叢海燕 王 娜 常 鑫 王海濤 楊金存

1.山東大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東 威海 264200；2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044；3.山東大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院燒傷整形科，山東 威海 264200；

皮膚是人體最大的器官，其主要功能是保護(hù)人體免受病原體的侵襲。糖尿病或大面積燒傷等因素經(jīng)常會(huì)損傷皮膚，不僅給患者帶來(lái)身體和精神上的痛苦，還會(huì)造成巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，許多研究都在關(guān)注如何加速傷口愈合［1-2］。間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖分化能力，目前已被廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生等研究中，且被證實(shí)具有良好的皮膚損傷修復(fù)功能。

雖然干細(xì)胞的更新修復(fù)能力較強(qiáng)，但在臨床應(yīng)用中仍存在較多缺陷，包括：免疫原性過(guò)強(qiáng)，會(huì)引起機(jī)體排斥等不良反應(yīng)［3］，引起治療效率低下［5］；分裂增殖能力強(qiáng)，有致瘤風(fēng)險(xiǎn)［4］；移植過(guò)程中涉及倫理問(wèn)題。研究表明，干細(xì)胞移植后，只有少數(shù)干細(xì)胞通過(guò)分化來(lái)替代受損組織，其發(fā)揮作用的主要機(jī)制是依賴旁分泌改變局部微環(huán)境［6-7］。外泌體是干細(xì)胞旁分泌的重要組分，與干細(xì)胞相比具有免疫原性低、穩(wěn)定性高、活性高、不易致瘤等優(yōu)勢(shì)［8］，近年來(lái)引起廣泛關(guān)注，被應(yīng)用到多種形式皮膚損傷的治療研究中。本文就各類間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在多種形式皮膚損傷中的治療應(yīng)用及其作用機(jī)制的研究新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的生物學(xué)特性

外泌體是細(xì)胞通過(guò)特殊的內(nèi)吞外排機(jī)制主動(dòng)向胞外分泌的一種直徑為30 ～100 nm的微型囊泡，幾乎所有的活細(xì)胞都可以分泌外泌體［9-11］。此外，外泌體還存在于唾液、血漿、尿液等多種類型的體液中［12-14］。外泌體主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸構(gòu)成，脂質(zhì)構(gòu)成了外泌體的膜結(jié)構(gòu)，為外泌體提供了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性并包裹著蛋白和核酸（miRNAs、mRNA、lncRNA等）等活性物質(zhì)。

正常細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠有效清除細(xì)胞代謝廢物并介導(dǎo)細(xì)胞間信息轉(zhuǎn)導(dǎo)，但某些特殊細(xì)胞分泌的外泌體，由于攜帶分泌細(xì)胞的特異性活性物質(zhì)，因此具有特殊的生物學(xué)功能，如腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體因攜帶特殊的miRNA，具有免疫學(xué)標(biāo)志功能，可作為診斷標(biāo)志物［15-16］。干細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有干細(xì)胞分泌的多種蛋白和核酸，因此具有促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等作用。

2 皮膚愈合的過(guò)程和機(jī)制

皮膚是附屬在體表外最大的器官，一些理化因素會(huì)造成皮膚的損傷，常見(jiàn)的有創(chuàng)傷、燙傷和燒傷，還有慢性疾病引發(fā)的皮膚損傷，如糖尿病引發(fā)的潰瘍。皮膚損傷的修復(fù)可以概括為以下4 個(gè)時(shí)期：①血液凝固期：損傷初期血小板和凝血因子被激活，啟動(dòng)內(nèi)、外源性凝血途徑實(shí)現(xiàn)凝血；②炎癥反應(yīng)期：中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增多，通過(guò)吞噬異物和調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放調(diào)控炎癥反應(yīng)；③細(xì)胞增殖期：包括通過(guò)成纖維細(xì)胞增殖介導(dǎo)肉芽組織形成、通過(guò)角質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)再上皮化和通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞增殖介導(dǎo)血管生成等過(guò)程；④組織重塑期：隨著細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的分泌和肉芽組織的增生，成纖維細(xì)胞分裂合成大量膠原纖維，新生血管增多。后期在基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）作用下，降解ECM，膠原蛋白發(fā)生新陳代謝，最終導(dǎo)致瘢痕的形成［17］。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)的機(jī)制

皮膚愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞以及各種生長(zhǎng)因子協(xié)同發(fā)揮作用。外泌體攜帶間充質(zhì)干細(xì)胞的多種活性物質(zhì)，通過(guò)向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性蛋白和核酸等分子，在炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞增殖期和組織重塑期發(fā)揮作用，參與調(diào)控創(chuàng)面愈合過(guò)程中的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和遷移、血管生成與基質(zhì)重建等多個(gè)方面，促進(jìn)創(chuàng)面愈合并抑制瘢痕形成［18-19］。

3.1 外泌體在炎癥反應(yīng)期的作用及機(jī)制

炎癥反應(yīng)是調(diào)控創(chuàng)面修復(fù)的重要階段，多種炎癥細(xì)胞和各種炎癥因子協(xié)同參與炎癥反應(yīng)對(duì)抗感染。巨噬細(xì)胞是重要的炎癥細(xì)胞，具有促炎M1 和抗炎M2 兩個(gè)表型。研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化，對(duì)抗皮膚損傷引起的炎癥反應(yīng)，此過(guò)程中伴隨著各種炎癥因子表達(dá)量的變化。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（human bone marrow mesenchymal stem cell exosome, hBMSCEXO）可以通過(guò)激活PTEN/AKT 信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗炎表型M2型極化，抑制促炎表型M1型極化，并且抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10 的表達(dá)，加快了糖尿病小鼠皮膚損傷的愈合［20］。在模擬炎癥狀態(tài)下，人臍帶血間充質(zhì)干 細(xì) 胞 外 泌 體（human umbilical cord bloodmesenchymal stem cell exosome, hucMSC-EXO）中特異表達(dá)的miRNA let-7b 通過(guò)TLR4/NF-κB/STAT3/AKT 信號(hào)通路穩(wěn)定調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，促使巨噬細(xì)胞向抗炎表型M2 型分化，減輕了炎癥反應(yīng)并促進(jìn)了糖尿病皮膚傷口的愈合［21］。hucMSCEXO的miRNA微陣列分析顯示，與成纖維細(xì)胞外泌體相比，hucMSC-EXO 中miR-21、miR-146a 和miR-181上調(diào)表達(dá)較顯著，通過(guò)文獻(xiàn)回顧，認(rèn)為上述3種miRNA在傷口炎癥反應(yīng)中具有炎癥調(diào)節(jié)的功能［22］，其中miR-181 的抗炎作用已被證實(shí)。hucMSC-EXO中的miR-181可以降低燒傷部位中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量，抑制TLR4信號(hào)通路，抑制調(diào)控炎癥反應(yīng)重要因子NF-κB/P65 和p-P65 蛋白的激活，阻止炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的釋放，促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用［23］。

3.2 外泌體在促進(jìn)細(xì)胞增殖期和抑制細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制

細(xì)胞增殖和皮膚再上皮化是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵，此階段依賴成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞不斷增殖遷移。成纖維細(xì)胞增殖產(chǎn)生ECM，包括纖連蛋白和Ⅰ型、Ⅲ型膠原。上皮細(xì)胞增殖并向創(chuàng)面中心遷移，介導(dǎo)再上皮化，減少皮膚感染。

干細(xì)胞外泌體已被證實(shí)可以通過(guò)內(nèi)化途徑直接進(jìn)入成纖維細(xì)胞促進(jìn)其增殖遷移和膠原合成，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合［24］。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（adipose-derived mesenchymal stem cell exosome,ADSC-EXO）進(jìn)入成纖維細(xì)胞后，通過(guò)上調(diào)N-鈣黏素（N-cadherin）、細(xì)胞周期蛋白-1、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、金屬蛋白酶1（metalloproteinase 1，MMP1）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor β1，TGF-β1）的表達(dá)刺激細(xì)胞增殖和膠原合成，加速皮膚創(chuàng)面愈合［25-26］。

外泌體還可以通過(guò)釋放活性物質(zhì)至受體細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)受體細(xì)胞增殖遷移的調(diào)控。hucMSCEXO中的Wnt4蛋白能激活wnt/β-catenin信號(hào)通路、Jagged1 蛋白能激活North 通路，促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖和遷移及合成ECM的能力，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［27-28］。胎兒真皮間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（fetal dermal mesenchymal stem cell exosome, FDMSCEXO）的Jagged 1蛋白也可激活North通路發(fā)揮同樣的功效［29］。脂肪干細(xì)胞外泌體（adipose-derived stem cell exosome,AD-EXO）中的miR-21 可以激活PI3K-AKT 通路、lncRNA MALAT1 錨 定miR-124 可以激活wnt/β-catenin 信號(hào)通路，促進(jìn)皮膚損傷模型中的角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖、遷移，并抑制細(xì)胞凋亡［30-31］。hBMSC-EXO 中的lncRNA H19 在成纖維細(xì)胞中與miR-152-3p結(jié)合，抑制磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的表達(dá)，同時(shí)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移并抑制其凋亡，促進(jìn)糖尿病小鼠傷口的愈合［32］。

3.3 促進(jìn)血管再生

皮膚愈合的血管生成階段主要依賴內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及各類血管生成因子的相互作用。外泌體可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，或通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子等的表達(dá)水平間接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管形成，為新生組織提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣。

人胎盤(pán)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（human placenta derived mesenchymal stem cells,PMSCs）分泌相當(dāng)數(shù)量的促血管生成分子，可顯著改善糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的血管生成。在此過(guò)程中，旁分泌機(jī)制發(fā)揮了重要作用，而該作用很可能是通過(guò)外泌體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的［33］。Liu 等［34］發(fā)現(xiàn)hucMSC-EXO 通過(guò)血管生成素2（Ang-2）促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成管能力，促進(jìn)創(chuàng)面的血管生成。hBMSC-EXO 的蛋白組學(xué)分析結(jié)果顯示，外泌體中有1 927種蛋白質(zhì)，其中多種與血管生成相關(guān)，如血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及NFk-B 信號(hào)通路蛋白等，可直接促進(jìn)血管生成［35］。除了直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞外，外泌體中攜帶的活性蛋白或核酸等，可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的其他活性因子的表達(dá)，間接促進(jìn)血管生成。如hucMSC-EXO 中的Wnt4 蛋白可以進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin 活化，增加PCNA、cyclin-D3和N-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)血管生成［27］。ADSC-EXO 富含miR-125a，可以抑制血管生成抑制因子DLL4 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮尖端細(xì)胞的形成來(lái)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生成血管［36］。hucMSC-EXO 中miR-21-3p 高度富集，可以下調(diào)PTEN 和SPRY1 的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)PI3K/Akt 和ERK1/2 信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的促血管生成作用，但miR-21-3p 并不是hucMSC-EXO 發(fā)揮促血管生成作用的唯一介質(zhì)，其他信號(hào)分子可能也參與了這一過(guò)程［37］。

3.4 抑制瘢痕形成

瘢痕形成是傷口愈合的最后一個(gè)過(guò)程，瘢痕形成的主要機(jī)制是成纖維細(xì)胞顯著增生，膠原蛋白過(guò)度沉積，并合成細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致病理性瘢痕形成。

ADSC-EXO注射后，小鼠創(chuàng)面組織學(xué)分析顯示，在傷口愈合的早期，外泌體增加了Ⅰ和Ⅲ型膠原的生成，而在后期，外泌體可能抑制膠原表達(dá)，以減少疤痕形成［25］。

Fang 等［38］在hucMSC-EXO 中發(fā)現(xiàn)一組特異性miRNA（miR-21、miR-125b 和miR-145）通 過(guò) 抑 制TGF-β/SMAD途徑，抑制TGF-β與相應(yīng)受體結(jié)合，切斷細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制肌成纖維細(xì)胞激活，減少肌動(dòng)蛋白生成和膠原沉積，從而抑制瘢痕形成。hucMSC-EXO 還 可 以 遞 送14-3-3ζ 促 進(jìn)p-LATS 和YAP結(jié)合，增強(qiáng)YAP磷酸化進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin通路的激活，從而限制真皮成纖維細(xì)胞的過(guò)度擴(kuò)張和膠原沉積，抑制瘢痕的形成［39］。ADSC-EXO 通過(guò)調(diào)節(jié)III型和I型膠原比例調(diào)節(jié)膠原蛋白的沉積和排列，通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β3和TGF-β1比例調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞分化，減輕瘢痕形成。還可激活ERK/MAPK通路增加皮膚真皮成纖維細(xì)胞MMP3 的表達(dá)，導(dǎo)致MMP3 與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP1）的比例增高，這也有利于ECM 的重塑，促進(jìn)無(wú)瘢痕創(chuàng)面修復(fù)［40］。

4 外泌體調(diào)控在創(chuàng)面愈合中的應(yīng)用

間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體已被證實(shí)對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合有顯著的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)利用分子生物學(xué)手段或細(xì)胞工程技術(shù)對(duì)外泌體或干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，會(huì)進(jìn)一步提高外泌體的效能。

根據(jù)外泌體的生物相容性，通過(guò)電穿孔將miR-21-5p 模擬物加載到人脂肪干細(xì)胞外泌體（hASCEXO）中，調(diào)控后的外泌體通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)再上皮化、膠原重塑、血管生成和成熟，加速糖尿病創(chuàng)面愈合［41］。從過(guò)表達(dá)miR-126的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中分離出的外泌體（Exo-miR-126），通過(guò)靶向PIK3R2 激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。在體內(nèi)給藥Exo-miR-126 顯著增加了毛細(xì)血管數(shù)量，加速創(chuàng)面愈合［42］。同樣，過(guò)表達(dá)lncRNA H19 和Nrf 2 的間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌的外泌體都增強(qiáng)了糖尿病足的愈合效果［32，43］。以上研究表明，外泌體與特定功能的分子相結(jié)合是促進(jìn)創(chuàng)面愈合新的手段和策略。

除直接搭載功能分子外，在干細(xì)胞培養(yǎng)階段，施加某些生物、化學(xué)、物理因素也可以影響并增強(qiáng)外泌體的創(chuàng)面修復(fù)能力。研究表明，經(jīng)新生兒血清培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌的BMSC-EXO 促進(jìn)創(chuàng)面愈合的效果更佳［44］。經(jīng)阿托伐他?。╝torvastatin，ATV）預(yù)處理的ATV-BMSC-EXO，能促進(jìn)血管的形成，可以更顯著地提高糖尿病大鼠傷口再生的能力［45］。由Fe3O4納米顆粒和靜磁場(chǎng)（static magnetic fields，SMF）預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌的外泌體（mag-BMSC-EXO）中，miR-21-5p 高度富集，可通過(guò)抑制SPRY2，激活PI3K/AKT 和ERK1/2 信號(hào)通路，加速大鼠皮膚創(chuàng)面愈合，且愈合后的疤痕寬度更窄，血管生成增強(qiáng)［46］。

5 外泌體在創(chuàng)面治療中給藥方式的研究進(jìn)展

目前，外泌體治療皮膚損傷常用的給藥方式為體內(nèi)注射和局部注射，但注射不能使外泌體與損傷部位直接接觸，還會(huì)因?yàn)轶w內(nèi)的清除效應(yīng)，影響其功能的發(fā)揮［47］，因此，近年來(lái)研究者不斷嘗試新的生物支架，作為外泌體的緩釋載體，維持其在創(chuàng)面的生物活性，進(jìn)一步加速創(chuàng)面愈合。其中，應(yīng)用較多的載體為水凝膠。生物醫(yī)學(xué)水凝膠的結(jié)構(gòu)類似于天然的ECM，不僅具有良好的生物相容性，還能改變細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境。Wang 等［48］制成多功能FHE 水凝膠，ADSC-EXO 通過(guò)靜電作用加載到FHE水凝膠中。與單純的外泌體相比，該水凝膠可通過(guò)持續(xù)釋放外泌體，獲得更佳的促進(jìn)創(chuàng)面愈合效果。Shi 等［49］利用殼聚糖和絲素制備成水凝膠海綿，并在此基礎(chǔ)上添加了外泌體，添加了外泌體的水凝膠可通過(guò)促進(jìn)膠原蛋白的再上皮化、促進(jìn)血管生成和神經(jīng)元長(zhǎng)入，有效促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合。另外，還有研究指出，外泌體與PF-127水凝膠［50］、海藻酸鹽水凝膠［51］、殼聚糖水凝膠［52］、負(fù)載了姜黃莪術(shù)多糖的殼聚糖/絲水凝膠［53］、天然甲基纖維素-殼聚糖水凝膠［54］等形式的水凝膠相結(jié)合，具有良好的機(jī)械性能、保水性、抗感染能力和細(xì)胞生物相容性，會(huì)更穩(wěn)定高效地發(fā)揮外泌體對(duì)創(chuàng)面的愈合效果。

6 小 結(jié)

本文綜述了間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的生物學(xué)特性及其在皮膚損傷修復(fù)方面的作用機(jī)制，綜上，外泌體對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用已得到充分的證實(shí)。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體與干細(xì)胞相比具有高穩(wěn)定性、高效性等優(yōu)勢(shì)，最重要的是外泌體具有可調(diào)控性，可以通過(guò)多種調(diào)控手段調(diào)控其內(nèi)部活性物質(zhì)的種類和含量，以增強(qiáng)其創(chuàng)面愈合的效果。外泌體與生物載體的結(jié)合，能使其更高效穩(wěn)定地發(fā)揮療效。

雖然現(xiàn)有研究展示了外泌體的廣闊應(yīng)用前景，但目前仍存在諸多問(wèn)題阻礙其臨床應(yīng)用：一方面是外泌體的內(nèi)容物和功能受分泌細(xì)胞種類和狀態(tài)的影響，涉及的信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，尚未完全透徹闡明；另一方面是外泌體的提取鑒定操作復(fù)雜且沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不能規(guī)模化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。因此，目前外泌體對(duì)創(chuàng)面愈合的研究只停留在實(shí)驗(yàn)室探索階段。今后，需要更多的研究來(lái)進(jìn)一步闡明間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制，并進(jìn)一步革新其制備與純化技術(shù)，探究其在臨床治療中發(fā)揮的功效，進(jìn)一步推動(dòng)其在再生修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突