徐 碩,徐文峰,姜文清,鄺詠梅,金鵬飛

北京醫(yī)院藥學(xué)部,國家老年醫(yī)學(xué)中心,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院,北京市藥物臨床風(fēng)險與個體化應(yīng)用評價重點實驗室（北京醫(yī)院）,北京 100730

木脂素類化合物又稱木脂體,該類化合物廣泛存在于五味子、陜西瑞香等中藥中,多數(shù)以游離狀態(tài)存在,也有些與糖結(jié)合成苷存在于植物的木部和樹脂中。木脂素類化合物的原始結(jié)構(gòu)骨架是一類由2 個苯丙素單元氧化聚合而成的二聚物,少數(shù)也有三聚物和四聚物。該類化合物主要分為簡單木脂素類、單環(huán)氧木脂素類、木脂素內(nèi)酯類、環(huán)木脂素類、雙環(huán)氧木脂素類、聯(lián)苯型木脂素和聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素等。近年還發(fā)現(xiàn)一些結(jié)構(gòu)新穎的木脂素類化合物,包括8-O-4′型新木脂素等[1-2]。木脂素類化合物具有抗病毒[3]、鎮(zhèn)靜催眠[4]、神經(jīng)保護[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]和抗糖尿病并發(fā)癥[7]等多種重要的生物活性。因此,很有必要對中藥中木脂素類成分進行含量測定,這對于更好地進行中藥質(zhì)量評價具有重要意義。

1 總木脂素的含量測定

李曉光等[8]通過分光光度法對廣東產(chǎn)海風(fēng)藤藥材超臨界二氧化碳萃取物中總木脂素含量進行測定。以五味子酯甲為對照品,利用變色酸比色法在570 nm 波長處測定吸光度值A(chǔ),結(jié)果顯示,五味子酯甲在21.2～212.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,測定6批樣品中總木脂素含量為93.1～100.2 mg·g-1。

張穎等[9]采用紫外分光光度法建立了刺五加莖中總木脂素的含量測定方法。樣品中加入體積分數(shù)為60%的乙醇回流提取,以刺五加苷E為對照品,利用變色酸比色法在560 nm 波長處測定吸光度值A(chǔ),結(jié)果顯示,刺五加苷E 在6.93～23.1 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,3批樣品中總木脂素含量為1.61%～1.63%。

盧曦等[10]以紫外-可見分光光度法測定黑老虎藥材中總木脂素的含量。樣品中加入甲醇回流提取,以五味子酯甲為對照品,在571 nm 波長處測定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果顯示,五味子酯甲在0.008 16～0.040 8 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,產(chǎn)地為廣西防城的藥材中總木脂素含量最高。

黃坤等[11]采用紫外分光光度法測定不同產(chǎn)地桃兒七中總木脂素的含量。樣品中加入體積分數(shù)為70%的甲醇超聲提取,以鬼臼毒素為對照品,通過參比波長法在292、392 nm 波長處測定,結(jié)果顯示,鬼臼毒素質(zhì)量濃度在7.78～93.36 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測定不同產(chǎn)地共126個桃兒七樣品中總木脂素含量,結(jié)果表明,以產(chǎn)自甘肅省永登縣自然保護區(qū)樣地的樣品含量最高（為20.66%）,產(chǎn)自西藏自治區(qū)江達同普鄉(xiāng)樣地的樣品含量最低（為5.46%）。

袁子民等[12]以紫外分光光度法測定肉豆蔻與麩煨肉豆蔻中總木脂素的含量。樣品中加入甲醇超聲提取,以去氫二異丁香酚為對照品,測定波長為275 nm,結(jié)果顯示,去氫二異丁香酚質(zhì)量濃度在1.5～9.0 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,10批肉豆蔻、麩煨肉豆蔻中總木脂素含量分別為0.913%～1.76%、1.17%～2.21%。

趙金鹿等[13]通過紫外分光光度法測定了哥王中總木脂素的含量。樣品中加入體積分數(shù)為70%的乙醇回流提取,以羅漢松脂酚為對照品,測定波長為280 nm,總木脂素的質(zhì)量濃度在10.0～60.0μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,測定9批樣品中總木脂素含量為5.14～29.78 mg·g-1,產(chǎn)地為廣東、江西的藥材中總木脂素含量較高,產(chǎn)地為貴州省、廣西桂林的含量最低。

杜為軍等[14]采用紫外分光光度法測定毛頭牛蒡子中總木脂素的含量。樣品中加入體積分數(shù)為95%的乙醇回流提取,以牛蒡苷為對照品,在280 nm 波長處測定。結(jié)果顯示,牛蒡苷質(zhì)量濃度在0.020 7～0.110 1 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

黃莉等[15]采用紫外分光光度法,建立了三白草藥材及其抗肝纖維化有效部位中總木脂素含量的方法。樣品中加入三氯甲烷超聲提取,以三白草酮為對照品,檢測波長為244 nm,結(jié)果顯示,三白草酮質(zhì)量濃度在1.94～15.52μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,三白草藥材和有效部位平均回收率分別為99.6%、99.3%,3批三白草及有效部位樣品中總木脂素含量分別為1.30%～1.69%、40.7%～52.6%。

李春沁等[16]建立了波棱瓜子藥材中總木脂素的含量測定方法。樣品中加入石油醚加熱回流脫脂,將脫脂后殘渣揮干,加入體積分數(shù)為95%的乙醇加熱回流提取,以木脂素balanophonin為對照品,采用變色酸-硫酸顯色體系,在566 nm 波長處測定。結(jié)果顯示,balanophonin在5.01～17.535μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系,平均加樣回收率為98.36%,3批樣品中總木脂素含量為2.91%～3.41%。

2 木脂素單體成分的含量測定

2.1 高效液相色譜（HPLC）法

李曉光等[8]對廣東海風(fēng)藤進行超臨界二氧化碳萃取,萃取壓力為10 MPa,萃取溫度為45℃,分離壓力為5 MPa,分離溫度為50℃。采用Kromasil C18柱,流動相為甲醇-水,梯度洗脫,檢測波長為250 nm。結(jié)果顯示,萃取物中五味子乙素在0.384～2.304μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,6份樣品中五味子乙素的含量為24.48～26.32 mg·g-1。

黃坤等[11]對不同產(chǎn)地桃兒七中鬼臼毒素的含量進行測定。樣品中加入體積分數(shù)為40%的甲醇超聲提取,采用Boston Crest ODS C18柱,流動相為甲醇-水（50∶50）,檢測波長為290 nm,結(jié)果顯示,鬼臼毒素質(zhì)量濃度在0.007 4～0.741 5 g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,測定不同產(chǎn)地共126個桃兒七樣品中鬼臼毒素的含量,以產(chǎn)自甘肅省永登縣自然保護區(qū)樣地的樣品含量最高（為7.40%）,產(chǎn)自西藏自治區(qū)江達同普鄉(xiāng)樣地的樣品含量最低（為0.40%）。

趙玥等[17]測定五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量。樣品中加入甲醇超聲提取,采用Agilent TC-C18柱,流動相為甲醇-乙腈-水,梯度洗脫,檢測波長為220 nm。對遼寧鳳城地區(qū)不同環(huán)境五味子樣品進行測定,結(jié)果表明,生長在山腳樹蔭叢林中且濕潤環(huán)境下的五味子中木脂素含量最高,品質(zhì)較佳。

張萌萌等[18]建立了長形肉豆蔻中赤式-6-澳白木脂素的含量測定方法。樣品中加入甲醇超聲提取,采用Kromasil C18柱,流動相為乙腈-水（65∶35）,檢測波長為228 nm,結(jié)果顯示,赤式-6-澳白木脂素在0.22～2.24 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均加樣回收率為100.7%,5批樣品中的含量為4.08%～6.80%。

胡俊揚等[19]同時測定五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素6個木脂素類成分的含量。樣品中加入甲醇超聲提取,采用依利特C18色譜柱,流動相為乙腈-水,梯度洗脫,檢測波長為217 nm,結(jié)果顯示,6個化學(xué)成分分離度良好,各成分質(zhì)量濃度與峰面積在測定范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系,不同產(chǎn)地3批樣品中6個成分的含量分別為0.62%～0.80%、0.12%～0.33%、0.03～0.07%、0.12%～0.34%、0.37%～0.52%、0.03%～0.13%。

周艷等[20]測定不同炮制品中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、戈米辛N、五味子乙素和五味子丙素的含量。樣品中加入甲醇超聲提取,采用Kromasil-C18柱,流動相為乙腈-水,梯度洗脫,檢測波長為254 nm,結(jié)果顯示,6種成分分離度良好,與生品相比,除炮制品中五味子醇乙有提高或降低外,其他5種成分的含量均有不同程度的提高,酒浸法的炮制品中總木脂素含量最高,表明酒浸法為五味子的最佳炮制方法。

陰冠秀等[21]同時測定不同產(chǎn)地五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素的含量。樣品中加入甲醇超聲提取,采用Diamonsil C18柱,以甲醇-水（73∶27）為流動相,檢測波長為254 nm。結(jié)果顯示,5種成分的線性范圍為0.01～0.08 mg·mL-1,對不同產(chǎn)地的17份藥材進行測定,4種木脂素成分均存在一定差異,北五味子中五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素的含量稍高,五味子甲素含量較低,而南五味子與之相反。

崔妮等[22]以木脂素類成分總含量為指標,對五味子藥材中木脂素類成分的提取工藝進行優(yōu)選。采用Diamonsil C18柱,流動相為甲醇-水,梯度洗脫,檢測波長為235 nm,結(jié)果顯示,五味子中木脂素類成分最佳提取工藝為100倍甲醇超聲提取3次,每次1 h,五味子醇甲、gomisin D、gomisin H、五味子醇乙、gomisin G、gomisin B、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素可完全分離,在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其中產(chǎn)地為吉林四平的含量最高,為22.94 mg·g-1,產(chǎn)地為黑龍江雙城的含量較低,為12 mg·g-1,可能與當(dāng)?shù)氐牡乩砦恢煤蜌夂蛴嘘P(guān)。

ZHANG Q 等[23]測定了五味子中5 種木脂素的含量。用一種簡化的基質(zhì)分散固相萃?。∕SPD）提取樣品,對MSPD參數(shù)進行了考察和優(yōu)化,結(jié)果顯示,最佳的提取條件是以硅膠為分散劑,硅膠與樣品的質(zhì)量比為2∶1,用4 mL 甲醇作為洗脫溶劑,HPLC法定量采用Agilent TC-C18柱,流動相為乙腈-水,梯度洗脫,檢測波長為215 nm。MSPD 法對于5種木脂素的提取率高于傳統(tǒng)加熱回流提取法和超聲提取法,減少了對樣品、溶劑和時間的要求。測定得5份樣品中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和γ-五味子素的含量分別為2.41～6.55、1.67～2.85、0.82～1.12、0.65～1.46、1.79～3.62 mg·g-1。

楊能英等[24]測定黑老虎中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲和（2′S）-南五味子木脂素J的含量。樣品中加入乙醇超聲提取,采用ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,流動相為乙腈-甲醇-1 mL·L-1磷酸水溶液,梯度洗脫,檢測波長為214 nm。結(jié)果顯示,日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲和（2′S）-南五味子木脂素J分別在35.56～355.6、32.92～329.2、76.72～767.2 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

胡琨等[25]測定八角蓮飲片中2種木脂素類成分鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素以及2種黃酮類成分山柰酚和槲皮素的含量。樣品中加入體積分數(shù)為40%的乙醇回流提取,采用ZORBAX SB-C18柱,流動相為甲醇-1mL·L-1磷酸溶液（50∶50）,將290 nm 作為鬼臼毒素和4′-去甲基鬼臼毒素的定量波長,360 nm 作為槲皮素和山柰酚的定量波長。結(jié)果顯示,鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、山柰酚和槲皮素的線性范圍分別為0.74～3.68、2.40～12.02、0.21～1.08、0.26～1.28μg,測定12批樣品的含量分別為9.46～31.53、0.64～12.08、1.78～2.55、1.10～2.45 mg·g-1。

2.2 超高效液相色譜（UPLC）法

荊文光等[26]建立了同時測定厚樸藥材中和厚樸酚、厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚含量的方法。樣品中加入甲醇冷浸提取,采用Waters Acquity UPLC BEH-Cl8柱,以甲醇-2 mL·L-1甲酸溶液為流動相,梯度洗脫,檢測波長為294 nm。結(jié)果顯示,3種木脂素成分可實現(xiàn)完全分離,并與其他成分分離度良好,和厚樸酚、厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚分別在20.3～406.0、15.2～304.0、5.6～112.0 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系,15批樣品中3種成分含量分別為0.24%～2.65%、1.46%～2.68%、0.05%～0.87%。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法

王金葉等[27]利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法測定南五味子中3種木脂素的含量。樣品中加入乙醇超聲提取,采用Eclipse Plus C18柱,流動相為甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨,梯度洗脫,電噴霧離子源（ESI）,以多反應(yīng)監(jiān)測方式（MRM）進行正離子監(jiān)測。結(jié)果顯示,五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素分別在0.61～5 015、531.9～6 058.8、0.64～5 230 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,結(jié)果顯示,南五味子中五味子甲素含量普遍較高,五味子醇甲與五味子乙素的含量普遍較低,不同產(chǎn)地含量差異較大。

王哲等[28]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定醋五味子中五味子酯甲、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲和五味子醇乙7種木脂素的含量。樣品中加入甲醇超聲提取,采用Acquity UPLC BEH-Cl8柱,以乙腈-1 mL·L-1甲酸溶液為流動相,梯度洗脫,質(zhì)譜分析采用電噴霧正離子源,選擇離子監(jiān)測（SIM）模式。結(jié)果顯示,7個成分的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好,方法的檢出限為0.001～0.050 mg·L-1,對質(zhì)量濃度為6.0 mg·L-1的7種木脂素混合對照品溶液連續(xù)測定6次,對4批樣品進行測定,五味子醇甲、五味子酚和五味子甲素的含量均較高,不同產(chǎn)地的醋五味子中7種木脂素的含量也不同。

2.4 膠束電動毛細管色譜（MECC）法

TIAN K 等[29]建立了以離子液體為修飾劑的MECC 法測定五味子屬藥用植物中木脂素類成分。初步研究顯示,以十二烷基硫酸鈉（SDS）作為表面活性劑不能使待測化合物得到完全分離,在SDS膠束體系中加入離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（BMIM-BF4）可使待測成分完全分離?？疾炝薆MIM-BF4和SDS濃度、外加電壓、背景緩沖液pH 值和濃度等參數(shù)對分離的影響,結(jié)果顯示,最佳測定條件為:背景緩沖液是5 mmol·L-1硼酸鹽-5mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（含20 mmol·L-1SDS和10 mmol·L-1BMIM-BF4）,pH 值為9.2,外加電壓為25 kV,檢測波長為254 nm,該方法能在＜13 min的時間內(nèi)成功分離五味子提取物中的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素4種木脂素類成分。

2.5 高效薄層色譜（HPTLC）法

MIKROPOULOU E V 等[30]同時測定芝麻中芝麻脂素和芝麻林素2種木脂素類成分的含量。將樣品點樣于硅膠60 F254高效薄層色譜板,使用自動薄層色譜采樣器,點樣采用25μL注射器和氮氣吸引器,用自動顯影室進行顯影,標準設(shè)置為:濾紙飽和20 min,在相對濕度為33%下進行10 min的顯影,用氯化鎂作為干燥劑,薄層板干燥5 min。以正戊烷-二乙醚（60∶40）為流動相,在可視化文檔系統(tǒng)上記錄254、366 nm處的薄層圖像。芝麻甲醇提取物點樣量為20μL,質(zhì)控溶液（芝麻脂素和芝麻林素混合物）點樣量為5μL,在薄層板上噴灑硫酸香蘭素衍生試劑作為顯色劑。結(jié)果顯示,芝麻脂素和芝麻林素的線性良好,檢測限和定量限分別低于2、5μg·mL-1,測定18份樣品中芝麻脂素和芝麻林素的含量分別為1.13～2.83、0.59～1.48 mg·g-1。

3 結(jié)語

中藥中總木脂素的含量測定方法主要為紫外-可見分光光度法,木脂素單體成分的含量測定方法包括HPLC 法、UPLC法、LC-MS法、MECC法和HPTLC法,其中HPLC 法以其分離性能高、定量準確、分析速度快及易于推廣等優(yōu)勢,在單體成分定量分析中應(yīng)用較多[31]。對于中藥中總木脂素的含量測定也有較多報道,均為采用紫外-可見分光光度法進行定量。木脂素的含量測定研究取得了一定進展,但也存在一些不足之處需要進一步深入探索。在木脂素單體成分測定中,目前報道較多的是以HPLC 法測定藥材中的幾種含量相對較高的特征性木脂素類成分,缺乏對于其中微量成分的測定。因中藥中微量成分也具有藥理活性,對其進行定量分析也十分重要,建議可以加強這方面的研究。先通過LC-MS技術(shù)對藥材中的微量木脂素類成分進行定性分析,之后收集或分離純化對照品,再對這些成分進行定量,以更好地為中藥質(zhì)量評價提供參考。MECC 法結(jié)合了HPLC 法和毛細管電泳的優(yōu)點,具有高效、高選擇性、分析速度快、樣品用量少、經(jīng)濟環(huán)保等特點,適合于分析復(fù)雜組分的樣品[32-33]。但該技術(shù)用于測定木脂素類成分的報道還較少,可以根據(jù)樣品情況嘗試將MECC法等新技術(shù)應(yīng)用于中藥中木脂素類成分的定量分析,將有利于拓寬分析思路和方法。