吳思瀅，黃炳耀，潘東進(jìn)，岑 英，余林嬋，姚紹嫦**

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530200；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，廣西南寧 530200)

三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)屬于硅藻門(Bacillariophyta)羽紋綱(Pennatae)，其體內(nèi)富含活性物質(zhì)，如二十碳五烯酸(EPA)、巖藻黃素和甘油脂等，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白餌料、藥物與潛在的生物柴油原材料[1]。巖藻黃素是一類珍稀的含氧類胡蘿卜素，不僅能與葉綠素a(chla)/葉綠素c(chlc)形成蛋白復(fù)合物，在光合系統(tǒng)的光捕獲與光傳遞方面發(fā)揮重要作用，而且可作為藥品或保健品，具有抗氧化、減肥、抗腫瘤、抗糖尿病、抗炎、保護(hù)視網(wǎng)膜光損傷、保肝等功效，還可以預(yù)防前列腺癌、結(jié)腸癌、腦膠質(zhì)瘤等疾病[2,3]。

氮元素是植物生長發(fā)育必需的元素之一，其參與了蛋白質(zhì)、核酸等許多生物大分子的合成。硝酸鹽作為一種常見的氮源，被藻細(xì)胞吸收后迅速還原成亞硝酸鹽，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體，同化為氨基酸與其他含氮化合物[4]。隨著人們對(duì)硅藻氮代謝途徑的深入研究，越來越多的研究人員開始關(guān)注三角褐指藻在氮脅迫條件下的生長狀態(tài)，及其對(duì)海洋變暖導(dǎo)致的營養(yǎng)鹽限制等環(huán)境變化的適應(yīng)能力。大量研究表明，氮限制可抑制三角褐指藻的生長，降低其葉綠素a含量，并加劇其受光抑制程度，抑制巖藻黃素的合成，促進(jìn)油脂的合成[4-6]。

一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是防御反應(yīng)中的關(guān)鍵信號(hào)分子，在參與植物對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答過程中發(fā)揮著十分重要的作用。NO對(duì)植物抗逆性的調(diào)控作用及機(jī)制一直以來都是植物學(xué)界研究的熱點(diǎn)，但是目前研究的品種主要集中在花生、水稻、擬南芥等少數(shù)植物上，對(duì)海洋單細(xì)胞微藻的研究較少[7]。已有研究表明，一些藻類物種擁有不同于胚胎植物的保守一氧化氮合酶，可能存在不同的途徑催化NO的合成[7]。在氮脅迫和高光條件下，褪黑素刺激雨生紅球藻細(xì)胞產(chǎn)生NO與水楊酸(SA)，兩者相互作用促進(jìn)巖藻黃素與脂肪酸的積累[8]。NO供體硝普鈉(Sodium Nitroprusside,SNP)能自發(fā)釋放NO，適當(dāng)濃度(1.0 mmol/L)的SNP處理能緩解一定濃度的鋁對(duì)花生根生長的毒害作用[9]。與單獨(dú)鹽脅迫(3.0 mol/L)相比，添加低濃度的SNP (0.5-1.0 μmol/L)能促進(jìn)杜氏鹽藻的生長，顯著提高其葉綠素含量[10]。劉路平[11]發(fā)現(xiàn)SNP對(duì)小球藻生長的調(diào)節(jié)具有雙重性，存在“低促高抑”現(xiàn)象，當(dāng)SNP大于0.5 mmol/L時(shí)，小球藻的生長受到明顯的抑制。因此，NO可能脅迫響應(yīng)的內(nèi)源調(diào)節(jié)因子，提高或降低抗逆性，但其發(fā)生作用方式可能與濃度及脅迫條件有關(guān)。

本研究以硅藻三角褐指藻為研究對(duì)象，通過添加外源NO供體SNP及NO清除劑[2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-teramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide，cPTIO]，探討外源NO在調(diào)控三角褐指藻響應(yīng)氮脅迫中的作用，研究結(jié)果將為闡釋硅藻響應(yīng)氮脅迫的作用機(jī)制提供直接證據(jù)，同時(shí)還可為今后通過改進(jìn)硅藻的培養(yǎng)條件來提高生物量及目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)采用的三角褐指藻株系為GY-H9，來源于上海光語生物科技有限公司，于廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源研究團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室保存。利用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行三角褐指藻的培養(yǎng)與保存。

1.2 儀器設(shè)備

光學(xué)顯微鏡(Leica DM2000，德國徠卡儀器有限公司)，全波長多功能酶標(biāo)儀(Tecan Infinite 200 Pro，瑞士帝肯公司)，便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(PAM-2500，德國 WALZ公司)，倒置熒光顯微鏡(Leica DM2500，德國徠卡儀器有限公司)，高效液相色譜儀(LC40，日本島津公司)。

1.3 培養(yǎng)條件與處理

將三角褐指藻置于恒溫光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天手動(dòng)搖瓶 3 次。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度100 μmol photons/(m2·s)，光照周期為光照∶黑暗=12 h∶12 h，培養(yǎng)箱溫度(20±1)℃。每6 d按照藻種∶f/2培養(yǎng)液=1∶1(V∶V)的比例進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

以NaNO3為氮源，初始濃度分別為0 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L，其中以0.8 mmol/L為適宜濃度(CK)，初始接種藻細(xì)胞密度為1.00×106cell/mL，連續(xù)培養(yǎng)6 d，每24 h利用光學(xué)顯微鏡與血球計(jì)數(shù)法[10]統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量，每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)。

選取在0.8 mmol/L NaNO3濃度下生長6 d的三角褐指藻細(xì)胞進(jìn)行以下處理：①缺氮(N-)；②缺氮+NO供體SNP，即N-+200 μmol/L SNP(N-+SNP)；③ 缺氮+NO清除劑cPTIO，即N-+50 μmol/L cPTIO (N-+cPTIO)；④氮正常(N，0.8 mmol/L)；⑤ 氮正常+NO供體SNP，即N+200 μmol/L SNP (N+SNP)；⑥氮正常+NO清除劑cPTIO，即N+50 μmol/L cPTIO (N+cPTIO)。初始接種藻細(xì)胞密度為1.00×106cell/mL，黑暗處理12 h后，分別對(duì)細(xì)胞密度、葉綠素a(chla)與葉綠素c(chlc)含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、巖藻黃素含量、油脂相對(duì)含量等指標(biāo)進(jìn)行測定與統(tǒng)計(jì)。每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 葉綠素含量測定

采用全波長多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行葉綠素含量的測定[12]。利用以下公式計(jì)算色素含量(mg/L)：

chla=(11.47×OD664-0.40×OD630) ×

V1/V2，

chlc=(24.36×OD630-3.73×OD664) ×

V1/V2，

其中，V1為丙酮用量(mL)，V2為離心的藻樣體積(mL)。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測量

采用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xPAM-2500測定三角褐指藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)。測量前，先測定光適應(yīng)下的最大熒光(Fm′)、初始熒光(F0′)與穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)；再將樣品放置于暗處適應(yīng)10 min,然后利用飽和脈沖法測量熒光誘導(dǎo)曲線，初始熒光F0用弱測量光 [0.01 μmol/(m2·s)]測量，最大熒光Fm用飽和脈沖[4 000 μmol/(m2·s)，持續(xù)時(shí)間為0.8 s] 激發(fā)，當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定熒光時(shí)打開飽和脈沖，熒光又上升至光適應(yīng)狀態(tài)下的最大熒光Fm′。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)定 3個(gè)平行樣，每個(gè)處理重復(fù)3次。獲得以下葉綠素?zé)晒鈪?shù)：初始熒光F0、最大熒光Fm、光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量Yield、光化學(xué)猝滅系數(shù)qP和非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ。利用不含藻的培養(yǎng)液進(jìn)行調(diào)零，以消除溶液本身的本底熒光。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的計(jì)算公式[13,14]如下：

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm,

Yield=ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′,

qP=(Fm′-Fs)/(Fm′-F0′),

NPQ=(Fm-Fm′)/Fm′。

1.6 巖藻黃素提取及含量測定

利用裝配有C18反相柱(4.6 mm×250 mm)的高壓液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行巖藻黃素含量測定。檢測條件參考花汝鳳等[15]的方法，并稍做修改。流動(dòng)相包括甲醇(B)和水(D)，程序：流動(dòng)相(90%B，10%D)，等度洗脫，流速1.2 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL，檢測波長450 nm，柱溫35℃，檢測時(shí)間30 min。

精密量取各處理的藻液30 mL，4 500 g低溫離心8 min，去上清，精密稱量藻細(xì)胞鮮質(zhì)量，加入甲醇(5% BHT) 1 mL，渦旋2 min，避光超聲5 min，4 500 g低溫離心8 min，收集上清液；重復(fù)加入甲醇(5% BHT) 1 mL提取沉淀。合并兩次上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析。巖藻黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=28525.4X(R2=0.999 6)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出巖藻黃素的含量。每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 油脂相對(duì)含量測定

采用尼羅紅[9-(diethyl amino) benzo[a]phenoxazin-5(5H)-one,Nile red]染色法測定三角褐指藻的油脂相對(duì)含量，具體操作參考陳若瑩等[5]的方法。另取1 mL藻液，加入尼羅紅染料20 μL進(jìn)行染色，于倒置熒光顯微鏡下觀察胞內(nèi)油滴的大小。每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel與SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVE)，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。分析結(jié)果用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖中的小寫字母表示在0.05水平上存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮脅迫對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長的影響

由圖1可知，在不同NaNO3濃度處理下，三角褐指藻的細(xì)胞密度存在差異。當(dāng)NaNO3濃度為0 mmol/L時(shí)，三角褐指藻的生長受到嚴(yán)重抑制，至培養(yǎng)第6天時(shí)，細(xì)胞密度與對(duì)照(0.8 mmol/L NaNO3)相比減少了11.99×106cells/mL，表明氮元素對(duì)三角褐指藻的生長是必需的，缺乏氮元素會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞逐漸死亡。當(dāng)三角褐指藻在NaNO3濃度為0.2 mmol/L中培養(yǎng)至第6天時(shí)，細(xì)胞密度僅為2.47×106cells/mL，與對(duì)照相比藻細(xì)胞密度明顯下降。當(dāng)NaNO3濃度為0.3-0.6 mmol/L時(shí)，三角褐指藻的細(xì)胞密度仍明顯低于對(duì)照；當(dāng)NaNO3濃度為0.7 mmol/L時(shí)，細(xì)胞密度與對(duì)照相比差異不大。

圖1 氮脅迫對(duì)三角褐指藻細(xì)胞密度的影響Fig.1 Effect of nitrogen stress on the cell density in P.tricornutum

2.2 外源NO調(diào)控氮脅迫下三角褐指藻的細(xì)胞密度

在氮正常的情況下，添加NO供體SNP (200 μmol/L)與NO清除劑cPTIO (50 μmol/L)對(duì)三角褐指藻細(xì)胞密度影響不大；在缺氮條件下，三角褐指藻的生長受到嚴(yán)重抑制，與缺氮(N-)處理相比，N-+cPTIO處理的細(xì)胞密度無顯著差異，但N-+SNP處理能顯著增加缺氮條件下三角褐指藻的細(xì)胞密度(圖2)，說明外源NO可有效緩解缺氮對(duì)三角褐指藻生長的抑制作用。

Different lowercase letters represent significant differences圖2 外源一氧化氮對(duì)三角褐指藻細(xì)胞密度的影響Fig.2 Effect of exogenous NO on the cell density in P.tricornutum

2.3 外源NO調(diào)控氮脅迫下三角褐指藻的葉綠素含量

由圖3可知，在氮正常的情況下，添加200 μmol/L SNP與50 μmol/L cPTIO對(duì)chla含量無顯著影響。缺氮會(huì)顯著降低chla含量，與氮正常(chla含量為0.83 μg/mL)相比，chla含量為0.49 μg/mL，減少了40.96%。在缺氮條件下，chla與chlc含量均出現(xiàn)顯著下降，但添加200 μmol/L SNP能顯著提高chla含量(0.66 μg/mL)，與缺氮(chla含量為0.49 μg/mL)相比提高了34.69%。類似于chla含量的變化趨勢，N-+SNP處理的chlc含量與缺氮處理相比顯著提高，chlc含量達(dá)到0.082 μg/mL。與缺氮處理(N-)相比，N-+cPTIO處理對(duì)三角褐指藻chla與chlc含量均無顯著差異。表明缺氮對(duì)三角褐指藻葉綠素合成具有抑制作用，但外源NO可有效緩解氮脅迫對(duì)三角褐指藻合成葉綠素的抑制。

Different lowercase letters represent significant differences圖3 外源NO對(duì)氮脅迫下三角褐指藻葉綠素含量的調(diào)控作用Fig.3 Regulatory effect of exogenous NO on chlorophyll content in P.tricornutum under nitrogen stress

2.4 外源NO調(diào)控氮脅迫下三角褐指藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

在氮正常條件下，添加SNP (200 μmol/L)處理12 h能顯著提高三角褐指藻PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)，與氮正常處理(N)相比，F(xiàn)v/Fm提高了10.05%。三角褐指藻在缺氮條件下培養(yǎng)12 h，F(xiàn)v/Fm最低，而N+SNP處理的Fv/Fm與缺氮處理相比顯著提高了68.14%，差異達(dá)到顯著水平[圖4(a)]。在缺氮情況下，三角褐指藻PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量Yield值也受到抑制，加入200 μmol/L SNP后，Yield值顯著提高，而添加50 μmol/L cPTIO處理對(duì)Yield值的影響不大[圖4(b)]。光化學(xué)淬滅系數(shù)qP是由光合作用引起的熒光淬滅，反映了PSⅡ反應(yīng)中心的光合活性高低。不同組合處理的qP變化幅度不大[圖4(c)]。非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ是耗散過剩光能為熱量的能力，反映了光保護(hù)能力。在氮正常條件下，3個(gè)處理的NPQ比值差異不大，但在缺氮條件下添加SNP (200 μmol/L)能顯著降低三角褐指藻的NPQ比值[圖4(d)]。綜上所述，可以認(rèn)為外源NO在一定程度上緩解缺氮脅迫對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)的抑制作用。

2.5 外源NO調(diào)控氮脅迫下三角褐指藻的巖藻黃素含量

由圖5可知，在氮正常情況下，N與N+SNP兩種處理之間巖藻黃素含量無顯著差異；而在缺氮條件下，N-與N-+SNP兩者之間巖藻黃素含量存在顯著差異，說明SNP (200 μmol/L)可在一定程度上緩解氮脅迫對(duì)三角褐指藻巖藻黃素積累的抑制作用。加入cPTIO (50 μmol/L)，巖藻黃素含量無顯著差異，從而進(jìn)一步證實(shí)了SNP的調(diào)控作用。

Different lowercase letters represent significant differences圖4 外源NO對(duì)氮脅迫下三角褐指藻PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量、實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量、光化學(xué)淬滅系數(shù)與非光化學(xué)淬滅系數(shù)的調(diào)控作用Fig.4 Regulatory effect of exogenous NO on Fv/Fm,Yield,qP,and NPQ in P.tricornutum under nitrogen stress

Different lowercase letters represent significant differences圖5 外源NO對(duì)氮脅迫下三角褐指藻巖藻黃素含量的調(diào)控作用Fig.5 Regulatory effect of exogenous NO on fucoxanthin content in P.tricornutum under nitrogen stress

2.6 外源NO調(diào)控氮脅迫下三角褐指藻的油脂相對(duì)含量

在氮正常情況下，添加200 μmol/L SNP與50 μmol/L cPTIO對(duì)油脂相對(duì)含量無顯著影響。在缺氮條件下，油脂相對(duì)含量顯著增加；與N正常處理相比，N-、N-+SNP與N-+cPTIO分別提高18.18%、41.99%與15.06%，說明缺氮有利于油脂相對(duì)含量的升高。在缺氮條件下，N-+SNP處理的油脂相對(duì)含量顯著高于N-處理，相對(duì)熒光密度達(dá)638 a.u.，而N-處理與N-+cPTIO處理之間無顯著差異(圖6)，因此，可認(rèn)為SNP (200 μmol/L)具有促進(jìn)缺氮條件下三角褐指藻油脂積累的作用。尼羅紅染色的油脂滴在藍(lán)光激發(fā)下能發(fā)出特征性的黃色熒光，N-+SNP處理的三角褐指藻的油脂滴明顯大于其他處理(圖7)，這與油脂相對(duì)熒光密度值是一致的。

Different lowercase letters represent significant differences圖6 外源NO對(duì)氮脅迫下三角褐指藻油脂相對(duì)含量的調(diào)控作用Fig.6 Regulatory effect of exogenous NO on relative oil content in P.tricornutum under nitrogen stress

圖7 尼羅紅染色的三角褐指藻細(xì)胞Fig.7 P.tricornutum cells stained with Nile red

3 討論

3.1 外源NO可有效緩解缺氮對(duì)三角褐指藻生長的抑制作用

氮是三角褐指藻生長必需的基本元素之一，是構(gòu)成藻體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸及色素的重要元素,對(duì)藻類的生長發(fā)育有著重要的作用[16]。大量研究表明，氮限制會(huì)抑制三角褐指藻細(xì)胞的生長，且抑制程度會(huì)隨著氮限制的增強(qiáng)而加劇[4-6]。陳若瑩等[5]發(fā)現(xiàn)完全缺氮條件下的藻細(xì)胞密度比正常條件(氮濃度為 896 μmol/L) 降低了49.7%。本研究也發(fā)現(xiàn)，在氮限制條件下，三角褐指藻細(xì)胞的生長密度會(huì)下降；當(dāng)藻細(xì)胞在NaNO3為0 mmol/L中培養(yǎng)6 d時(shí)，與對(duì)照(0.8 mmol/L NaNO3)相比，細(xì)胞密度減少了11.99×106cells/mL，這可能是由于細(xì)胞缺少主要的氮素來源，從而導(dǎo)致細(xì)胞正常的生長與代謝活動(dòng)受阻，主要表現(xiàn)為細(xì)胞生長緩慢、衰老死亡嚴(yán)重。迄今尚未發(fā)現(xiàn)NO對(duì)缺氮條件下三角褐指藻調(diào)控作用的研究報(bào)道。已有研究顯示1 mmol/L SNP能夠產(chǎn)生2 μmol/L的NO[17]，因此，研究人員利用SNP會(huì)主動(dòng)釋放NO這一特性來研究NO對(duì)三角褐指藻生長及成分積累的促進(jìn)或抑制作用。對(duì)缺氧條件下生長6 d的三角褐指藻細(xì)胞進(jìn)行外源NO處理12 h，其細(xì)胞密度與缺氮相比得到顯著增加，說明外源NO可有效緩解缺氮對(duì)三角褐指藻生長的抑制作用，這與SNP能有效減輕鋁對(duì)花生根生長的毒害作用[9]，緩解鹽脅迫引起的杜氏鹽藻的生長抑制[10]等結(jié)果是一致的。類似于高等植物，外源NO的調(diào)控作用具有“雙重效應(yīng)”，在低濃度下對(duì)微藻起促進(jìn)作用，高濃度下則起抑制作用[11]。然而，對(duì)于不同種類的微藻，NO的低濃度范圍存在差別。本研究使用200 μmol/L SNP處理缺氮條件下的藻細(xì)胞，能在一定程度上緩解缺氮對(duì)藻細(xì)胞生長與巖藻黃素積累的抑制作用，說明200 μmol/L可能發(fā)揮著正調(diào)控的效應(yīng)。

3.2 外源NO可有效緩解缺氮對(duì)三角褐指藻葉綠素積累及光合效率的抑制作用

三角褐指藻的光合效率主要依賴于天線系統(tǒng)復(fù)合物巖藻黃素-葉綠素蛋白(Fucoxanthin Chlorophyll Proteins，F(xiàn)CP)復(fù)合體，F(xiàn)CP復(fù)合體結(jié)合的色素主要有巖藻黃素、chla、chlc1和chlc2[18]。大量研究表明，氮限制能顯著降低三角褐指藻葉綠素a的含量[4-6]，本研究也得到類似的結(jié)論。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在氮正常的情況下，添加200 μmol/L SNP對(duì)chla含量無顯著影響，但能有效緩解缺氮條件對(duì)chla和chlc含量的影響，提示在氮缺乏的環(huán)境中，SNP的調(diào)控作用可能與提高光合效率和光能的轉(zhuǎn)換效率有關(guān)，這與姜倩倩等[19]和朱營營等[20]的研究結(jié)果基本類似。

Fv/Fm反映了植物潛在的最大光合能力，Yield反映的是實(shí)際原始光能捕獲效率。由于Fv/Fm在正常條件下變化較小，但在脅迫條件下變化較大，可作為反映微藻生長環(huán)境是否適宜的一個(gè)重要指標(biāo)[21]。類似于姜倩倩等[19]和吳曉蕾等[22]分別在平邑甜茶和黃瓜上的研究結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)在缺氮條件下添加SNP (200 μmol/L)處理12 h能顯著提高Fv/Fm與Yield值，說明SNP (200 μmol/L)能有效緩解缺氮脅迫對(duì)三角褐指藻光合效率的抑制作用。然而，對(duì)于SNP如何發(fā)揮調(diào)控作用并影響三角褐指藻的光合效率，仍有待進(jìn)一步研究。

3.3 外源NO可有效緩解缺氮對(duì)巖藻黃素積累的抑制并顯著促進(jìn)油脂的積累

巖藻黃素屬于硅藻次生代謝產(chǎn)物中的萜類物質(zhì)，是一種參與光合作用、輔助采光色素的類胡蘿卜素。已有研究顯示，巖藻黃素的含量會(huì)隨著三角褐指藻的生長而逐漸降低[23]，且在氮限制時(shí)三角褐指藻的巖藻黃素積累會(huì)被抑制[4]。本研究也發(fā)現(xiàn)缺氮時(shí)三角褐指藻巖藻黃素含量較氮正常時(shí)顯著減少，然而，關(guān)于外源NO對(duì)巖藻黃素合成的影響至今鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在氮正常的條件下加入200 μmol/L SNP，三角褐指藻的巖藻黃素含量沒有明顯變化；在缺氮條件下，添加SNP (200 μmol/L)可有效緩解缺氮對(duì)三角褐指藻巖藻黃素積累的抑制作用。這可能是由于在氮限制的情況下，細(xì)胞為保護(hù)其結(jié)構(gòu)和功能，迫使chla等合成下降，從而降低光捕獲，進(jìn)而可能直接影響關(guān)鍵蛋白FCP復(fù)合體的合成，導(dǎo)致其合成下降[5]；而在缺氮條件下添加200 μmol/L SNP，可有效緩解缺氮對(duì)三角褐指藻巖藻黃素積累的抑制作用，究其原因可能是由于SNP能提供NO，而NO可促進(jìn)藻細(xì)胞中天線系統(tǒng)復(fù)合物FCP復(fù)合體的合成，同時(shí)可有效減輕缺氮導(dǎo)致的光合系統(tǒng)損傷。對(duì)于SNP可有效調(diào)節(jié)三角褐指藻細(xì)胞中哪些抗氧化酶，以及哪些基因參與其中發(fā)揮作用，還有待進(jìn)一步研究。

趙佩佩等[4]研究發(fā)現(xiàn)缺氮條件下三角褐指藻脂質(zhì)合成增加，參與脂質(zhì)合成、糖酵解和三羧酸(TCA)循環(huán)的關(guān)鍵蛋白在缺氮時(shí)上調(diào)，提示缺氮條件下糖酵解和TCA循環(huán)活性升高，為脂肪酸生物合成提供了大量的中間產(chǎn)物，如乙酰輔酶A和ATP等。在本研究中，油脂相對(duì)含量測定和尼羅紅染色觀察結(jié)果也表明了SNP (200 μmol/L)能促進(jìn)缺氮條件下三角褐指藻的油脂積累。因此，在生產(chǎn)過程中，環(huán)境條件和培養(yǎng)水平等因素存在的多變性，可能會(huì)導(dǎo)致三角褐指藻的培養(yǎng)處于逆境條件，可以嘗試添加適當(dāng)濃度的SNP來緩解逆境條件對(duì)三角褐指藻生長的抑制作用或促進(jìn)油脂的積累。

4 結(jié)論

本研究通過添加外源NO供體SNP及NO清除劑cPTIO，探究外源NO對(duì)三角褐指藻響應(yīng)氮脅迫的作用。結(jié)果表明，缺氮會(huì)抑制三角褐指藻細(xì)胞的生長，顯著降低chla含量與光合效率，降低巖藻黃素含量，增加脂質(zhì)合成。與氮正常情況下相比，在缺氮條件下添加200 μmol/L SNP，可在一定程度上緩解缺氮對(duì)三角褐指藻的生長、葉綠素含量、光合效率與巖藻黃素積累的抑制，并能顯著促進(jìn)油脂的積累。在缺氮條件下添加50 μmol/L cPTIO對(duì)三角褐指藻的生長、葉綠素含量、光合效率及物質(zhì)積累影響不大。本研究可為探明外源NO調(diào)控三角褐指藻響應(yīng)氮脅迫的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為進(jìn)一步提高三角褐指藻的生物量，促進(jìn)成分積累量提供參考依據(jù)。