馬小雨，戴澤宇，鐘南哲，肖建如

(上海長(zhǎng)征醫(yī)院骨腫瘤外科，上海 黃浦 200003)

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于四肢長(zhǎng)骨干骺端，惡性程度高，預(yù)后較差。目前骨肉瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療原則為手術(shù)切除聯(lián)合化療(包括阿霉素、甲氨蝶呤、順鉑和異環(huán)磷酰胺)，術(shù)后5年的生存率約為70%。但是，40%的患者會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移后5年的生存率不到20%[1]。目前，骨肉瘤仍存在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥等諸多問題，治療效果不理想，迫切需要新的治療策略[2]。

Hippo信號(hào)通路是一條由一系列蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄共激活因子及其他調(diào)控分子構(gòu)成的生長(zhǎng)抑制通路，通過級(jí)聯(lián)蛋白磷酸化調(diào)控細(xì)胞信號(hào)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和分化，在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[3]。Hippo通路的核心分子包括哺乳動(dòng)物STE20樣蛋白激酶1/2(mammalian STE20-like protein kinase 1/2，MST1/2)、大型腫瘤抑制激酶1/2(large tumor suppressor 1/2，LATS1/2)、薩爾瓦多家族含WW結(jié)構(gòu)域蛋白1(salvador homologue 1，SAV1)、Mob激酶激活因子1A/B(MOB kinase activator 1 A/B，MOB1A/B)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)或含PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)。Hippo信號(hào)通路的作用主要由YAP/TAZ決定，與具有TEA域的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子(TEA domain family member，TEAD)等結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[3]。本文對(duì)Hippo信號(hào)通路中YAP/TAZ在骨肉瘤中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，希望為骨肉瘤的治療提供更廣闊的思路。

1 YAP/TAZ的結(jié)構(gòu)和功能

YAP和TAZ是Hippo信號(hào)通路中的核心效應(yīng)蛋白，在組織中廣泛存在并在許多腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，YAP和TAZ蛋白約50%的氨基酸序列同源，且結(jié)構(gòu)非常相似。YAP和TAZ主要由TEAD結(jié)構(gòu)域(轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、WW結(jié)構(gòu)域(雙色氨酸結(jié)構(gòu)域)、TAD結(jié)構(gòu)域(轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)、PDZ結(jié)合基序構(gòu)成[5]。TEAD結(jié)構(gòu)域識(shí)別TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族并激活靶基因表達(dá)，如CTGF和Cyr61基因；WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合PPxY基序(脯氨酸/脯氨酸/任何氨基酸/酪氨酸)介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用；TAD結(jié)構(gòu)域可與特定的基因結(jié)合，啟動(dòng)特定基因的轉(zhuǎn)錄；PDZ結(jié)合基序是與許多跨膜或細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的PDZ域結(jié)合所必需的[5]。YAP/TAZ缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，無法直接與DNA結(jié)合，因此作為共激活轉(zhuǎn)錄因子參與基因的表達(dá)調(diào)控。

當(dāng)Hippo信號(hào)通路激活時(shí)，YAP/TAZ發(fā)生磷酸化，滯留在細(xì)胞質(zhì)中，或經(jīng)泛素化途徑降解，抑制細(xì)胞增殖；當(dāng)Hippo信號(hào)通路被抑制時(shí)，未磷酸化的YAP/TAZ進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TEAD1-4結(jié)合，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)基因的表達(dá)[4-5]。YAP和TAZ功能上大多相似，通過影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、自噬、代謝重編程和免疫微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[4]。但YAP和TAZ也有特異性的靶因子，因此兩者的功能并不完全相同[5]。

2 YAP/TAZ在骨肉瘤中的表達(dá)及預(yù)后

骨肉瘤仍缺乏有效的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，YAP/TAZ具有成為分子標(biāo)志物的潛力。組織芯片染色證實(shí)60%～85%的人類骨肉瘤樣本中可見YAP高表達(dá)[6-8]，并且高級(jí)別骨肉瘤中的YAP表達(dá)水平更高，提示YAP表達(dá)與骨肉瘤Enneking分期相關(guān)[6]。Zucchini等[8]發(fā)現(xiàn)YAP細(xì)胞核表達(dá)陽性和陰性的骨肉瘤患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移事件發(fā)生率為53%和36%，提示YAP核陽性與骨肉瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生相關(guān)。Zucchini等[8]進(jìn)一步將YAP核陽性分為高表達(dá)和低表達(dá)/不表達(dá)，生存曲線顯示YAP在細(xì)胞核中的高表達(dá)顯著降低骨肉瘤患者的無復(fù)發(fā)生存時(shí)間和總生存期。另一項(xiàng)研究也報(bào)道，YAP高轉(zhuǎn)錄水平與骨肉瘤患者較差的預(yù)后顯著相關(guān)[9]。因此，YAP高表達(dá)的患者預(yù)后更差，并且YAP核陽性與骨肉瘤高級(jí)別、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，可協(xié)助判斷預(yù)后情況。

TAZ在骨肉瘤中的研究較少。Ma等[10]發(fā)現(xiàn)，81.25%的骨肉瘤組織中TAZ強(qiáng)陽性，且腫瘤組織中TAZ轉(zhuǎn)錄活性明顯高于對(duì)照組。另一研究[11]報(bào)道TAZ在47例骨肉瘤中的陽性表達(dá)率為59.6%，與骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤Enneking分期有關(guān)。目前認(rèn)為，YAP/TAZ高表達(dá)水平與總生存率相關(guān)，且YAP/TAZ細(xì)胞核陽性表達(dá)患者的預(yù)后更差，提示YAP/TAZ細(xì)胞核陽性表達(dá)可能是骨肉瘤的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]。

3 YAP/TAZ在骨肉瘤中的作用機(jī)制

3.1 驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生 骨肉瘤的發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜，其中YAP/TAZ的調(diào)節(jié)異?？赡馨l(fā)揮重要作用。研究認(rèn)為腫瘤抑制蛋白P53的突變會(huì)影響間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的成骨分化，并導(dǎo)致骨肉瘤的啟動(dòng)[13]。在正常條件下P53調(diào)節(jié)成骨和破骨分化以防止骨腫瘤的發(fā)生，而Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)的過表達(dá)可抑制P53的功能[14]。在MSCs中，TAZ的過表達(dá)激活RUNX2，使其表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)成骨分化過程[15]。但是，YAP與RUNX2相互作用抑制COL10a1或Sox9表達(dá)，從而抑制軟骨細(xì)胞的成熟與分化[16]。這表明YAP/TAZ的調(diào)節(jié)異?？赡芘cMSCs分化異常密切相關(guān)。Chan等[7]激活成骨細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路，在P53雜合子小鼠中建立骨肉瘤模型，發(fā)現(xiàn)所得腫瘤中YAP高表達(dá)，進(jìn)一步抑制YAP表達(dá)顯著降低了該模型中骨肉瘤細(xì)胞的致瘤潛力，提示YAP的過表達(dá)可能在驅(qū)動(dòng)骨肉瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

3.2 促進(jìn)腫瘤增殖 YAP/TAZ的持續(xù)激活會(huì)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖。Zucchini等[8]發(fā)現(xiàn)抑制小鼠骨肉瘤模型的YAP活性后，骨肉瘤細(xì)胞的體外增殖降低。Yang等[17]發(fā)現(xiàn)YAP在人骨肉瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，而敲低YAP表達(dá)可降低骨肉瘤細(xì)胞增殖能力，阻滯細(xì)胞周期，并抑制小鼠體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)。YAP在骨肉瘤中的表達(dá)可通過轉(zhuǎn)錄后修飾來調(diào)節(jié)，研究已經(jīng)證明了多種MicroRNA通過增加YAP的表達(dá)和活性導(dǎo)致骨肉瘤的進(jìn)展，例如miR-375增加YAP的活性[18]、miR-624-5p使YAP入核增多[19]，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖，而miR-625抑制YAP的功能導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制[20]。此外，人類白細(xì)胞抗原F介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子10(human leukocyte antigen F-associated transcript 10，F(xiàn)AT10)是一種泛素樣蛋白，在骨肉瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，且與YAP表達(dá)水平存在顯著的正相關(guān)[21]。研究發(fā)現(xiàn)FAT10可通過調(diào)節(jié)泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解來穩(wěn)定YAP蛋白，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖[21]。研究表明YAP促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞系增殖的過程中，TEAD起到關(guān)鍵作用。Chai等[22]發(fā)現(xiàn)YAP/TEAD1復(fù)合物上調(diào)促增殖基因PTGS2和CYR61，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖等多種惡性表型。

3.3 影響腫瘤轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者預(yù)后不佳的一個(gè)重要原因，而YAP/TAZ可能影響轉(zhuǎn)移相關(guān)的過程。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞表型向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，可導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性降低，細(xì)胞極性消失，腫瘤細(xì)胞形態(tài)改變并獲得遷移和侵入的能力。Shen等[23]研究發(fā)現(xiàn)在兩種骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和HOS中敲減TAZ后，細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)增加，而間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、Snail表達(dá)均減少，表明敲減TAZ可抑制骨肉瘤細(xì)胞系的EMT樣轉(zhuǎn)變；而過表達(dá)TAZ可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，提示TAZ可能通過促進(jìn)EMT從而加速骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。研究還發(fā)現(xiàn)TAZ/TEAD直接激活miR-135b，可能抑制LATS1/2和GSK3β表達(dá)，介導(dǎo)EMT發(fā)生[23]。此外，細(xì)胞系中YAP的敲除抑制了骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲[6，17]，而抑制小鼠骨肉瘤模型的YAP活性后，骨肉瘤細(xì)胞的體外增殖、遷移和體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力降低[8]，提示YAP也與轉(zhuǎn)移發(fā)生相關(guān)。Luu等[24]認(rèn)為YAP和TAZ均可調(diào)節(jié)骨肉瘤的轉(zhuǎn)移特性，但TAZ對(duì)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的增殖和遷移的影響更具特異性。

3.4 調(diào)控化療耐藥性 化療耐藥性仍是骨肉瘤治療的難點(diǎn)，目前發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ與化療耐藥性密切相關(guān)。Wang等[25]報(bào)道YAP過表達(dá)時(shí)對(duì)甲氨蝶呤和阿霉素的耐藥性增加，而敲低YAP的細(xì)胞化療敏感性增加。可能的機(jī)制是，甲氨蝶呤和阿霉素促進(jìn)MST1降解和LATS2活化減少，從而抑制YAP磷酸化，促進(jìn)YAP入核，增加了骨肉瘤細(xì)胞系的化療耐藥性[25]。人抗原R(human antigen R，HuR)是一種RNA結(jié)合蛋白，可調(diào)控多種基因表達(dá)。Xu等[26]發(fā)現(xiàn)HuR可以直接與YAP結(jié)合，增加YAP轉(zhuǎn)錄活性，增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的阿霉素敏感性。Luu等[24]在三種犬類骨肉瘤細(xì)胞系中也驗(yàn)證了YAP/TAZ與化療耐藥性相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)YAP的敲低降低了所有細(xì)胞系的阿霉素耐藥性，而TAZ敲低僅降低了一種細(xì)胞系的阿霉素耐藥性，提示YAP可能骨肉瘤化療耐藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)，提示TAZ的作用較為有限。

3.5 維持腫瘤干細(xì)胞 腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)是一種特殊的高致瘤細(xì)胞亞群，具有自我更新和分化形成腫瘤能力。腫瘤干細(xì)胞可能是導(dǎo)致耐藥性、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和癌癥死亡的主要原因，而化療和靶向治療無法根除CSC[5]。YAP/TAZ在維持腫瘤干性方面具有重要作用，并且YAP/TAZ失調(diào)可導(dǎo)致非惡性干細(xì)胞重編程為具有CSC屬性的細(xì)胞[27]。在骨肉瘤中，性別決定區(qū)Y框蛋白2(SRY-box containing gene 2，Sox2)通過促進(jìn)YAP激活以維持CSC能力[28]。研究報(bào)道Sox2在骨肉瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，抑制Sox2表達(dá)后，Hippo通路激活，增加YAP的磷酸化，YAP入核減少，細(xì)胞干性降低[28]。酪氨酸激酶受體家族AXL蛋白(anexelekto，AXL)在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，并參與腫瘤發(fā)生的多個(gè)過程。研究[29]發(fā)現(xiàn)YAP/TAZ可促進(jìn)AXL表達(dá)，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞去分化，增強(qiáng)細(xì)胞干性。

4 YAP/TAZ與骨肉瘤治療

如前所述，YAP/TAZ在骨肉瘤中普遍高表達(dá)，且活化的YAP/TAZ在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面具有重要意義，因此可能作為骨肉瘤的治療靶點(diǎn)。

臨床的一些小分子抑制劑可直接或間接影響YAP/TAZ活性，且在骨肉瘤中取得了一定效果[30]。達(dá)沙替尼是一種重要的靶向Src家族激酶的小分子，被證明可抑制人和犬骨肉瘤細(xì)胞系的遷移和侵襲能力[31]。達(dá)沙替尼與標(biāo)準(zhǔn)治療方案相結(jié)合，可延長(zhǎng)骨肉瘤患者的生存時(shí)間[32]。帕唑帕尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，已被批準(zhǔn)用于治療晚期軟組織肉瘤，在19例難治性骨肉瘤患者中使用帕唑帕尼，68%的患者得到部分緩解或疾病穩(wěn)定[33]。他汀類藥物主要用于治療脂質(zhì)代謝疾病，Kany等[34]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以增加人類骨肉瘤的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。達(dá)沙替尼、他汀類藥物和帕唑帕尼等小分子藥物可誘導(dǎo)YAP/TAZ磷酸化，從而抑制YAP/TAZ核表達(dá)[30]。但這些藥物仍存在靶點(diǎn)不清楚，作用機(jī)制不明確，或全身毒副作用等問題。

維替泊芬在臨床上用于老年性黃斑變性治療。研究[35]發(fā)現(xiàn)維替泊芬是目前唯一能夠與YAP和TAZ特異性結(jié)合的化合物，通過改變其構(gòu)象，阻止YAP/TAZ與TEAD結(jié)合，抑制下游靶基因轉(zhuǎn)錄。Morice等[9]報(bào)道維替泊芬可以降低骨肉瘤細(xì)胞中YAP的表達(dá)和YAP/TEAD的轉(zhuǎn)錄活性，影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡和侵襲潛能，并抑制小鼠體內(nèi)原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)。Zucchini等[8]發(fā)現(xiàn)維替泊芬可抑制上游的含RHO關(guān)聯(lián)卷曲螺旋蛋白激酶2(recombinant RHO associated coiled protein kinase 2，ROCK2)，從而抑制YAP轉(zhuǎn)錄活性，影響骨肉瘤的進(jìn)展。上述研究表明，維替泊芬有望成為治療骨肉瘤的新藥物。

部分中藥及植物提取物也能調(diào)控Hippo信號(hào)通路[36]。Ferraiuolo等[37]發(fā)現(xiàn)龍舌蘭提取物通過抑制NF-κB募集到Y(jié)AP和TAZ啟動(dòng)子位點(diǎn)，阻止YAP和TAZ轉(zhuǎn)錄，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和耐藥性。但是，龍舌蘭提取物中抑制YAP/TAZ的具體成分需要進(jìn)一步明確，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其靶點(diǎn)特異性和抗腫瘤作用。

5 總 結(jié)

YAP/TAZ在骨肉瘤的自我更新、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要作用，這表明YAP和TAZ有希望成為骨肉瘤新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善骨肉瘤的臨床治療和預(yù)后至關(guān)重要[38]。但是，Hippo通路涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和效應(yīng)分子非常復(fù)雜，目前對(duì)于YAP/TAZ在骨肉瘤中的作用仍有待進(jìn)一步研究。