孫朗，石明睿，熊志立

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016；2.麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，珠海 519045)

近年國(guó)內(nèi)仿制藥及一致性評(píng)價(jià)審評(píng)中日益重視雜質(zhì)譜的研究，特別是潛在基因毒性雜質(zhì)的評(píng)估[1-2]。苯磺酸氨氯地平膠囊臨床應(yīng)用廣泛，是治療高血壓病的首選藥物之一[3]。由于苯磺酸在合成過程中可能引入苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸異丙酯等基因毒性雜質(zhì)，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)苯磺酸氨氯地平各劑型藥物基因毒性雜質(zhì)的報(bào)道多為配體苯磺酸所引入的苯磺酸酯類雜質(zhì)[4-5]。作者依據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心“關(guān)于公開征求4個(gè)ICH指導(dǎo)原則中文翻譯稿意見的通知”和“Q3C(R8)：雜質(zhì)：殘留溶劑的指導(dǎo)原則”，對(duì)該品種的起始物料、中間體、副反應(yīng)及降解產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)研究，篩選出2個(gè)分別具有氮雜環(huán)氮氧和?；枷惆本窘Y(jié)構(gòu)[6-8]的非苯磺酸酯類潛在基因毒性雜質(zhì)：氨氯地平氮氧化物和4-(2-(1，3-二氫 -二氧代異吲哚啉-2-基)乙氧基)-3-氧代丁酸乙酯(以下簡(jiǎn)稱雜質(zhì)A和B，結(jié)構(gòu)見圖1)，并依據(jù)化合物的極性和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合所需控制的雜質(zhì)限度，開發(fā)靈敏度高、專屬性強(qiáng)的LC/MS方法[9-11]對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，為苯磺酸氨氯地平膠囊的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

圖1 苯磺酸氨氯地平中潛在基因毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu) Fig.1 Potential genotoxic impurities in amlodipine besylate

1 儀器與試藥

1.1儀器 Triple Quad 5500液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó) AB Sciex公司)；SQP電子分析天平(美國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器公司)；KH-500E超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器)；H1850離心機(jī)(湖南湘儀儀器實(shí)驗(yàn)室開發(fā)公司)。

1.2試藥 氨氯地平氮氧化合物(Standardpharm公司，批號(hào)：1919336A-SL-01)、4-(2-(1，3-二氫 -二氧代異吲哚啉-2-基)乙氧基)-3-氧代丁酸乙酯(Standardpharm公司，批號(hào)：1819345A-SL-01)，苯磺酸氨氯地平膠囊(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，批號(hào)：V180901、V180902、V180903)，參比制劑苯磺酸氨氯地平膠囊(Pfizer SA公司，批號(hào)：B217802B)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Agilent poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；流速為 0.5 mL·min-1；柱溫為40 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度5 ℃；進(jìn)樣體積為2 μL；流動(dòng)相A為5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈溶液，按以下條件(表1)進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫條件 Tab.1 Conditions of gradient elution

電噴霧離子源(ESI)，正離子模式采集，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)；雜質(zhì)A和B的定量離子對(duì)分別為 423.0/334.0和320.1/174.0；干燥氣離子源溫度為 600 ℃；干燥氣流速為 35.0 psi；霧化離子化電壓為 5500 V；霧化氣50 psi；輔助加熱氣50 psi；傳輸電壓為 85 V；碎裂電壓為 15 V；掃描范圍為m/z100～500，質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 雜質(zhì)A和B的質(zhì)譜圖 Fig.2 Mass spectrum of impurity A and B

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取雜質(zhì)A和B對(duì)照品適量，用乙腈稀釋成每毫升含雜質(zhì)A 22 ng·mL-1、雜質(zhì)B 22 ng·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取苯磺酸氨氯地平膠囊內(nèi)容物適量(相當(dāng)于苯磺酸氨氯地平5.0 mg)，置50 mL離心管中，精密加入溶劑乙腈25 mL，渦旋，超聲5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液作為供試品溶液。

2.2.3空白溶液的制備 取乙腈濾過后即可。

2.3專屬性考察 取各個(gè)雜質(zhì)的對(duì)照品溶液、加標(biāo)供試品溶液(100%濃度水平)及空白溶液，依法測(cè)定。得到的色譜圖表明：各雜質(zhì)對(duì)照品溶液及加標(biāo)供試品溶液在同一位置顯示目標(biāo)分子量峰，空白溶液無(wú)干擾，本方法專屬性良好，典型色譜圖見圖3。

圖3 雜質(zhì)對(duì)照品及樣品質(zhì)譜圖 Fig.3 Mass spectrum of impurities and sample

2.4定量限與檢測(cè)限考察 精密稱取各雜質(zhì)對(duì)照品適量，加乙腈配制成每毫升含雜質(zhì)A約4.5 ng·mL-1，雜質(zhì)B約4.3 ng·mL-1的溶液，作為定量限溶液，依法檢測(cè)6次。結(jié)果表明：各雜質(zhì)6次測(cè)試結(jié)果信噪比約等于10；雜質(zhì)A和B連續(xù)6針定量限溶液中目標(biāo)峰峰面積的RSD分別為2.0%和0.8%，本方法定量限能滿足需求。

精密量取定量限溶液2.5 mL，置于5 mL量瓶中，加乙腈定容，制成每毫升含雜質(zhì)A約2.3 ng·mL-1，雜質(zhì)B約2.2 ng·mL-1的溶液，作為檢測(cè)限溶液，依法檢測(cè)6次。結(jié)果表明：各雜質(zhì)6次測(cè)試結(jié)果信噪比約等于3，本方法檢測(cè)限能滿足需求。

2.5線性關(guān)系考察 精密稱取雜質(zhì)A和B對(duì)照品各10.255和9.986 mg，分別置于100 mL量瓶，加乙腈溶解并定容至刻度。精密量取上述溶液各0.22 mL置于100 mL量瓶，加乙腈定容至刻度，制得含兩雜質(zhì)濃度分別為225.6和219.7 ng·mL-1的雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液(1000%限度濃度)。分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2，0.5，1，1.5和2，0 mL置于10 mL量瓶，加乙腈定容至刻度，制得含雜質(zhì)A濃度為4.51，11.28，22.56，33.84，45.12 ng·mL-1；雜質(zhì)B濃度為4.39，10.98，21.97，32.95，43.93 ng·mL-1各共5個(gè)濃度水平的線性溶液。將上述溶液依次依法測(cè)定，結(jié)果見表2。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，可得雜質(zhì)A線性方程為Y=8.164×104X+70 146(r=0.990)；雜質(zhì)B線性方程為Y=2.362×105X+35 610(r=1.000)。結(jié)果表明：雜質(zhì)A在4.51～45.12 ng·mL-1，雜質(zhì)B在4.39～43.93 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表2 線性考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Tab.2 Linearity of two kinds of impurities

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下各雜質(zhì)100%濃度水平溶液(含雜質(zhì)A和B的濃度分別為22.56和21.97 ng·mL-1)，依法連續(xù)測(cè)定6次，分別計(jì)算雜質(zhì)A和B含量的RSD值。結(jié)果表明：各雜質(zhì)6次測(cè)定結(jié)果的RSD分別為0.6%和0.5%，本方法精密度良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 另由不同研究實(shí)驗(yàn)人員在不同時(shí)間重復(fù)“2.6”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)，重新配制各雜質(zhì)100%濃度水平溶液(含雜質(zhì)A和B的濃度分別為22.52 ng·mL-1和22.03 ng·mL-1)，依法連續(xù)測(cè)定6次，分別計(jì)算雜質(zhì)A和B含量的RSD值。結(jié)果表明：各雜質(zhì)6次測(cè)定結(jié)果的RSD分別為0.6%和0.8%，二名研究實(shí)驗(yàn)人員共12次測(cè)定中，雜質(zhì)A的RSD為1.6%，雜質(zhì)B的RSD為2.2%。本方法中間精密度良好。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液(1000%限度濃度)10 mL置于100 mL容量瓶，加乙腈定容至刻度，作為對(duì)照品溶液。精密稱取苯磺酸氨氯地平膠囊內(nèi)容物適量，置50 mL離心管中，加入25 mL對(duì)照品溶液，渦旋，超聲5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液作為加標(biāo)供試品溶液。在0，12，25 h依法檢測(cè)，并與初始測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明：對(duì)照品溶液和加標(biāo)供試品溶液放置25 h后，各個(gè)雜質(zhì)含量的變化均在80～120%之間，對(duì)照品溶液和供試品溶液在25 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn) 配制“2.5”項(xiàng)下雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密量取2.5，5和7.5 mL至50 mL容量瓶，加乙腈定容至刻度，制得50%，100%和150%濃度對(duì)照品溶液。精密稱取苯磺酸氨氯地平膠囊內(nèi)容物適量(相當(dāng)于苯磺酸氨氯地平5.0 mg)，分別置于3個(gè)50 mL離心管中，分別精密量取加入上述3個(gè)濃度對(duì)照品溶液25 mL，旋渦，超聲5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，作為50%、100%、150%濃度加標(biāo)供試品溶液。各濃度加標(biāo)供試品溶液平行配置3份。取上述溶液依法檢測(cè)，計(jì)算各濃度平均回收率，并計(jì)算RSD值，結(jié)果見表3，4。

表3 雜質(zhì)A加樣回收率的測(cè)定結(jié)果 Tab.3 Recovery result of impurity A

表4 雜質(zhì)B加樣回收率的測(cè)定結(jié)果 Tab.4 Recovery result of impurity B

結(jié)果表明：雜質(zhì)A加樣回收率范圍為99.7%～104.3%，RSD為1.5%；雜質(zhì)B加樣回收率范圍為100.5%～103.8%，RSD為1.0%。本方法準(zhǔn)確度良好。

2.10樣品含量測(cè)定 取麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠不同批號(hào)的樣品3批(批號(hào)：V180901，V180902，V180903)，Pfizer SA參比制劑1批(批號(hào)：B217802B)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算出不同樣品中雜質(zhì)A和B的含量。結(jié)果上述4批樣品中均未檢測(cè)出雜質(zhì)A和B。

3 討論

依據(jù)ICH M7和《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版“遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則”[12]，結(jié)合苯磺酸氨氯地平膠囊的最大日用劑量，使用毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)計(jì)算出苯磺酸氨氯地平膠囊中兩種潛在基因毒性雜質(zhì)的可接限度為110×10-6。由于基因毒性雜質(zhì)在極低的濃度水平時(shí)也可能導(dǎo)致DNA突變，其測(cè)定分析有較強(qiáng)的挑戰(zhàn)。待測(cè)定的潛在基因毒性雜質(zhì)從結(jié)構(gòu)上看均含有苯環(huán)基團(tuán)，有一定的紫外吸收強(qiáng)度，但預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPLC紫外檢測(cè)器靈敏度無(wú)法滿足雜質(zhì)控制的需求，故選用靈敏度高、專屬性強(qiáng)的LC-MS/MS方法，對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)中考察了不同類型的色譜柱，結(jié)果表明Agilent poroshell 120 EC-C18(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)上的分離度和峰型最佳。由于該色譜柱填料粒度較細(xì)，為2.7 μm，為避免壓力過大，優(yōu)選流速為0.5 mL·min-1；流動(dòng)相A和B中均加入0.1%甲酸，用以提高待測(cè)定組分在質(zhì)譜中的離子化效率，改善其峰型。

從兩個(gè)潛在基因毒性雜質(zhì)的來(lái)源上來(lái)看，雜質(zhì)B為氨氯地平合成過程中的中間體，為非降解雜質(zhì)，僅有較低的殘留風(fēng)險(xiǎn)，建議在原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行控制；雜質(zhì)A為氨氯地平的潛在氧化降解雜質(zhì)，應(yīng)結(jié)合多批次穩(wěn)定性數(shù)據(jù)評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)。

從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，國(guó)產(chǎn)與原研進(jìn)口的苯磺酸氨氯地平膠囊均未檢出上述潛在基因毒性雜質(zhì)，質(zhì)量趨向一致。本研究首次開發(fā)LC-MS/MS法對(duì)苯磺酸氨氯地平膠囊中的非磺酸酯類潛在基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定，所開發(fā)的方法也可供苯磺酸氨氯地平原料藥及其他劑型參考，為進(jìn)一步規(guī)范強(qiáng)化本類藥物的質(zhì)量提供技術(shù)支持。