的病原菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出了許多致病相關(guān)基因，包括調(diào)控次生代謝蛋白、水解酶和MAPK信號通路相關(guān)蛋白等的基因。Chen等[13]對侵染水稻葉片后10、18、24、32、48和72 h的6個(gè)RhizoctoniasolaniAG1 IA樣本進(jìn)行RNA-seq分析，并利用RhizoctoniasolaniAG1-IA的基因組序列(10 489個(gè)基因)和注釋信息建立數(shù)據(jù)庫，為基因功能、致病因素和分泌蛋白的研究提供了有效途徑。

2 水稻抗紋枯病種質(zhì)資源的篩選

我國在20世紀(jì)70年代初就開始對大量的水稻種質(zhì)資源進(jìn)行紋枯病抗性的篩選[14]。湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院連續(xù)8年鑒定了不同國家和地區(qū)的24 000份栽培稻和野生稻，未發(fā)現(xiàn)完全免疫或抗病性水平較高的品種，僅有少數(shù)中抗品種[15]。左示敏等[16]以5份比較抗的品種為對照，以改進(jìn)的帶菌木質(zhì)短棒為接種物、以基于“葉枕高”的“0～9”級病級指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)，對水稻5個(gè)類群和1個(gè)混合類群的299份品種進(jìn)行了溫室苗期紋枯病抗性鑒定，未發(fā)現(xiàn)免疫和高抗品種，中抗以上品種比例僅為36.5%，多數(shù)品種為中感至高感水平。Zeng等[17]采用大田鑒定的方法，對15個(gè)國家的273份水稻材料進(jìn)行了多年鑒定，篩選到一份穩(wěn)定表現(xiàn)抗的品種GD66。另外，也有報(bào)道對深水稻材料、寒地水稻材料等進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，但都未發(fā)現(xiàn)免疫或高抗紋枯病的抗源材料[18-20]。

國外研究水稻紋枯病的國家，主要是一些水稻種植國，多集中在印度、印度尼西亞、日本、菲律賓等國家。Prasad和Eizenga[21]用3種不同的接種鑒定方法對73份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行評價(jià)，鑒定出7份中等抗性材料。國際水稻研究所對233份水稻材料進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，僅發(fā)現(xiàn)29個(gè)材料有中等抗性，未發(fā)現(xiàn)高抗免疫材料[22]。Persaud等[23]在溫室條件下對101份水稻材料在2個(gè)地點(diǎn)的5個(gè)環(huán)境內(nèi)進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，篩選出4份比較抗的品種G98-135、FG07-35、GRDB-12 和BR-444。

從以上報(bào)道可知，無論是國內(nèi)還是國外，至今未發(fā)現(xiàn)免疫和高抗的種質(zhì)，只篩選到少量抗性水平較高的種質(zhì)或品種。目前公認(rèn)的抗的種質(zhì)有Jasmine85、特青、LSBR-5、LSBR-33、YSBIR、揚(yáng)稻4號、窄葉青8號、華粳3號、武粳15、揚(yáng)輻粳7號等。在這些具有部分抗性的種質(zhì)資源中，由于其綜合性狀不良、抗性不穩(wěn)定等諸多因素，難以在生產(chǎn)上直接利用。

3 水稻紋枯病抗性QTL定位

水稻紋枯病抗性是由數(shù)量性狀基因座(QTL)控制的數(shù)量性狀[24]。前人對水稻紋枯病抗性進(jìn)行了大量的篩選工作。在此基礎(chǔ)上，選擇抗感差異的材料構(gòu)建遺傳分析群體，定位了大量的紋枯病抗性QTL。Zeng等[25]對2010年之前所鑒定的紋枯病抗性QTL做了總結(jié)，本文對之后所鑒定的紋枯病抗性QTL進(jìn)行總結(jié)(表1)。

表1 在不同群體中鑒定的紋枯病抗性QTL

Fu等[26]構(gòu)建了HH1B/RSB03的重組自交系群體，經(jīng)過2個(gè)地點(diǎn)的田間表型鑒定，共定位28個(gè)紋枯病抗性QTL，分布于1、2、3、4、5、6、7、8、9染色體，其中qSBR2-2和qSBR9是新的位點(diǎn)。Nelson等[27]構(gòu)建了MCR10277/Cocodrie的雙單倍群體，在田間和溫室進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，定位到來自MCR10277的4個(gè)紋枯病抗性QTL。Eizenga等[28]首次以2份野生稻親本為供體親本，美國水稻品種孟加拉(Bengal)為輪回親本，建立了2個(gè)高級回交群體，通過2年的田間接種實(shí)驗(yàn)，都檢測到了qShB6。Liu等[29]利用Lemont/Jasmine 85重組自交系，在9號染色體上定位1個(gè)被許多研究者報(bào)到的位點(diǎn)qShB9-2，在2號染色體上的RM221和RM112標(biāo)記之間鑒定了1個(gè)新的紋枯病抗性QTL，qSB2.2。Zuo等[30-31]采用田間紋枯病接種鑒定，通過構(gòu)建不同的染色體片段置換系將qSB-11LE精細(xì)定位于74 kb區(qū)間內(nèi)，將qSB-9TQ精細(xì)定位于146 kb區(qū)間內(nèi)，并對區(qū)間內(nèi)的候選基因進(jìn)行了注釋。Liu等[32]利用深水稻品種RSB02與HH1B構(gòu)建了重組自交系群體，采用苗期溫室紋枯病接種鑒定，共定位到37個(gè)紋枯病抗性QTL，其中，qDR4是1個(gè)新的位點(diǎn)，位于3號染色體RM1155～RM5757。Yadav等[33]利用雜交組合BPT-5204/ARC10531構(gòu)建2個(gè)定位群體(F2和BC1F2)，室內(nèi)成株期紋枯病接種鑒定，共定位到5條不同染色體上的9個(gè)紋枯病抗性QTL，與前人研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，qshb1.1、qshb7.1、qshb7.2和qshb8.1是新的位點(diǎn)。Wen等[34]利用Yangdao4/Lemont的F2群體，采用大田紋枯病接種鑒定，定位到了2個(gè)新的QTL位點(diǎn)：qSBL7和qSBD12-2。Goad等[35]利用2個(gè)雜草稻與秈稻品種DGWG構(gòu)建了重組自交系群體，通過2年的紋枯病抗性田間鑒定，定位到2個(gè)新的QTL位點(diǎn)，qShB1-2和qShB4。

近年來，也有研究者通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了一些標(biāo)記位點(diǎn)與水稻紋枯病抗性顯著相關(guān)。Jia等[36]采用155個(gè)分子標(biāo)記對217份水稻材料進(jìn)行基因型檢測，苗期微室法進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，關(guān)聯(lián)分析檢測到10個(gè)與紋枯病抗性顯著相關(guān)的分子標(biāo)記，分布于1、2、4、5、6、8和11號染色體。孫曉棠等[37]同樣采用苗期微室法進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，用144個(gè)SSR標(biāo)記對456份水稻材料進(jìn)行基因型檢測，利用GLM、MLM(Q+K)、MLM(PCA+K)3種模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，有13個(gè)分子標(biāo)記在2個(gè)以上模型被檢測到，單個(gè)位點(diǎn)表型變異解釋率為1.8%～8.4%。Lvavle等[38]采用63個(gè)SSR標(biāo)記對134份水稻材料進(jìn)行基因型鑒定，室內(nèi)成株期進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，關(guān)聯(lián)分析共檢測到21個(gè)分子標(biāo)記與紋枯病抗性顯著相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)在水稻品種Tetep的8號染色體上標(biāo)記RM337和RM5556區(qū)間內(nèi)可能存在紋枯病抗性QTL。Chen等[39]對299份水稻材料進(jìn)行紋枯病抗性全基因組關(guān)聯(lián)分析，在3個(gè)環(huán)境中共檢測到11個(gè)顯著的SNP位點(diǎn)，其中qSB-3和qSB-6區(qū)域在3個(gè)環(huán)境中被重復(fù)檢測到。Wang等[40]對259份水稻材料進(jìn)行了苗期、分蘗期以及孕穗期紋枯病抗性的鑒定，通過基于SNP和Hap的全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了大量候選基因；隨后通過WGCNA分析以及不同接種時(shí)間抗感材料的轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定到653個(gè)與紋枯病抗性顯著相關(guān)的基因；進(jìn)一步通過過表達(dá)和RNAi驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)OsRSR1和OsRLCK5能顯著提高水稻紋枯病抗性，而RNA干擾OsRSR1和OsRLCK5的水稻植株對紋枯病的抗性顯著降低。

4 水稻紋枯病抗性相關(guān)基因

由于抗紋枯病水稻種質(zhì)資源的缺乏，傳統(tǒng)的育種手段難以選育出紋枯病抗性品種。利用基因工程技術(shù)對紋枯病抗性相關(guān)基因進(jìn)行改造，是開展紋枯病抗病育種的有效手段之一。近年來，研究者們從水稻中分離和鑒定了許多紋枯病抗病相關(guān)基因。

幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分之一。Lin等[41]在啟動(dòng)子CaMV 35S下，首次將含有幾丁質(zhì)酶基因chi11的1.1 kb內(nèi)源DNA片段轉(zhuǎn)入到秈稻品種ChinsurahBoroⅡ中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株紋枯病抗性與幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量有關(guān)，且接種紋枯病菌后發(fā)病較對照植株輕。Baisakh等[42]利用粒子槍轟擊技術(shù)和花藥培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因chi11的純合水稻植株，同樣發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的紋枯病抗性顯著增強(qiáng)。Data等[43]將水稻幾丁質(zhì)酶基因RC7轉(zhuǎn)入到的秈稻品種IR72和IR64，在接種紋枯病菌后不同時(shí)間調(diào)查病情，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株較對照病情進(jìn)展慢，且病斑更小。

木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性的重要組成成分，木質(zhì)素沉積使植物細(xì)胞壁能夠抵抗病原物的侵染。同時(shí)，在木質(zhì)素合成過程中所產(chǎn)生的一些酚類和自由基等，可以通過影響病原菌生理相關(guān)酶的活性，降低病原菌的侵染能力[44]。肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)參與水稻木質(zhì)素合成的多個(gè)步驟，敲除CAD家族基因OsCAD8B的水稻植株的木質(zhì)素含量比對照低，且更容易被紋枯病菌感染[45]。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)是紋枯病菌產(chǎn)生的纖維素酶之一[46]。OsPGIP1編碼多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting proteins，PGIP)，能抑制PG的活性。前人研究表明，過表達(dá)OsPGIP1的水稻植株對紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)，且不影響其他農(nóng)藝性狀[47-48]。OsPGIP2與OsPGIP1同源，但本身不具備PGIP的活性。Chen等[49]鑒定到1個(gè)在L233F上缺失的OsPGIP2L233F突變體，使OsPGIP2表現(xiàn)出對PG的抑制能力，過表達(dá)OsPGIP2L233F水稻植株較對照植株紋枯病抗性增強(qiáng)，且在農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量上無顯著差異。

病原菌與寄主的互作是一個(gè)極其復(fù)雜的過程。病原菌通過侵染寄主植物來獲取養(yǎng)分，尤其是糖分。Gao等[50]研究發(fā)現(xiàn)，紋枯病菌通過誘導(dǎo)OsSWEET11的表達(dá)來獲取營養(yǎng)，OsSWEET11突變體的植株對紋枯病菌的敏感性較低，而過表達(dá)OsSWEET11的植株對紋枯病菌敏感性較高。OsOSM1編碼一種滲透蛋白，屬于水稻PR-5家族。Xue等[51]研究發(fā)現(xiàn)，在抗紋枯病品種YSBR1中，紋枯病菌會(huì)強(qiáng)烈誘導(dǎo)OsOSM1的表達(dá)，而在感病品種徐稻3號中不誘導(dǎo)，在徐稻3號中過表達(dá)OsOSM1，顯著提高了其對紋枯病的抗性。Molla等[52]研究表明，過表達(dá)水稻草酸氧化酶基因OsOXO4，能增強(qiáng)植株對外源草酸的耐受力，有效增強(qiáng)水稻紋枯病抗性且未影響其他農(nóng)藝性狀。Karmakar等[53]在水稻中同時(shí)過表達(dá)OsOXO4和OsCHI11，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株被紋枯病菌侵染后，PR相關(guān)基因的表達(dá)量較野生型明顯增加，離體葉片接種的病斑顯著低于野生型。Cao等[54]研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)在感病材料Lemont中會(huì)受到紋枯病菌的抑制，而在抗病材料YSBR1中受到的抑制明顯減少，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在粳稻中沉默葉綠素代謝基因OsNYC3，紋枯病抗性顯著增強(qiáng)，且主要農(nóng)藝性狀沒有變化。

植物對病原菌的免疫方式會(huì)受到茉莉酸(JA)、乙烯(ET)、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)等激素的調(diào)控[55]。WRKY家族基因是SA、JA抗病信號途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子[56]。Wang等[57]研究發(fā)現(xiàn)，紋枯病菌侵染水稻后，OsWRKY4的表達(dá)量顯著增強(qiáng)，過表達(dá)OsWRKY4的水稻植株紋枯病抗性增強(qiáng)，與JA和ET響應(yīng)相關(guān)的一些防御相關(guān)基因，如PR1a、PR1b、PR5和PR10/PBZ1的表達(dá)也會(huì)升高。Peng等[58-59]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)OsWRKY30 和過表達(dá)OsWRKY80的轉(zhuǎn)基因株系紋枯病抗性均顯著增強(qiáng)，且內(nèi)源性JA的積累會(huì)增加。John等[60]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY13以TIFY9作為媒介影響絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，調(diào)控水稻紋枯病抗性。OsACS2編碼的1-氨環(huán)丙烷-1羧酸合成酶，是催化乙烯生物合成的限速酶，過表達(dá)OsACS2的水稻植株紋枯病抗性顯著增強(qiáng)[61]。OsASR2編碼ABA-脅迫-成熟誘導(dǎo)蛋白，在水稻中過表達(dá)OsASR2，能激活含有GT-1的基因，如Os2H16的表達(dá)，增強(qiáng)對紋枯病菌的抗性[62-63]。

5 展望

每年由紋枯病導(dǎo)致的水稻產(chǎn)量損失達(dá)10%～40%，已成為水稻種植的重大威脅。目前，關(guān)于水稻紋枯病抗性相關(guān)的QTL已經(jīng)有很多的報(bào)道，尚未克隆到控制水稻紋枯病抗性的主效基因，僅發(fā)現(xiàn)少量基因能調(diào)控水稻紋枯病抗性。未來對紋枯病的研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下幾方面的內(nèi)容。

抗病QTL的精細(xì)定位對群體大小和表型鑒定精度的要求高，而水稻紋枯病又易受到環(huán)境因素的影響[17]。因此，進(jìn)行多環(huán)境、多群體的重復(fù)試驗(yàn)，挖掘可靠的紋枯病抗性QTL。對經(jīng)過多次重復(fù)驗(yàn)證定位到的紋枯病QTL，可以開發(fā)緊密連鎖的分子標(biāo)記，開展分子標(biāo)記輔助選擇育種，評估其應(yīng)用價(jià)值。

隨著芯片和測序技術(shù)的不斷發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)已成為挖掘自然變異的重要手段。之前關(guān)于紋枯病抗性基因的挖掘，大多采用連鎖分析，少數(shù)采用低密度的分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，只有2項(xiàng)研究基于全基因組關(guān)聯(lián)分析。GWAS不會(huì)受到連鎖分析作圖群體基于少數(shù)親本的限制，其群體來源廣且含有更多的遺傳變異。GWAS的缺點(diǎn)是假陽性較高且會(huì)丟失稀有等位基因，未來可以通過GWAS和連鎖分析的聯(lián)合分析來挖掘紋枯病抗性基因。

深入解析水稻紋枯病抗性的遺傳調(diào)控機(jī)制，并借助現(xiàn)代基因組育種技術(shù)培育抗紋枯病的水稻品種，是防治紋枯病最根本的途徑。轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于創(chuàng)建優(yōu)良的水稻育種材料[64-65]，到目前為止，研究已發(fā)現(xiàn)，一些基因可以調(diào)控水稻紋枯病的抗性，但利用這些基因創(chuàng)建出農(nóng)藝性狀好且紋枯病抗性強(qiáng)的材料較少。普遍認(rèn)為，單個(gè)基因的轉(zhuǎn)入不足以提供足夠的紋枯病抗性水平[66]。因此，找到合適的基因組合，對水稻生產(chǎn)上常用品種進(jìn)行紋枯病抗性的改良是今后研究的重點(diǎn)。