近日，中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心研究員周斌研究組以“Dual Genetic Lineage Tracing Reveals Capillary to Artery Formation in the Adult Heart”為題，在Circulation上在線(xiàn)發(fā)表研究成果。該研究利用雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤技術(shù)高效且清晰地記錄成體心臟損傷過(guò)程中毛細(xì)血管形成冠狀動(dòng)脈的過(guò)程，揭示了毛細(xì)血管動(dòng)脈化在成體心肌缺血模型中的重要作用，為受損心臟的血管修復(fù)和治療提供了新的研究方向，為心血管再生醫(yī)學(xué)提供了新思路。

冠狀動(dòng)脈疾病一直是全人類(lèi)致死率最高的疾病之一。冠狀動(dòng)脈一旦發(fā)生病變，將阻礙血液有效流向心肌，導(dǎo)致心肌組織缺乏必需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而引發(fā)心肌梗死。如何使病變的冠狀動(dòng)脈再度發(fā)揮血流作用（血運(yùn)重建）或者刺激新的冠狀動(dòng)脈生成一直是該領(lǐng)域研究者努力的方向。支架植入和冠狀動(dòng)脈旁路移植技術(shù)的開(kāi)發(fā)與發(fā)展使得血運(yùn)重建成為可能，挽救了部分患者的生命。側(cè)支動(dòng)脈的形成為新生期梗死的心臟提供血流，從而緩解心臟衰竭。然而，有一定數(shù)量的患者由于身體原因不能接受血運(yùn)重建的治療，而側(cè)支動(dòng)脈的形成目前仍受限于新生期。因此，深入探究新生冠狀動(dòng)脈來(lái)源及形成機(jī)制將為心臟損傷后血管的修復(fù)與再生提供新的策略或方法。

目前，關(guān)于側(cè)支動(dòng)脈新生有兩種解釋模型。一種是動(dòng)脈發(fā)生（Arteriogenesis），即預(yù)先存在的動(dòng)脈通過(guò)快速的管腔開(kāi)放和血管壁增厚產(chǎn)生側(cè)支動(dòng)脈（Helisch A et al.，Microcirculation 2003）；另一種是動(dòng)脈化（Arterialization），即毛細(xì)血管通過(guò)血管生成進(jìn)行血管重塑，并招募周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，以產(chǎn)生側(cè)支動(dòng)脈（Faber JE et al.，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2014）。鑒于在成體心肌梗死過(guò)程中很少觀(guān)察到毛細(xì)血管通過(guò)動(dòng)脈化產(chǎn)生冠狀動(dòng)脈（He et al.，Cardiovasc Res 2016），目前的主流觀(guān)點(diǎn)更偏向于用動(dòng)脈發(fā)生模型解釋新生的冠狀動(dòng)脈。然而，隨著技術(shù)的發(fā)展，冠狀動(dòng)脈新生的方式仍需進(jìn)一步研究。

為靈敏且干凈地檢測(cè)到從毛細(xì)血管衍生出的動(dòng)脈，研究人員在雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)（He et al., Nature Medicine 2017）的基礎(chǔ)上，建立了無(wú)縫隙捕捉毛細(xì)血管動(dòng)脈化的新系統(tǒng)。前人的研究之所以很難在成體捕捉到毛細(xì)血管動(dòng)脈化的過(guò)程，有以下兩層阻礙。首先，毛細(xì)血管的分子標(biāo)志物Apln在成體心臟中只活躍于部分血管新生的毛細(xì)血管而非動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，這就使得在成體心臟中高效地標(biāo)記毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞成為一個(gè)技術(shù)難題。其次，若單純標(biāo)記毛細(xì)血管，想要在無(wú)數(shù)的毛細(xì)血管中找出由毛細(xì)血管動(dòng)脈化產(chǎn)生的少量動(dòng)脈無(wú)異于大海撈針，這種低分辨率的方法很容易讓研究者忽視掉由毛細(xì)血管動(dòng)脈化產(chǎn)生的動(dòng)脈。為克服以上阻礙，周斌團(tuán)隊(duì)利用Cdh5-DreER、Apln-CrexER和Cx40-LSL-GFP三個(gè)小鼠品系，建立了一個(gè)在小鼠心臟中只標(biāo)記由毛細(xì)血管衍生而來(lái)的動(dòng)脈的系統(tǒng)。Cdh5-DreER是內(nèi)皮特異性的小鼠品系，Apln-CrexER是毛細(xì)血管特異性的小鼠品系，Cx40-LSL-GFP可將動(dòng)脈標(biāo)記成綠色。當(dāng)受到他莫昔芬的誘導(dǎo)后，Cdh5-DreER的DreER便會(huì)入核，切掉Apln-CrexER的rox-ER-rox，使得Apln-CrexER變成持續(xù)表達(dá)的Apln-Cre，而一旦表達(dá)Apln的細(xì)胞中的Cx40基因啟動(dòng)，那么Apln-Cre的Cre就會(huì)入核，切掉Cx40-LSL-GFP的loxP-stop-loxP，使得該細(xì)胞呈亮綠色，也就是表達(dá)過(guò)Apln的毛細(xì)血管衍變成動(dòng)脈（表達(dá)Cx40）后就會(huì)被綠色標(biāo)記。該系統(tǒng)通過(guò)將Apln-CrexER變成Apln-Cre，突破了Apln-CreER只能在成體心臟中標(biāo)記新生毛細(xì)血管的限制，同時(shí)通過(guò)Cdh5-DreER保留了用他莫昔芬作為誘導(dǎo)事件發(fā)生的優(yōu)勢(shì)。此外，研究人員引入Cx40-LSL-GFP作為報(bào)告基因，將熒光標(biāo)記限制在表達(dá)Cx40的動(dòng)脈中，做到了只看毛細(xì)血管衍生的動(dòng)脈，克服了標(biāo)記所有毛細(xì)血管的缺陷。利用這套靈敏且清晰的系統(tǒng)，研究人員期望在心臟損傷過(guò)程中記錄所有毛細(xì)血管動(dòng)脈化產(chǎn)生動(dòng)脈的事件。

為了檢測(cè)該系統(tǒng)是否符合預(yù)期，研究人員基于新生期仍發(fā)生毛細(xì)血管動(dòng)脈化的既有知識(shí)，對(duì)新生的Cdh5-DreER、Apln-CrexER、Cx40-LSL-GFP三基因型小鼠開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。研究人員對(duì)p0天的三基因小鼠注射他莫昔芬，在p2天對(duì)該小鼠進(jìn)行心肌缺血（MI）手術(shù)，p6天收取該小鼠的心臟進(jìn)行分析。全組織熒光照片的結(jié)果表明，MI后形成了清晰的GFP+側(cè)支動(dòng)脈，MI組的動(dòng)脈數(shù)量較未損傷組要多，且通過(guò)免疫熒光染色共染平滑肌的標(biāo)志物aSMA與GFP，證實(shí)GFP陽(yáng)性的細(xì)胞都被aSMA包裹，表明毛細(xì)血管動(dòng)脈化形成了側(cè)支動(dòng)脈。以上結(jié)果既表明該系統(tǒng)可用于追蹤毛細(xì)血管動(dòng)脈化產(chǎn)生的新動(dòng)脈，也揭示了在新生期心臟損傷修復(fù)過(guò)程中的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞貢獻(xiàn)給側(cè)支動(dòng)脈的重要生物學(xué)過(guò)程。

為了在成體損傷情況下探究毛細(xì)血管動(dòng)脈化產(chǎn)生動(dòng)脈的情況，研究人員對(duì)8周大的Cdh5-DreER、Apln-CrexER、Cx40-LSL-GFP三基因型小鼠進(jìn)行他莫昔芬注射，為避免他莫昔芬殘留對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，研究人員在他莫昔芬注射后兩周才對(duì)小鼠進(jìn)行心梗手術(shù)。為探究不同心梗類(lèi)型下毛細(xì)血管的動(dòng)脈化，研究人員引入了三種心梗模型，包括主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)（TAC）、心肌缺血再灌注（MI/R）和心肌缺血（MI）。全組織熒光照片的結(jié)果顯示，在TAC和MI/R心梗模型下幾乎看不到GFP陽(yáng)性的信號(hào)，而MI后可看到明顯的GFP陽(yáng)性的血管形態(tài)。為了更加精細(xì)地探究該GFP陽(yáng)性的細(xì)胞是否是動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，研究人員對(duì)三種心梗模型中收到的心臟組織分別進(jìn)行切片染色，利用免疫熒光染色的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，將GFP與aSMA、SM22、SM-MHC三種平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物共染。結(jié)果表明，MI后出現(xiàn)的GFP陽(yáng)性的細(xì)胞確實(shí)被aSMA、SM22、SM-MHC陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞包裹，證實(shí)該由毛細(xì)血管衍生而來(lái)的GFP陽(yáng)性的細(xì)胞是動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。

此外，對(duì)在TAC和MI/R模型下得到的心臟樣本進(jìn)行連續(xù)切片，均沒(méi)有檢測(cè)到GFP信號(hào)，為排除該系統(tǒng)在這兩種模型下效率較低的可能，研究人員引入了R26-LSL-tdTomato的小鼠，對(duì)Cdh5-DreER、Apln-CrexER、Cx40-LSL-GFP、R26-LSL-tdTomato進(jìn)行TAC或者M(jìn)I/R，收取其心臟樣本進(jìn)行切片染色，發(fā)現(xiàn)大量的tdTomato信號(hào)，該結(jié)果表明，在TAC和MI/R模型下，Cdh5-DreER可以高效率切除Apln-CrexER的rox-ER-rox，使得Apln-Cre得以進(jìn)一步切除R26-LSL-tdTomato的loxP-stop-loxP，從而將毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記成tdTomato。因此，研究人員推斷，TAC或者M(jìn)I/R心梗模型下沒(méi)有檢測(cè)到GFP陽(yáng)性的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，不是由于系統(tǒng)效率的原因，而是在這兩種損傷模型下，心臟的缺血程度不足以刺激毛細(xì)血管動(dòng)脈化的發(fā)生。換言之，在嚴(yán)重的MI心梗模型下，存在毛細(xì)血管動(dòng)脈化產(chǎn)生新的冠狀動(dòng)脈。

綜上所述，該團(tuán)隊(duì)基于實(shí)驗(yàn)室建立的雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)，開(kāi)發(fā)出一套更加靈敏且清晰的系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在成體損傷條件下追蹤毛細(xì)血管動(dòng)脈化產(chǎn)生動(dòng)脈的目標(biāo)。這項(xiàng)研究結(jié)果豐富了成體損傷條件下新生動(dòng)脈來(lái)源的知識(shí)，為心臟損傷后血管修復(fù)與再生治療提供了新思路。

（中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心）