孫明雪，張玉霞，叢百明，夏全超，田永雷，張慶昕，張冬梅

(1 內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)飼用作物工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028041；2 通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

紫花苜蓿(MedicagosativaL)作為世界上栽培最為廣泛的豆科牧草，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好等特點(diǎn)[1]。受溫帶大陸性季風(fēng)氣候的影響，我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)降水主要集中在夏季，冬季寒冷少雪，極易發(fā)生倒春寒[2]。內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗為我國(guó)紫花苜蓿生產(chǎn)機(jī)械化、規(guī)?；?、集約化程度最高的地區(qū)，被譽(yù)為“中國(guó)草都”[3]，但在2012-2020年，阿魯科爾沁旗優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿生產(chǎn)基地多次出現(xiàn)返青率低的問(wèn)題[4]。

水分是植物生長(zhǎng)過(guò)程中必要的環(huán)境條件和限制因子，更是植物生命過(guò)程中的基礎(chǔ)物質(zhì)，植物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)、有機(jī)物的代謝均有水分參與[5]。干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物活性氧代謝失衡，進(jìn)而導(dǎo)致膜脂氧化，此時(shí)植物體內(nèi)的一系列抗氧化系統(tǒng)會(huì)通過(guò)清除活性氧保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)[6-7]。磷作為植物生命過(guò)程中必要的三大元素之一，其在土壤中的移動(dòng)性較差，且極易被土壤固定，大量施用會(huì)導(dǎo)致土壤板結(jié)和污染[8]，無(wú)法被植物大量吸收，所以磷素目前已被視為限制植物生長(zhǎng)及牧草產(chǎn)量的重要因素[9]。水肥組合是指將施肥和灌水融為一體以達(dá)到作物高品質(zhì)高產(chǎn)的農(nóng)業(yè)技術(shù)[10]，有研究表明，磷素可顯著改善土壤干旱條件下植株的水分狀況，增強(qiáng)膜的穩(wěn)定性，維持植株正常的生命活動(dòng)，且能夠在一定程度上彌補(bǔ)因水分不足造成的影響[11]；有關(guān)水磷互作對(duì)小麥葉影響的研究表明，干旱條件下，施用磷肥可明顯增強(qiáng)葉片過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低了丙二醛(MDA)含量，從而延緩由于干旱造成的細(xì)胞衰老[12]。研究表明，高磷與輕度水分脅迫組合能有效地誘導(dǎo)冬小麥從形態(tài)與生理代謝兩方面作出響應(yīng)，通過(guò)增強(qiáng)根系生長(zhǎng)適合度及抗氧化酶活性，使水分的利用率提高，進(jìn)而增強(qiáng)抗旱能力[13]；也有研究表明，適量的灌水能提高苗期玉米對(duì)磷肥的吸收利用效率，說(shuō)明適當(dāng)?shù)乃捉M合配比可以達(dá)到水磷協(xié)同效應(yīng)[14]。目前，關(guān)于水磷組合對(duì)其他作物生長(zhǎng)及生理特性方面的研究很多，但關(guān)于其對(duì)紫花苜蓿抗寒生理特性影響的研究甚少。為此，本研究在科爾沁沙地分析了不同水磷組合處理下紫花苜蓿根頸的生理指標(biāo)(CAT、POD、SOD活性和MDA、可溶性蛋白(SP)含量)及越冬率，以期為該地區(qū)紫花苜蓿生產(chǎn)中水磷的科學(xué)管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古赤峰市阿魯科爾沁旗巖峰農(nóng)業(yè)公司(北緯43°21′，東經(jīng)119°02′)，屬于溫帶大陸性氣候，四季分明，降水集中。年平均氣溫3 ℃，10 ℃以上積溫3 000 ℃，無(wú)霜期150 d，年平均降水量400 mm，蒸發(fā)量是降水量的4～5倍，年平均風(fēng)速3.7 m/s。土壤有機(jī)質(zhì)含量63.4 mg/kg，堿解氮含量34.89 mg/kg，全氮含量36.02 mg/kg，速效磷含量3.71 mg/kg，速效鉀含量77.98 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)材料

供試紫花苜蓿品種為‘騎士T’(‘Knights T’)和‘公農(nóng)1號(hào)’(‘Gongnong No.1’)，由北京正道有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)方法

于2017年7月1日播種，播種量為22.5 kg/hm2，播種前一次性施入KCl(K2O含量為60%)150 kg/hm2作為基肥。試驗(yàn)設(shè)置土壤水分和施磷量2個(gè)試驗(yàn)因子，采用兩因素裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以水分處理為主區(qū)，設(shè)置灌水時(shí)間間隔分別為4 d(W1)、8 d(W2)和12 d(W3)，每次灌溉到水分入滲至距土壤表面30 cm處(挖開(kāi)土層目測(cè))，灌水處理時(shí)間從播種后第3天(2017年7月4日)至取樣前(2017年11月14日)，灌水方式為指針式噴灌。以磷肥施用量(以P2O5計(jì))水平為副區(qū)，設(shè)置50 kg/hm2(P1)、100 kg/hm2(P2)、150 kg/hm2(P3)3個(gè)水平，并設(shè)置不施磷肥為對(duì)照(CK)，供試肥料為過(guò)磷酸鈣(P2O5含量為44%)。2個(gè)因素共組合成12個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，共36個(gè)小區(qū)，3個(gè)主區(qū)間隔15 m；副區(qū)小區(qū)試驗(yàn)面積20 m2(4 m×5 m)，小區(qū)間隔為1 m。試驗(yàn)期間其他田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。

1.4 樣品采集

11月15日前后(封凍前期)，每個(gè)處理挖取供試材料50株，帶回室內(nèi)洗凈，切取根頸部分測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。取樣后的試驗(yàn)田參照孫洪仁等[3]的灌水方法進(jìn)行田間冬季灌水管理，翌年測(cè)定紫花苜蓿越冬率。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 根頸生理指標(biāo) MDA含量采用硫代巴比妥酸法[15]測(cè)定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[15]測(cè)定，SOD活性采用氮藍(lán)四唑法[15]測(cè)定，CAT活性采用紫外吸收法[15]測(cè)定，SP含量采用考馬斯亮藍(lán)比色法[15]測(cè)定。

1.5.2 越冬率(winter survival rate,WSR) 于播種當(dāng)年2017年10月26日，每小區(qū)隨機(jī)設(shè)1個(gè)1 m2樣方，統(tǒng)計(jì)越冬前植株數(shù)。2018年3月26日出苗至2018年4月1日返青全部出苗后(5 d內(nèi)無(wú)新增出苗)，統(tǒng)計(jì)樣方內(nèi)返青植株數(shù)，計(jì)算越冬率。越冬率=返青植株數(shù)/越冬前植株數(shù)×100%[16]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 軟件處理并制作表格，用DPS 7.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析及相關(guān)性分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水磷組合對(duì)紫花苜蓿根頸MDA含量的影響

如表1所示，不同磷肥施用量處理下，隨著灌水時(shí)間間隔的延長(zhǎng)，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’的根頸MDA含量逐漸增加，在W3處理下達(dá)到最大值。在不同的灌水時(shí)間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’根頸的MDA含量在各施磷處理下均顯著低于CK(P<0.05)，其中P2處理對(duì)‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’根頸MDA含量的降低效果最顯著，該處理‘騎士T’的根頸MDA含量在W1、W2、W3處理下較CK分別降低了54.03%，51.84%和53.62%，‘公農(nóng)1號(hào)’的根頸MDA含量較CK分別降低了51.52%，51.18%和49.72%。結(jié)果表明，施用磷肥能降低不同灌水時(shí)間間隔處理下紫花苜蓿根頸的MDA含量，且在P2O5施用量為100 kg/hm2(P2處理)時(shí)MDA含量最低。

表1 水磷組合對(duì)不同品種紫花苜蓿根頸MDA含量的影響

2.2 水磷組合對(duì)紫花苜蓿根頸CAT活性的影響

如表2所示，不同磷肥施用量處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’苜蓿根頸CAT活性均以W2處理顯著高于W1處理(P<0.05)，其中‘騎士T’ CAT活性在P1、P2和P3處理下較W1處理分別提高了25.17%，17.91%和15.38%，‘公農(nóng)1號(hào)’較W1處理分別提高了30.95%，32.86%和37.18%。在不同的灌水時(shí)間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’根頸CAT活性在不同磷肥用量處理下均高于CK，其中以P2磷肥用量處理最高，均顯著高于CK(P<0.05)，其中‘騎士T’CAT活性在W1、W2、W3處理下較CK分別提高了57.43%，45.12%和34.75%，‘公農(nóng)1號(hào)’較CK分別提高了43.97%，83.56%和83.53%。結(jié)果表明，施用磷肥能顯著增強(qiáng)不同灌水時(shí)間間隔處理下紫花苜蓿根頸的CAT活性，且在P2O5施用量為100 kg/hm2時(shí)CAT活性最強(qiáng)。

表2 水磷組合對(duì)不同品種紫花苜蓿根頸CAT活性的影響

2.3 水磷組合對(duì)紫花苜蓿根頸POD活性的影響

如表3所示，不同磷肥施用量處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’的根頸POD活性均在W2處理下最高，說(shuō)明灌水時(shí)間間隔為8 d時(shí)POD活性最強(qiáng)。在不同的灌水時(shí)間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’的根頸POD活性在不同磷肥用量處理下均顯著高于CK(P<0.05)，其中以P2磷肥用量處理最高，該處理‘騎士T’在W1、W2、W3處理下的POD活性較CK分別提高了34.59%，58.11%和38.19%，‘公農(nóng)1號(hào)’較CK分別提高了14.60%，59.65%和9.91%。以上結(jié)果說(shuō)明,施用磷肥能提高不同灌水時(shí)間間隔處理下紫花苜蓿根頸的POD活性，且在P2O5施用量為100 kg/hm2時(shí)POD活性最強(qiáng)。

表3 水磷組合對(duì)不同品種紫花苜蓿根頸POD活性的影響

2.4 水磷組合對(duì)紫花苜蓿根頸SOD活性的影響

如表4所示，不同磷肥施用量處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’根頸SOD活性均在W2處理下最高，說(shuō)明灌水時(shí)間間隔為8 d時(shí)SOD活性最強(qiáng)。在不同的灌水時(shí)間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’的根頸SOD活性在各磷肥用量處理下均顯著高于CK(P<0.05)，其中以P2處理最高，其‘騎士T’在W1、W2、W3處理下根頸SOD活性較CK分別提高了34.64%，21.98%和42.18%，‘公農(nóng)1號(hào)’較CK分別提高了52.02%，42.03%和26.71%，說(shuō)明施用磷肥能增強(qiáng)不同灌水時(shí)間間隔處理下紫花苜蓿根頸的SOD活性，且在P2O5施用量為100 kg/hm2時(shí)SOD活性最強(qiáng)。

表4 水磷組合對(duì)不同品種紫花苜蓿根頸SOD活性的影響

2.5 水磷組合對(duì)紫花苜蓿根頸SP含量的影響

如表5所示，不同磷肥施用量處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’的根頸SP含量均在W2處理下最高，說(shuō)明灌水時(shí)間間隔為8 d的處理促進(jìn)根頸中SP積累的效果最顯著。在不同的灌水時(shí)間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’的根頸SP含量在各磷肥用量處理下均高于CK，其中P2和P3處理的SP含量均顯著高于CK(P<0.05)，說(shuō)明適量的施用磷肥，能提高不同灌水時(shí)間間隔處理下紫花苜蓿根頸的SP含量，且在P2O5施用量為100和150 kg/hm2時(shí)效果最佳。

表5 水磷組合對(duì)不同品種紫花苜蓿根頸可溶性蛋白(SP)含量的影響

2.6 水磷組合對(duì)紫花苜蓿越冬率的影響

如表6所示，不同磷肥施用量處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’均以W2處理下的越冬率最高。在不同的灌水時(shí)間間隔處理下，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’的越冬率在不同磷肥用量(‘騎士T’W2P1處理除外)處理下顯著高于CK(P<0.05)，其中以P2處理的越冬率最高，其‘騎士T’的越冬率在W1、W2、W3處理下較CK分別提高95.77%，59.50%和58.38%，‘公農(nóng)1號(hào)’較CK分別提高70.09%，55.03%和62.52%，說(shuō)明施用磷肥能提高不同灌水時(shí)間間隔處理下紫花苜蓿的越冬率，且在P2O5施用量為100 kg/hm2時(shí)越冬率最高。

表6 水磷組合對(duì)不同品種紫花苜蓿越冬率的影響

2.7 紫花苜蓿根頸中生理指標(biāo)及越冬率間的相關(guān)性分析

由表7可知，‘騎士T’根頸MDA含量與SP含量無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，與CAT、POD、SOD活性和越冬率均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，POD活性與SOD活性和SP含量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其余指標(biāo)之間均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；‘公農(nóng)1號(hào)’根頸MDA含量與CAT活性、SP含量相關(guān)性不顯著，CAT活性與POD和SOD活性相關(guān)性不顯著，MDA含量與POD、SOD活性和越冬率均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，POD活性與SP含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其余指標(biāo)之間均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)果表明，苜蓿根頸中抗氧化酶活性、SP含量越高，MDA含量就越低，植物受傷害的程度越輕，苜蓿越冬能力越強(qiáng)。

表7 紫花苜蓿根頸丙二醛與抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量及越冬率的相關(guān)性分析

3 討 論

植物受到逆境脅迫后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生活性氧、自由基等對(duì)植物有傷害作用的物質(zhì)，繼而會(huì)開(kāi)啟植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，抗氧化酶系統(tǒng)中的CAT、POD、SOD等酶可清除這些有害物質(zhì)[17]。本研究表明，在施磷量相同的條件下，隨著灌水時(shí)間間隔的延長(zhǎng)，紫花苜蓿根頸CAT、POD和SOD活性大多呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，說(shuō)明輕度水分脅迫能誘導(dǎo)抗氧化酶活性增強(qiáng)；在相同灌水時(shí)間間隔處理下，隨著磷肥施用量的增加，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’苜蓿根頸中CAT、POD和SOD活性大多表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(shì)，說(shuō)明在水分脅迫條件下適量增施磷肥，可增強(qiáng)紫花苜蓿根頸中的抗氧化酶活性，進(jìn)而減緩細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，延緩細(xì)胞衰老。

可溶性蛋白是能對(duì)生物膜和細(xì)胞質(zhì)起到保護(hù)作用的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的親水特性，可提高細(xì)胞的保水能力[18]，是分析植物抗寒性的重要指標(biāo)。李佳歡等[19]的研究表明，適度干旱脅迫處理可增加苜蓿根頸中的可溶性蛋白含量，本試驗(yàn)結(jié)果與其一致，可能是因?yàn)檫m度延長(zhǎng)灌水時(shí)間間隔使植物細(xì)胞中蛋白水解酶類(lèi)活性增強(qiáng)，導(dǎo)致不可溶蛋白質(zhì)向可溶性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]，進(jìn)而使可溶性蛋白含量增加。另外，隨著磷肥施用量的增加，‘騎士T’苜蓿根頸可溶性蛋白含量在相同灌水時(shí)間間隔處理下均呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，‘公農(nóng)1號(hào)’苜蓿根頸可溶性蛋白含量在相同灌水時(shí)間間隔處理下呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明水分脅迫條件下適量增施磷肥能促進(jìn)根系生長(zhǎng)及養(yǎng)分吸收，緩解水分脅迫對(duì)植物正常生命活動(dòng)的限制，并且磷作為植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的重要組成部分，促進(jìn)了紫花苜蓿根頸中可溶性蛋白的積累，而過(guò)量的磷肥則對(duì)可溶性蛋白的積累有抑制作用。

MDA是細(xì)胞膜脂氧化過(guò)程中產(chǎn)生的一種高活性的過(guò)氧化產(chǎn)物，可以與細(xì)胞中的多種物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)胞活性氧的代謝過(guò)程[21-22]。當(dāng)土壤的水肥條件不利于植物生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中的MDA大量積累，所以MDA含量可作為反映植物受傷害程度的指標(biāo)[23]。本研究結(jié)果表明，隨著灌水時(shí)間間隔的延長(zhǎng)，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’苜蓿根頸的MDA含量表現(xiàn)為持續(xù)增長(zhǎng)，說(shuō)明干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂氧化過(guò)程加重，這與陳雅婷等[24]和張銀敏[25]的研究結(jié)果一致；且隨著磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根頸的MDA含量在相同灌水時(shí)間間隔處理下均表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，說(shuō)明適量增施磷肥，可提高抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量，進(jìn)而增強(qiáng)紫花苜蓿抵御水分脅迫的能力。

本研究結(jié)果表明，隨著灌水時(shí)間間隔的延長(zhǎng)和磷肥施用量的增加，‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’紫花苜蓿的越冬率均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且在相關(guān)性分析中，越冬率與CAT、POD、SOD活性和可溶性蛋白含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明輕度水分脅迫與適量磷肥組合處理，能促進(jìn)紫花苜蓿根頸中的抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的增加，進(jìn)而降低MDA含量，緩解細(xì)胞膜脂氧化，保證生物膜系統(tǒng)的完整性及生理代謝的正常進(jìn)行[26]，降低紫花苜蓿對(duì)不良環(huán)境的敏感度[11]，從而提高其抗寒性，有利于其安全越冬。

4 結(jié) 論

‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’苜蓿根頸的POD、SOD活性、可溶性蛋白含量及越冬率均在灌水時(shí)間間隔為8 d時(shí)達(dá)到最大值，CAT活性在此灌水時(shí)間間隔處理下也較高；‘騎士T’和‘公農(nóng)1號(hào)’苜蓿根頸的POD和可溶性蛋白含量在P2和P3處理下均顯著高于CK(‘公農(nóng)1號(hào)’苜蓿根頸的W3P3處理除外)；W2P2處理的總體效果最好，該處理‘騎士T’根頸MDA含量較CK降低51.84%，CAT、POD、SOD活性以及可溶性蛋白含量和越冬率較CK分別增加了45.12%，58.11%，21.98%，38.18%和59.50%；‘公農(nóng)1號(hào)’根頸MDA含量較CK降低51.18%，CAT、POD、SOD活性以及可溶性蛋白含量和越冬率較CK分別增加了83.56%，59.65%，42.03%，62.06%和55.03%。因此建議，科爾沁沙地建植苜蓿，水磷耦合的組合宜為灌水時(shí)間間隔為8 d，磷肥(P2O5)施用量為100 kg/hm2。