王珊珊，徐 昊，梁 祺，楊 彤，李澤康，侯培媚，葛金文*

? 藥理與臨床?

僵蠶提取液激活凝血因子XII介導(dǎo)缺血再灌注大鼠血管新生研究

王珊珊1, 2，徐 昊1, 2，梁 祺1, 2，楊 彤1, 2，李澤康2, 3，侯培媚2, 4，葛金文1, 2*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208 4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿與康復(fù)學(xué)院，湖南 長沙 410208

基于接觸系統(tǒng)探討僵蠶提取液激活凝血因子XII（coagulation factor XII，F(xiàn)XII）對缺血性腦卒中大鼠血管新生的干預(yù)作用。檢測僵蠶提取液干預(yù)血漿凝血四項(xiàng)，體外檢測僵蠶提取液對FXII及其下游底物激肽釋放酶（kallikrein-kinin，KK）的激活作用。通過大鼠腦缺血再灌注損傷模型，檢測大鼠的腦形態(tài)學(xué)及FXII、KK、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial cell growth factors，VEGF）、CD31、Brdu+/vWF+蛋白表達(dá)；通過氧糖剝奪模型，檢測大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞增殖情況及VEGF的表達(dá)。采用LC-MS鑒定僵蠶提取液藥效物質(zhì)。在體外實(shí)驗(yàn)中，僵蠶提取液延長了人血漿部分凝血酶原時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）（＜0.05），激活FXII并導(dǎo)致下游底物KK的生成，呈劑量相關(guān)性（＜0.05）；在大鼠腦缺血再灌注模型中，僵蠶提取液改善了大鼠神經(jīng)元損傷，激活了FXII，導(dǎo)致KK生成和VEGF、CD31、Brdu+/vWF+的表達(dá)增加（＜0.05、0.01）；在細(xì)胞氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)中，僵蠶提取液干預(yù)提高了大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和VEGF的表達(dá)（＜0.05）。LC-MS鑒定僵蠶提取液含代謝物共計(jì)809個(gè)。僵蠶提取液可改善缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷，其機(jī)制可能與抗凝和促腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有關(guān)。

缺血性腦卒中；僵蠶；凝血因子XII；緩激肽；血管內(nèi)皮生長因子

缺血性腦卒中（ischemia stroke，IS）是臨床高發(fā)病、高致殘性疾病，是現(xiàn)今人類死亡率最高的3大疾病之一。1990—2017年所有死因排名中，卒中排名已上升至第1位[1]，其中，IS占比87%[2]，是血栓性疾病臨床防治的難點(diǎn)、熱點(diǎn)。目前研究認(rèn)為IS是血栓形成和炎癥聯(lián)合遞進(jìn)反應(yīng)的結(jié)果[3]。血栓的形成涉及血小板和凝血級聯(lián)，其中凝血系統(tǒng)的激活促進(jìn)了穩(wěn)定血凝塊的生成，是IS發(fā)病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制，因此，目前針對IS的防治以抑制凝血因子（如凝血因子Хa、凝血酶）活性的抗凝或促纖溶為主。在凝血級聯(lián)反應(yīng)中，凝血因子XII（coagulation factor XII，F(xiàn)XII）的作用非常特殊，盡管許多研究認(rèn)為FXII的激活與IS預(yù)后不良有關(guān)[4]，但I(xiàn)S死亡率和二次腦梗發(fā)生率與血漿FXII水平不呈正相關(guān)。而FXII激活還可引起接觸、纖溶、補(bǔ)體等系統(tǒng)的激活，這些通路與促凝的內(nèi)源性凝血途徑并不同步發(fā)生，提示其多靶點(diǎn)作用可能從多途徑調(diào)控了IS的病理轉(zhuǎn)歸。

接觸系統(tǒng)是FXII通過與負(fù)電荷表面接觸而發(fā)生構(gòu)象改變，激活生成FXIIa，促進(jìn)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活同時(shí)加速血漿激肽釋放酶原（plasma kallikreinogen，PK）活化生成激肽釋放酶（kallikrein-kinin，KK），導(dǎo)致高分子激肽原（high molecular weight kininogen，HK）裂解，促進(jìn)血管活性物質(zhì)緩激肽（bradykinin，BK）的產(chǎn)生[5-7]。在其他疾病病機(jī)研究中，BK有2個(gè)對應(yīng)受體（BKR1、BKR2），BK與BKR2結(jié)合可促進(jìn)腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)，從而有利于血管新生[8-9]。但是否在IS發(fā)病中存在類似的生理機(jī)制目前并不清楚。

僵蠶是蠶蛾科昆蟲家蠶Linnaeus 4～5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌(Bals.) Vuillant而致死的干燥體，具有抗凝血、抗血栓、促纖溶等功效，能夠有效延長動物血漿部分凝血酶原時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT），主要抑制了FII及FⅩa的活性，提示了其對IS的干預(yù)效應(yīng)[10-12]。IS的防治中溶栓、抗凝均有狹窄的時(shí)間窗伴出血并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致臨床使用受限。僵蠶經(jīng)提取后雖具有抗凝效應(yīng)，但其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中并未引起實(shí)驗(yàn)動物明顯的出血并發(fā)癥，其可能的機(jī)制目前尚未闡明，本實(shí)驗(yàn)擬針對僵蠶提取液干預(yù)FXII開展相關(guān)研究。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（220±10）g，4周齡，購自斯萊克景達(dá)有限公司，合格證號SCXK（湘）2019-0004。動物于溫度（26±2）℃環(huán)境下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號LL2019092009）。

1.2 細(xì)胞

大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞（批號CM-R108、CL-0001）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 藥材

實(shí)驗(yàn)用僵蠶于2020年3月購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科鄧桂明教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶4～5周齡幼蟲感染白僵菌素致死的干燥體。

1.4 藥品與試劑

APTT、PT、TT、FIB試劑盒（批號251730、114145、2551325、251560）購自法國Stago公司；FXII激活劑Bismuth subgallate（批號HY-B1560）購自美國MedChemExpress公司；BKR2抑制劑Icatibant acetate（批號S5695）購自美國Selleck生物科技有限公司；FXII抗體（批號DF6558）、KK抗體（批號DF7271）購自Affinity公司；VEGF抗體（批號Ab214424）購自英國Abcam公司；CD31抗體（批號GB11063-2）、β-actin（批號GB15003）、兔二抗（批號HG-SAR00002b）、鼠二抗（批號HG-SAM00001b）購自賽維爾生物科技有限公司；核轉(zhuǎn)試劑盒（批號V4XC-2024）購自美國Lonza公司；CCK8試劑盒（批號BS350B）購自Biosharp公司。

1.5 儀器

Cytation 3多功能酶標(biāo)儀（美國Biotake公司）；STA Compact Max全自動血凝儀（法國Stago公司）；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、GelDocXR＋凝膠成像系統(tǒng)、Mini Trans-Blot型轉(zhuǎn)印槽、PowerPac?基礎(chǔ)電泳儀電源（美國Bio-Rad公司）；4D-NucleofectorTMCore Unit核轉(zhuǎn)儀（美國Lonza公司）。

2 方法

2.1 僵蠶提取液制備

稱定白僵蠶100.0 g，煎煮沸騰30 min，煎煮2次，75%乙醇醇沉，4 ℃過夜；相對分子質(zhì)量5000透析袋中透析，得到僵蠶提取液，高壓滅菌后配制成105 mg/L，分裝，封口，于4 ℃保存。水煎僵蠶浸出物得率為44.2%，醇沉后得率20.9%，最終僵蠶提取液得率為15.1%，符合《中國藥典》僵蠶浸出物標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 血漿制備

2.2.1 人血漿制備 健康人全血（納入標(biāo)準(zhǔn)：20～65歲，無感冒、高血壓、冠心病等急慢性疾病，無阿司匹林、華法林等抗凝藥物服用史）來源于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康管理科。于湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治實(shí)驗(yàn)室離心制備成血漿，分裝后于?80 ℃保存（6個(gè)月內(nèi)）。

2.2.2 動物空白血清、血漿制備 4周齡雄性SD適應(yīng)性喂養(yǎng)12 h后，ip 1 mL生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d，于末次處理后6 h，ip 3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，部分全血裝入5 mL空白管中，部分全血裝入2 mL枸櫞酸鈉采血管中，編號，3500 r/min（血清4 ℃靜置過夜）離心10 min得到大鼠空白血清、血漿，分裝后于?80 ℃保存。

2.2.3 動物含藥血漿制備 4周齡雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)12 h后，ip 1 mL僵蠶提取液（105 mg/L），1次/d，連續(xù)7 d，于末次給藥后6 h，ip 25%烏拉坦（4 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，全血裝入2 mL枸櫞酸鈉采血管中，編號，3500 r/min離心10 min得到大鼠含藥血漿，分裝后于?80 ℃保存。

2.3 過表達(dá)FXII蛋白的HEK-293細(xì)胞制備

HEK-293細(xì)胞按核轉(zhuǎn)試劑盒說明書操作轉(zhuǎn)入FXII質(zhì)粒，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染率可達(dá)95%，用G418篩選，獲穩(wěn)定表達(dá)FXII蛋白的HEK-293細(xì)胞。收集細(xì)胞上清液，10 μL/s上樣蛋白純化柱，0.25 nmol/L咪唑洗脫可得FXII純化蛋白。

2.4 凝集實(shí)驗(yàn)

取健康人全血漿150 μL，分別加入150 μL 3、6、9 g/L僵蠶提取液或生理鹽水，分別設(shè)為僵蠶提取液低、中、高劑量組和空白組，37 ℃孵育5 min，全自動血凝儀檢測并記錄PT、APTT、TT、FIB。

2.5 FXII激活實(shí)驗(yàn)

含F(xiàn)XII蛋白的細(xì)胞懸液，加入40 μL不同質(zhì)量濃度（0.15、0.30、0.60、1.20 g/L）的僵蠶提取液，空白組加入生理鹽水，激動劑組加入3.94×10?6g/L Bismuth subgallate，37 ℃孵育5 min，加入2×SDS上樣緩沖液和2.5% β-ME，熱水浴5 min后，上樣10%丙烯酰胺膠，12 μL/孔，100 V跑膠，120 V濕轉(zhuǎn)2 h后，于脫脂牛奶中封閉1 h，加入FXII抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入二抗，37 ℃孵育1 h，以ECL發(fā)光法于Bio-Rad ChemiDocTM成像系統(tǒng)顯影。

2.6 KK生成實(shí)驗(yàn)

取人血漿20 μL，按“2.5”項(xiàng)下方法處理樣本后（僵蠶提取液質(zhì)量濃度為0.6、1.2 g/L），上樣于8%丙烯酰胺膠，30 μL/孔，100 V跑膠，120 V濕轉(zhuǎn)2 h后，于脫脂牛奶中封閉1 h，加入KK抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入二抗，37 ℃孵育1 h，以ECL發(fā)光法于Bio-Rad ChemiDocTM成像系統(tǒng)顯影。

96孔板每孔加入20 μL人全血漿或缺FXII血漿，再分別加入40 μL僵蠶提取液（1 g/L），用40 μL生理鹽水作為空白對照組、40 μL高嶺土溶液作為陽性對照組。37 ℃孵育5 min，加入20 μL 5 mg/L S-2302，在酶標(biāo)儀上37 ℃孵育30 min，每5分鐘測定405 nm處的吸光度（）值。

2.7 動物模型制備

30只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)12 h后，隨機(jī)分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、肝素組（150 IU）和僵蠶低、中、高劑量（0.45、0.9、1.8 mg/g，26.25、52.50、105.00 mg/L的僵蠶提取液）組。除空白組外，其余大鼠分離雙側(cè)頸總動脈，在小動物散斑成像儀下，用動脈夾夾閉1.5 min后放開1 min，連續(xù)操作5次后，成像儀中可見明顯微血管血流減少（30±5）%，縫合皮膚。空白組僅分離雙側(cè)頸總動脈后縫合皮膚，手術(shù)后各組連續(xù)ip 1.2 mL相應(yīng)藥物3 d，處死取材。

2.8 大鼠腦組織指標(biāo)檢測

將各組大鼠腦組織采用4%多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明等步驟包埋制成石蠟塊，切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦組織病理變化；孵育KK、CD31、Brdu/vWF抗體，于顯微鏡下觀察并拍照。取大鼠腦組織，于冰上勻漿，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，孵育FXII、KK、VEGF抗體及二抗，顯影。

2.9 氧糖剝奪模型制備

將大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分為空白組（10 μL 生理鹽水）、空白血漿組（10%空白血漿）、僵蠶提取液聯(lián)合血漿組（10% 26.25 mg/L僵蠶提取液＋10%空白血漿）、僵蠶提取液含藥血漿組（10%僵蠶提取液含藥血漿）、肝素組（10 IU肝素＋10%空白血漿）、激活劑組（10 nmol/L Bismuth subgallate＋10%空白血漿）、空白血清組（10%空白血清）、BKR2抑制劑組（15 nmol/L Icatibant acetate＋10%僵蠶提取液含藥血漿），采用無糖培養(yǎng)基，5% CO2、1% O2條件下培養(yǎng)12 h，復(fù)氧30 min后，于顯微鏡下觀察并拍照，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，采用Western blotting法測定細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)。

2.10 液相-色譜聯(lián)用（LC-MS）鑒定僵蠶提取液代謝物

僵蠶提取液非靶代謝組學(xué)鑒定和分析由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，公司通過代謝物提取、LC-MS/MS檢測以及數(shù)據(jù)分析等，得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，具體實(shí)驗(yàn)條件如下：Hyperil Gold C18色譜柱，正離子模式下，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～1.5 min，98% A；1.5～3 min，98%～15% A；3～10 min，15%～0 A；10～10.1 min，0～98% A；10.1～12 min，98% A。負(fù)離子模式下，流動相為pH 9的5 mmol/L醋酸銨水溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫：0～1.5 min，2% B；1.5～3 min，2%～85% B；3～10 min，85%～100% B；10～10.1 min，100%～2% B；10.1～12 min，2% B。柱溫40 ℃；體積流量0.2 mL/min。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 僵蠶提取液對健康成人凝血時(shí)間的影響

如圖1所示，僵蠶提取液顯著延長人PT、APTT、TT（＜0.05），呈劑量相關(guān)性；而FIB無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

與空白組比較：*P＜0.05，圖2、3同

3.2 僵蠶提取液對FXII的激活水平的影響

如圖2所示，僵蠶提取液處理后，F(xiàn)XII原型蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05）；隨著僵蠶提取液質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)XII原型蛋白表達(dá)逐漸降低，0.30 g/L僵蠶提取液與FXII純化蛋白溶液1∶1混合孵育，即可使FXII蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05），1.20 g/L僵蠶提取液干預(yù)下，F(xiàn)XII蛋白表達(dá)減少趨近于FXII激活劑的作用效果。

3.3 僵蠶提取液對血漿中KK表達(dá)的影響

如圖3-A所示，僵蠶提取液干預(yù)后，血漿KK表達(dá)量明顯增加，呈劑量相關(guān)性（＜0.05）；如圖3-B所示，在動力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，僵蠶提取液導(dǎo)致血漿中KK表達(dá)量增加較空白組更為明顯，在5 min時(shí)緩慢起效，隨著時(shí)間的增加，其表達(dá)快速增加，至25 min時(shí)，增加趨勢開始減緩，在FXII缺乏的血漿中，這種增加的趨勢消失（＜0.05）。

圖2 僵蠶提取液對FXII蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖3 Western blotting (A) 和酶標(biāo)儀(B) 檢測僵蠶提取液對血漿中KK表達(dá)的影響(, n = 3)

3.4 缺血再灌注損傷大鼠模型的驗(yàn)證

如圖4所示，雙側(cè)頸總動脈反復(fù)結(jié)扎損傷后，大鼠腦血流量明顯減少，以右側(cè)腦減少更為明顯，部分小血管血流消失，血管分支變細(xì)或消失，平均血流減少30%。

3.5 僵蠶提取液對缺血再灌注損傷大鼠腦形態(tài)學(xué)改變的影響

如圖5所示，與空白組比較，模型組腦組織鏡下可見大量的細(xì)胞凋亡，部分細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)成空泡狀。僵蠶提取液干預(yù)后，核固縮細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞紋理清晰，空泡減少，呈劑量相關(guān)性。

圖4 缺血再灌注大鼠腦血流圖

圖5 僵蠶提取液對缺血再灌注損傷大鼠腦形態(tài)學(xué)影響(HE, ×200)

3.6 僵蠶提取液對缺血再灌注大鼠腦組織腦激肽釋放系統(tǒng)和血管新生的影響

如圖6所示，與空白組比較，模型組和肝素組FXII蛋白激活不明顯，KK和VEGF蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05）。與模型組比較，僵蠶提取液組FXII原型蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性，提示蛋白大量激活；KK和VEGF蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

如圖7所示，在KK的免疫熒光實(shí)驗(yàn)中也得到Western blotting類似的結(jié)果，與空白組比較，KK表達(dá)在各組中均增加（＜0.05），但僵蠶提取液組更佳，且劑量相關(guān)性。在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，與空白組比較，模型組、肝素組CD31和Brdu+/vWF+未見明顯增加；與模型組比較，僵蠶提取液組CD31和Brdu+/vWF+有明顯表達(dá)（＜0.05、0.01），且劑量相關(guān)性。

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，圖7同

圖7 僵蠶提取液對缺血再灌注損傷大鼠腦血管生成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.7 僵蠶提取液對氧糖剝奪模型大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

如圖8所示，在同時(shí)造模后，各組細(xì)胞均有所改變，出現(xiàn)細(xì)胞固縮、透光性降低改變，空白血漿組和FXII激活劑組有明顯的纖維蛋白生成，鏡下可見明顯的纖維蛋白團(tuán)塊和纖維蛋白絲。空白組、肝素組、空白血清組和BKR2抑制劑組雖未見明顯的纖維蛋白凝塊，但貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，固縮明顯，透光性差，細(xì)胞增殖不良。僵蠶提取液和大鼠血漿共同干預(yù)下，未見明顯纖維蛋白團(tuán)塊，其細(xì)胞數(shù)量也明顯高于血漿組，但細(xì)胞可見部分死亡和固縮現(xiàn)象。僵蠶提取液含藥血漿組細(xì)胞狀態(tài)明顯優(yōu)于其他處理組，細(xì)胞透光性強(qiáng)，未見明顯細(xì)胞死亡和形態(tài)改變。

圖8 僵蠶提取液對氧糖剝奪模型大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

3.8 僵蠶提取液對氧糖剝奪模型大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

如圖9所示，與空白血漿組比較，肝素組、僵蠶提取液聯(lián)合血漿組和僵蠶提取液含藥血漿組內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯，其中僵蠶提取液含藥血漿組效果最為明顯（＜0.01）。但與空白組和空白血漿組比較，僅僵蠶提取液聯(lián)合血漿組和僵蠶提取液含藥血漿組VEGF蛋白表達(dá)明顯增加（＜0.05）。

3.9 LC-MS鑒定僵蠶提取液非靶代謝物

LC-MS共鑒定僵蠶提取液非靶代謝物809個(gè)，其中，正離子模式鑒定代謝物479個(gè)，負(fù)離子模式鑒定代謝物330個(gè)，共計(jì)有21個(gè)含量較高的代謝物（峰面積/總面積≥1.0%，見圖10和表1）。

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與空白血漿組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

圖10 正 (A)、負(fù) (B) 離子模式下的僵蠶提取液TIC圖

表1 僵蠶提取液21個(gè)高含量代謝物

4 討論

IS是一種高發(fā)病率、高致死率的疾病，隨著發(fā)病率的逐年增加，呈年輕化趨勢，其病機(jī)和開發(fā)新的防治藥物仍為研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為IS病程轉(zhuǎn)歸不但與血栓形成有關(guān)，炎癥導(dǎo)致的無復(fù)流現(xiàn)象也影響疾病的預(yù)后。FXII是內(nèi)源性凝血途徑的啟動因子[13]，研究認(rèn)為FXII促進(jìn)血栓的形成，引起局部組織水腫，不利于IS的恢復(fù)，但FXII激活對下游底物的作用效果并不同步。研究表明FXII活化后最先激活PK，導(dǎo)致BK生成。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)BK可通過與細(xì)胞表面BKR2結(jié)合，促進(jìn)VEGF生成，參與血管新生，提示了FXII在IS發(fā)病中可能還發(fā)揮著有利的生理功能。

《本草綱目》記載僵蠶具有“治風(fēng)化痰，散結(jié)行經(jīng)”之功，常被用于治療IS的配伍方劑中，以助活血化瘀之效。本課題組前期研究證實(shí)僵蠶經(jīng)提取后具有延長兔凝血時(shí)間的作用，與肝素類似[12]。本研究中將僵蠶按原法再次提取，在人血漿體外實(shí)驗(yàn)中得到了相同結(jié)果，再次證實(shí)了僵蠶提取液良好的抗凝活性。然而，這種提取工藝下的僵蠶提取液在與FXII共孵育后，降低了FXII原型蛋白含量，提示其導(dǎo)致蛋白水解。為證實(shí)FXII的激活，檢測了一系列下游蛋白的活化情況。結(jié)果顯示，僵蠶提取液干預(yù)后血漿中KK含量明顯增多，這一效果在缺乏FXII血漿中消失。但其作用弱于FXII激活劑高嶺土和Bismuth subgallate，這可能與僵蠶提取液水解FXII的位點(diǎn)有關(guān)。提示僵蠶提取液對FXII的激活作用主要導(dǎo)致了接觸系統(tǒng)的活化。

為闡明僵蠶提取液在其中的作用，本課題組運(yùn)用大鼠缺血再灌注模型觀察僵蠶的藥效機(jī)制。在均一造模條件下，隨著僵蠶提取液干預(yù)濃度的增加，大鼠腦神經(jīng)元損傷程度減輕，腦組織中FXII原型蛋白減少，但外周血FXII的含量無明顯改變，且抗凝效果明顯弱于體外實(shí)驗(yàn)，提示僵蠶提取液中活性成分并非直接激活血液中的XII發(fā)揮IS干預(yù)效應(yīng)。同時(shí)，造模后腦內(nèi)KK和VEGF的生成也有增加，但并無血管新生，只有僵蠶提取液干預(yù)下可見明顯新生血管。新生的血管可提高缺血區(qū)血供，有利于緩解腦缺血后的組織損傷，僵蠶提取液可能從這一途徑改善了大鼠腦缺血再灌注的轉(zhuǎn)歸。為證實(shí)這一假說，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)開展進(jìn)一步研究。本研究用僵蠶提取液直接干預(yù)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其并無增殖效應(yīng)，提示僵蠶提取液并不能直接作用導(dǎo)致細(xì)胞增殖。基于此，本研究以血漿作為基質(zhì)，以期提供FXII、PK、HK等接觸系統(tǒng)相關(guān)蛋白。氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)顯示空白血漿干預(yù)組由于血漿中凝血因子被激活，細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)有明顯纖維蛋白團(tuán)塊生成，而僵蠶提取液聯(lián)合血漿組和僵蠶提取液含藥血漿組纖維蛋白團(tuán)塊明顯減少或消失，提示僵蠶提取液具有明顯抗凝作用，但含藥血漿的抗凝效應(yīng)明顯弱于聯(lián)合干預(yù)組，提示僵蠶提取液在體內(nèi)可能經(jīng)過相關(guān)代謝減弱了其抗凝效應(yīng)。然而，血清組和肝素組由于凝血因子缺乏或抑制，也表現(xiàn)出明顯抗凝作用，但細(xì)胞凋亡明顯，提示其藥效不僅來源于抗凝效應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，僵蠶提取液干預(yù)下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)明顯增高，內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯，其中，僵蠶提取液含藥血漿組效應(yīng)優(yōu)于僵蠶提取液聯(lián)合血漿組，提示經(jīng)過體內(nèi)代謝，僵蠶提取液的促血管增殖效應(yīng)增強(qiáng)，但使用BKR2阻斷劑后，細(xì)胞增殖作用消失，提示BKR2是僵蠶發(fā)揮血管新生的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

本研究以FXII介導(dǎo)接觸系統(tǒng)激活為基礎(chǔ)進(jìn)一步證實(shí)了其在IS發(fā)病過程中血管新生的可能機(jī)制，而僵蠶提取液通過促進(jìn)FXII的激活加速了該過程的發(fā)生。基于此，本研究通過LC-MS對僵蠶提取液的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，809個(gè)已鑒定代謝物中有大量有機(jī)酸類化合物、氨基酸及脂肪族化合物等，與僵蠶蟲類藥屬性相符。后續(xù)擬進(jìn)一步鑒定比對入血和入腦化合物，以期闡明僵蠶提取液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。FXII參與了IS接觸激活和血管生成，而僵蠶提取液改善了缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能損傷，可能與抗凝聯(lián)合激活FXII導(dǎo)致緩激肽生成，介導(dǎo)VEGF生成和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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extracts activates coagulation factor Ⅻ to promote angiogenesis in rats with ischemia/reperfusion

WANG Shan-shan1, 2, XU Hao1, 2, LIANG Qi1, 2, YANG Tong1, 2, LI Ze-kang2, 3, HOU Pei-mei2, 4, GE Jin-wen1, 2

1. College of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-Cerebral Diseases, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. College of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 4. College of Acupuncture, Massage and Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To explore the interventional effect of Jiangcan () extracts as an activator of coagulation factor Ⅻ (FⅫ) on angiogenesis of rats with ischemic stroke by contact system.The effects ofextract on plasma coagulation were detected, and the activation of FXII and its downstream substrate kallikrein kinase (KK) byextract was detected. The brain morphology and expressions of FXII, KK, vascular endothelial growth factors (VEGF), CD31, Brdu+/vWF+were detected by rats model of cerebral ischemia reperfusion injury; The morphological changes, cell proliferation and VEGF expression of brain microvascular endothelial cells were detected by oxygen glucose deprivation model. The pharmacodynamic substances ofextract were identified by LC-MS.,extract prolonged the activated partial thromboplastin time (APTT), prothrombin time (PT), thrombin time (TT) (< 0.05), activated FⅫ and promoted the production of downstream substrate KK, with dose-dependent (< 0.05). In the model of cerebral ischemia reperfusion in rats,extract improved the neuronal damage of rats, activated FXII and increased the production of KK and the expressions of VEGF, CD31, Brdu+/vWF+(< 0.05, 0.01); In the cell oxygen and glucose deprivation experiment,extract increased the proliferation of brain microvascular endothelial cells and expression of VEGF in rats (< 0.05).A total of 809 metabolites inextract were identified by LC-MS.extract can ameliorate the injury of nerve function in rats with ischemia-reperfusion, and its mechanism may be related to anticoagulation and promoting the proliferation of brain microvascular endothelial cells.

ischemic stroke;; coagulation factor Ⅻ; bradykinin; vascular endothelial growth factor

R285.5

A

0253 - 2670(2022)23 - 7421 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.012

2022-08-19

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2020JJ5424）；湖南省教育廳青年基金資助項(xiàng)目（21B30386）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合“雙一流”學(xué)科開放基金資助項(xiàng)目（2020ZXYJH08）

王珊珊（1990—），女，在讀博士，講師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合防治腦血管病、中藥藥理。E-mail: 68761083@qq.com

通信作者：葛金文（1965—），男，博士，教授，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合防治腦血管病、中藥藥理。E-mail: 001267@hnucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]