郭 鈴，劉 靜，郭渠蓮，靳艷玲，劉文君

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，兒童血液腫瘤與出生缺陷實驗室，四川省出生缺陷臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川瀘州 646000；2.中國科學(xué)院成都生物研究所，中國科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點實驗室，四川省環(huán)境微生物重點實驗室，四川成都 610041)

急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)是未成熟的B或T淋巴祖細(xì)胞在骨髓、外周血或中樞神經(jīng)系統(tǒng)中異常聚集導(dǎo)致的惡性血液腫瘤，高發(fā)于兒童和青少年[1,2]。近幾十年來，新靶向藥物和多藥物化療方案的聯(lián)合使用極大地改善了ALL的臨床治療效果，5年無事件生存率(the five-year Event-Free Survival rate，5y-EFS)在85%以上[3]。然而，化療藥物嚴(yán)重的副作用及耐藥復(fù)發(fā)嚴(yán)重制約了ALL的臨床治療效果，影響了ALL患兒預(yù)后。因此，急需開發(fā)和探索更多副作用小的抗白血病藥物及新的治療靶點[4]。

天然植物提取物，尤其以花青素為首的植物次生代謝產(chǎn)物，是世界上含量最豐富的水溶性黃酮類化合物，廣泛存在于被子植物中[5]。迄今為止，花青素由于具有極強的抗氧化活性，引起全球范圍內(nèi)的高度關(guān)注。近期研究表明，花青素在結(jié)腸癌、乳腺癌、皮膚癌、肝癌、肺癌、食管癌及惡性血液腫瘤中具有潛在的抗腫瘤活性[6-9]。紫薯種植面廣，產(chǎn)量高，花青素含量高，價格較藍(lán)莓等高花青素作物更加低廉，是優(yōu)質(zhì)的花青素來源。因此，紫薯被認(rèn)定為具有高營養(yǎng)價值和保健作用的功能性食品[10,11]，名列抗癌蔬菜榜首[12]。Guo等[13]報道紫薯花青素(Purple Sweet Potato Anthocyanin,PSPA)具有抗白血病活性，但紫薯花青素抗白血病的治療靶點尚不清楚，仍需要進一步研究。

本研究采用分子對接技術(shù)，運用計算機預(yù)測紫薯花青素的潛在靶點，主要針對程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，包括凋亡、焦亡、壞死性凋亡、鐵死亡和銅死亡等相關(guān)細(xì)胞死亡過程的關(guān)鍵基因，以期預(yù)測出紫薯花青素最可能的分子靶點，并采用轉(zhuǎn)錄組測序和Western blot驗證紫薯花青素對潛在靶點表達的影響，為花青素臨床輔助治療白血病提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川紫4號紫薯及其相關(guān)信息由中國科學(xué)院成都生物研究所靳艷玲研究員提供。無水乙醇(分析純)購自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫薯花青素的提取、純化及鑒定

紫薯塊莖清水洗凈，切薄片(2-5 mm)，真空冷凍干燥后液氮研磨成粉末，100目過篩于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

花青素的提取、純化及鑒定參考Hu等[14]的方法。首先，稱取50.0 g紫薯粉末，用1.0 L含有0.5%鹽酸的50%乙醇溶液充分混勻，靜置24 h。然后，懸濁液4℃，4 000 r/min離心15 min；取上清液，40℃真空旋蒸儀(IKA RV10 Digital，Germany)濃縮；濃縮液上大孔樹脂AB-8柱純化并用乙酸乙酯分餾。最后，將水相部分冷凍干燥成干粉。以上實驗在黑暗中操作?；ㄇ嗨靥崛∥镉靡合噘|(zhì)譜(AB SCIEX TRIPLE QUAD 4500,USA)分析鑒定。

1.2.2 分子對接

分子對接參照Ibrahim等[15]的方法。受體蛋白3D結(jié)構(gòu)下載自PubChem (https://www1.rcsb.org/)，蛋白PDB ID(Bcl-2：1YSW；FDX1：3P1M；Parkin：4I1H；SLC7A11：7P9U)?；ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)由ChemDraw 19.0及Chem3D軟件繪制。分子對接結(jié)果圖片由PyMOL軟件(https://pymol.org/2/)生成。結(jié)合能<-5.0 kcal/mol表示結(jié)合活性良好。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)條件

NALM6人源B系急性淋巴白血病細(xì)胞購自上海生化與細(xì)胞生物研究所。NALM6細(xì)胞用含10%胎牛血清[Biological Industries(BI)，以色列]、100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素(Gibco，美國)的1640培養(yǎng)液(Gibco，中國)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2，90%濕度。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序

急性淋巴白血病細(xì)胞NALM6 用紫薯花青素處理24 h后，收集細(xì)胞，以未處理的NALM6細(xì)胞作為對照，每個處理2個生物學(xué)重復(fù)。RNA提取、建庫、轉(zhuǎn)錄組測序及分析由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.5 Western blot

1) 根據(jù)下級指標(biāo)Ai，將上級指標(biāo)A的決策數(shù)據(jù)集成為(a1,a2,…,ai,…,an)，將數(shù)據(jù)按由大到小重新排列，得到新數(shù)列B=(b1,b2,…,bj,…,bn).

用不同濃度(0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL)紫薯花青素處理NALM6細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液(0.01 mol/L)清洗細(xì)胞2次，RIPA裂解液裂解細(xì)胞后超聲破胞15 s，12 000 r/min離心10 min，收集上清液。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，Bradford 染料結(jié)合測定法測定蛋白質(zhì)濃度。30 μg蛋白上SDS-PAGE，然后將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后依次孵育一抗、二抗，以GAPDH為對照，化學(xué)成像儀[e-BLOT Touch Imager，易孛特生命科學(xué)(上海)有限公司]檢測蛋白條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯花青素的成分

從川紫4號紫薯中鑒定出25種花青素成分，主要包含矢車菊素及其衍生物、芍藥色素及其衍生物、天竺葵色素及其衍生物(表1)，其結(jié)構(gòu)見圖1。其中矢車菊素及其衍生物有10種，含量最高，占總花青素的53.80%；其次是芍藥色素及其衍生物，有13種，含量占總花青素的45.92%；含量和種類最低的是天竺葵色素及其衍生物，僅有2種，其含量僅占總花青素的0.28%。

表1 紫薯花青素成分Table 1 Composition of purple sweet potato anthocyanins

2:Peonidin 3-sophoroside-5-glucoside,15:Cyanidin 3-caffeoyl-p-hydroxybenzoyl sophoroside-5-glucoside,16:Peonidin 3-caffeoyl-p-hydroxybenzoyl sophoroside-5-glucoside,24:Cyanidin 3-feruloyl-p-hydroxybenzoyl sophoroside-5-glucoside圖1 紫薯花青素主要成分結(jié)構(gòu)Fig.1 Main component structure of purple sweet potato anthocyanins

2.2 紫薯花青素與Bcl-2蛋白分子對接

Bcl-2 家族蛋白是細(xì)胞凋亡的中心調(diào)控因子，是典型的抗凋亡蛋白，在多種腫瘤中過度表達，從而促進腫瘤的發(fā)生、進展和耐藥。因此，抑制Bcl-2的表達能誘導(dǎo)凋亡。紫薯花青素與Bcl-2蛋白的相互作用見圖2。從圖2(a)可以看出，紫薯花青素可以結(jié)合到Bcl-2蛋白上，與受體上5個氨基酸殘基發(fā)生氫鍵作用，最低結(jié)合能為-6.7 kcal/mol，說明紫薯花青素結(jié)合活性良好。

(a) The binding sites between PSPA and Bcl-2;(b) The binding sites between Bcl-2 and both PSPA and ABT-737,Bcl-2 protein is white,PSPA molecule is shown in blue,active site interacting residues are shown in green,hydrogen bonds are indicated with magenta dashed lines,ABT-737 is shown in yellow圖2 紫薯花青素與Bcl-2蛋白相互作用Fig.2 Interaction between Bcl-2 protein and PSPA

2.3 紫薯花青素與Parkin蛋白分子對接

如圖3所示，紫薯花青素與Parkin蛋白有良好的結(jié)合活性，可與8個氨基酸殘基發(fā)生相互作用，分別是LYS-412、THR-410、TRP-447、ARG-234、LYS-427、GLY-429、VAL-465以及ARG-256，其結(jié)合能最低達到-8.4 kcal/mol。

2.4 紫薯花青素與SLC7A11蛋白分子對接

如圖4所示，紫薯花青素可以與5個氨基酸殘基發(fā)生相互作用，其結(jié)合能最低達到-10.4 kcal/mol，絕大多數(shù)結(jié)合能都低于-9.0 kcal/mol。由此可見，紫薯花青素與SLC7A11的結(jié)合活性要優(yōu)于Bcl-2和Parkin蛋白。

Parkin protein is white,PSPA molecule is shown in blue,active site interacting residues are shown in green,hydrogen bonds are indicated with magenta dashed lines,Zn ions are shown as blue balls圖3 紫薯花青素與Parkin蛋白相互作用Fig.3 Interaction between Parkin protein and PSPA

SLC7A11 protein is white,PSPA molecule is shown in blue,active site interacting residues are shown in green,hydrogen bonds are indicated with magenta dashed lines圖4 紫薯花青素與SLC7A11蛋白相互作用Fig.4 Interaction between SLC7A11 protein and PSPA

2.5 紫薯花青素與Fe-S簇蛋白和FDX1蛋白分子對接

將紫薯花青素分別與Fe-S簇蛋白和FDX1蛋白進行分子對接，結(jié)果表明紫薯花青素可以和兩種蛋白結(jié)合。如圖5所示，紫薯花青素可以和Fe-S簇蛋白12個氨基酸殘基發(fā)生相互作用，和FDX1蛋白8個氨基酸殘基結(jié)合，其結(jié)合能分別為-9.6 kcal/mol和-7.5 kcal/mol，表明紫薯花青素與兩個蛋白結(jié)合性能良好。

(a) FDX1 and Fe-S clusters are white.(b) PSPA molecule is shown in blue,active site interacting residues are shown in green,hydrogen bonds are indicated with magenta dashed lines,K ions are shown as purple balls,Fe2-S2 cluster is shown as orange/yellow balls圖5 紫薯花青素與FDX1和Fe-S簇蛋白相互作用Fig.5 Interaction between of FDX1,Fe-S clusters protein and PSPA

2.6 紫薯花青素與c-Myc蛋白分子對接

2.7 紫薯花青素對Bcl-2、Parkin、SLC7A11、FDX1及c-Myc蛋白表達的影響

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，經(jīng)紫薯花青素處理24 h后，處理組中Bcl-2、Parkin、SLC7A11、FDX1及c-Myc的表達均顯著低于對照組[圖7(a)]。Western blot檢測c-Myc蛋白表達水平變化顯示,紫薯花青素能顯著降低c-Myc蛋白表達水平[圖7(b)]，進一步驗證了分子對接結(jié)果。

C-Myc is white,PSPA molecule is shown in blue,active site interacting residues are shown in green,hydrogen bonds are indicated with magenta dashed lines圖6 紫薯花青素與c-Myc蛋白相互作用Fig.6 Interaction between c-Myc protein and PSPA

(a) NALM6 cells are treated with 20 μg/mL,40 μg/mL or 60 μg/mL PSPAs for 24 h;(b) The levels of c-Myc are determined by Western blot analysis,GAPDH is used as the loading control圖7 紫薯花青素處理后蛋白表達變化Fig.7 Changes of protein expression after PS PA treatment

3 討論

從表1可以看出，紫薯花青素主要是?；ㄇ嗨?，占總花青素的90%左右，與Lee等[16]的報道一致。含量最高的是24號花青素矢車菊素3-阿魏酸-對羥基苯甲?；碧擒?5-葡萄糖苷(Cyanidin 3-feruloyl-p-hydroxybenzoyl sophoroside-5-glucoside)，達到22.63%。花青素主要是葡萄糖苷類化合物，在光照、熱及pH改變條件下不穩(wěn)定，易被氧化成對應(yīng)的葡萄糖苷酸，而?；磻?yīng)可以顯著增強花青素的穩(wěn)定性[17]。另外，在矢車菊素、芍藥色素及天竺葵色素3種花青素成分中，矢車菊素的抗氧化活性最強，已被報道在多種腫瘤中具有抗癌活性[18]。24號花青素是矢車菊素雙乙?；苌铮浞€(wěn)定性和抗氧化活性具備一定的優(yōu)勢，同時其含量最高，因此該成分被選擇作為配體進行分子對接研究分析。

眾所周知，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡是治療惡性腫瘤的有效機制。因此，為研究紫薯花青素抗白血病的活性，對多種程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵蛋白進行了分子對接分析。圖2結(jié)果已經(jīng)表明紫薯花青素可以結(jié)合到抗凋亡蛋白Bcl-2上，進一步對比Bcl-2抑制劑ABT-737的結(jié)合位點顯示[圖2(b)]，紫薯花青素與Bcl-2結(jié)合位點和ABT-737結(jié)合位點有明顯的重疊[19]，說明紫薯花青素也能較好地抑制Bcl-2蛋白的表達，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。前期研究也顯示，紫薯花青素處理ALL細(xì)胞NALM6后，細(xì)胞凋亡率較未處理細(xì)胞提高了10%[13]，在細(xì)胞生理水平上驗證了分子對接的結(jié)果。

在壞死性凋亡和焦亡方面，Parkin蛋白是一種E3泛素連接酶，在泛素化級聯(lián)反應(yīng)的最后一環(huán)起重要作用?；罨腜arkin蛋白可以泛素化RIPK3以及NLRP3，從而負(fù)調(diào)控壞死小體和炎癥小體的合成[20,21]。因此，抑制Parkin蛋白，可以促進壞死性凋亡和焦亡的發(fā)生[22]。紫薯花青素可以結(jié)合Parkin蛋白，Riley等[23]報道Parkin蛋白ARG-234、VAL-465、ARG-256殘基是該蛋白的關(guān)鍵位點，在蛋白的活性和結(jié)構(gòu)上起決定性的作用。因此紫薯花青素結(jié)合這些位點可以有效破壞Parkin蛋白的活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而抑制蛋白的表達，導(dǎo)致細(xì)胞壞死小體和炎癥小體的形成，促進壞死性凋亡和焦亡的發(fā)生。

胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A11是鐵死亡通路的關(guān)鍵蛋白，抑制其表達可以在一定程度上誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[24]。分子對接分析表明，紫薯花青素可以很好地結(jié)合到SLC7A11蛋白上。更重要的是，Parker等[25]研究表明ARG-135位點突變會直接導(dǎo)致SLC7A11蛋白失活。從圖5可以看出，紫薯花青素可以結(jié)合ARG-135位點，從而影響SLC7A11蛋白的結(jié)構(gòu)和活性。Birsen等[26]研究表明藥理化合物遺傳性失活SLC7A11可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。由此可見，紫薯花青素也可以起到異曲同工的作用。

程序性細(xì)胞死亡方式除了上述幾種，最近又有學(xué)者報道了一種不同于已知細(xì)胞死亡機制的新型細(xì)胞死亡方式——銅死亡[27]。銅死亡涉及一個關(guān)鍵蛋白——鐵氧還蛋白1(FDX1)。FDX1是小分子抗癌藥Elesclomol的靶蛋白，Elesclomol可以靶向作用于FDX1誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生銅死亡。FDX1既能作用于Fe-S簇蛋白的生物合成，又能還原Cu2+生成Cu+，是銅死亡通路最關(guān)鍵的蛋白[28]。研究結(jié)果表明，紫薯花青素可以良好地結(jié)合在Fe-S簇蛋白和FDX1蛋白上，其結(jié)合位點均位于Fe-S離子簇及K+附近，與Elesclomol結(jié)合位點非常接近[28]，據(jù)此推斷紫薯花青素也可以抑制Fe-S簇蛋白和FDX1蛋白的表達，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生銅死亡。然而，銅死亡是程序性細(xì)胞死亡領(lǐng)域最前沿的研究成果，目前尚無銅死亡與白血病相關(guān)的研究。因此，分子對接的結(jié)果也為后續(xù)提供了新的視野，為白血病的臨床治療開拓了新的研究思路，是下一步研究的重點關(guān)注方向。

為進一步驗證分子對接結(jié)果，本研究對紫薯花青素處理的ALL細(xì)胞NALM6進行了驗證。Guo等[13]報道紫薯花青素可以抑制ALL細(xì)胞的活性。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果再次驗證紫薯花青素可以抑制Bcl-2、Parkin、SLC7A11、FDX1及c-Myc的表達，再加上Western blot實驗結(jié)果進一步驗證了紫薯花青素確實可以影響c-Myc蛋白的表達水平[圖7(b)]，在轉(zhuǎn)錄組和蛋白水平驗證了分子對接結(jié)果與生理生化結(jié)果高度一致。綜上所述，分子對接結(jié)果可以初步預(yù)測紫薯花青素的潛在靶點。

本研究鑒定出25種花青素成分，為紫薯花青素應(yīng)用于白血病臨床治療提供了基礎(chǔ)信息，并基于細(xì)胞程序性死亡，分析了紫薯花青素潛在的抗白血病分子機制。從分子對接結(jié)果可以看出，紫薯花青素可能作用于凋亡、焦亡、壞死性凋亡、鐵死亡及銅死亡等不同的方式，尤其是凋亡、鐵死亡和銅死亡。首先，紫薯花青素與Bcl-2的結(jié)合位點與已知的Bcl-2抑制劑ABT-737的結(jié)合位點高度重合，表明紫薯花青素也可能是Bcl-2的抑制劑之一。其次，紫薯花青素除了能結(jié)合SLCA711外，前期研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)紫薯花青素可以誘導(dǎo)ALL細(xì)胞活性氧(Reactive Oxygen Species ,ROS)生成[13]，這些都是細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的典型特征。最后，銅死亡是最新提出的一種細(xì)胞死亡方式[27]，其分子機制有待進一步詳細(xì)研究，而分子對接的結(jié)果提示紫薯花青素具有銅死亡誘導(dǎo)劑的可能性，為紫薯花青素應(yīng)用于臨床提供新的研究思路。

4 結(jié)論

本研究分析、純化、鑒定出25種紫薯花青素，并得到了其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)式。通過分子對接分析初步揭示了紫薯花青素治療白血病的潛在靶蛋白。結(jié)果表明紫薯花青素能與凋亡、焦亡、壞死性凋亡、銅死亡以及鐵死亡的關(guān)鍵蛋白結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄組水平和蛋白水平初步驗證了分子對接的結(jié)果。本研究結(jié)果為后續(xù)分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實驗提供了理論依據(jù)，也為白血病臨床治療提供了新的思路。