陳偉鴻，吳琪琪，黃 桔，龍文清，蔣艷平，周越菡,*

（1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 541199；2.桂林醫(yī)學(xué)院臨桂臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占原發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的50%以上，其惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)，傳統(tǒng)的手術(shù)切除、放療等治療方法均難以根治，而血腦屏障的存在同時(shí)也限制了化療藥物的應(yīng)用[1-2]。近年來，從食品中發(fā)掘具有結(jié)構(gòu)明確的、具抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的活性的物質(zhì)，并闡明其作用機(jī)制，是食品以及抗腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。

穿心蓮（Andrographis paniculata）又名一見喜、金香草等，是爵床科植物的穿心蓮的全草或葉，味苦，性寒，具清熱解毒、涼血止血、消腫止痛的功效，因其具有良好的補(bǔ)益作用，且毒性較低，在中華傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常用于治療菌痢、胃腸炎、扁桃體炎、肺炎、毒蛇咬傷等[4]。在我國以及日本、韓國、印度等國家，穿心蓮更是作為具有保肝利膽、增強(qiáng)免疫力作用的功能性保健食品[5-6]。其主要活性成分穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide，AND）具抗炎、保肝、抗病毒等作用，還對(duì)多種腫瘤具有抗增殖等作用[7]。鑒于其可通過血腦屏障并可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用的特性，可克服穿心蓮及其復(fù)方制劑的脂溶性低、分子量大的缺點(diǎn)[8]，因此，對(duì)AND 抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的機(jī)制進(jìn)行深入探索，將為從食品中挖掘具有較好療效及靶點(diǎn)明確的活性單體提供新思路[9]。

生物信息學(xué)是信息技術(shù)與生物醫(yī)藥大健康交叉融合發(fā)展的學(xué)科，在醫(yī)藥領(lǐng)域，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，可通過對(duì)海量的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的功能注釋、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是由Andrew L Hopkins 首先提出的基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，是在生物信息學(xué)方法的基礎(chǔ)上，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)分析方法研究藥物作用靶點(diǎn)的一系列方法，其應(yīng)用為現(xiàn)代中醫(yī)藥的研究提供了新的思路[11-12]。本文利用生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，初步研究AND 對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤可能作用的靶基因及相關(guān)作用通路，以神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞為研究對(duì)象，結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，研究AND 條件下U251 細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)的變化，并檢測(cè)PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，探討AND 抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞的作用機(jī)制，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的方案與思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AND 純度98%，Sigma-Aldrich 公司；高糖培養(yǎng)基DMEM Gibco 公司；胎牛血清（Fetal Bovine Calf Serum，F(xiàn)BS） 上海雙洳生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO） SIGMA 公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT） BIOFROXX；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白酶抑制劑混合液（Proease Inhibitor Cocktail（EDTA-free））、RIPI 組織細(xì)胞裂解液、BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5X）、雙抗（鏈霉素+青霉素）、胰蛋白酶（0.25%胰酶） 碧云天生物科技有限公司；30%丙烯酰胺溶液、1.5 mol/L Tris（pH8.8）、1.0 mol/L Tris（pH6.8）、10%SDS、過硫酸、TEMED 北京索萊寶科技有限公司；一抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT Rabbit mAb 美國Cell Signaling Technology 公司；一抗β-actin Rabbit mAb、二抗HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠lgG（H+L）、二抗HRP 標(biāo)記山羊抗兔lgG（H+L） 碧云天生物科技有限公司；人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 中科院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

ELx800 酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；DSY5000X 倒置顯微鏡 重慶重光實(shí)業(yè)有限公司；DH-160I 二氧化碳孵育箱 日本SANYO；5424R 低溫離心機(jī) EPPENDORF；Tanon-5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；DHP-9012 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；免疫印跡化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 中國Tanon 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與生物信息學(xué)研究

1.2.1.1 構(gòu)建AND 作用基因靶點(diǎn)庫 本文使用的數(shù)據(jù)庫名稱及網(wǎng)址如表1 所示，參考Guo 等[13]的方法，在PubChem 數(shù)據(jù)庫在compounds 板塊中以“Andrographolide”為關(guān)鍵詞檢索AND，得到AND的2D、3D 化學(xué)結(jié)構(gòu)式，保存為“SDF”格式。將AND 的3D 結(jié)構(gòu)的SDF 文件通過PharmMapper 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)AND 的作用靶點(diǎn)，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化校正。

表1 數(shù)據(jù)庫信息Table 1 Database information

1.2.1.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)靶點(diǎn)與AND 作用靶點(diǎn)的Venn 分析 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中以“glioma”作為檢索詞檢索神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用的靶點(diǎn)，將AND 作用靶點(diǎn)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶點(diǎn)通過FunRich 3.1.3 軟件得到交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.2.1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與篩選樞紐基因 參考Zhang等[14]的方法，把先前獲取到的交集靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫，選擇物種為Homo sapiens，隱藏未連接的節(jié)點(diǎn)，其余部分參數(shù)均為默認(rèn)值，得到初步的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），保存為tsv 格式。將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件中，運(yùn)用MCODE找到最有意義的模塊，利用CytoHubba 插件篩選得到10 個(gè)樞紐基因。

1.2.1.4 GO、KEGG 通路富集分析富集分析 將上述獲得的10 個(gè)樞紐基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG、GO 富集分析，繪制得到的富集分析結(jié)果的氣泡圖、柱狀圖。

1.2.1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 參考Song 等[15]的方法，將通過PubChem 下載的AND 的“SDF”格式文件，導(dǎo)入Open Babel 軟件中轉(zhuǎn)化為PDB 格式文件；通過PDB數(shù)據(jù)庫和Uniprot 數(shù)據(jù)庫得到樞紐基因的蛋白結(jié)構(gòu)，選擇“PDB”格式，將蛋白結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入PyMol 軟件中進(jìn)行去水、加氫等處理，通過Auto Dock Tools 軟件AND 與蛋白結(jié)構(gòu)的PDB 格式文件轉(zhuǎn)為“PDBQT”格式文件，并設(shè)置分子對(duì)接的對(duì)接盒子，然后通過Autodock Vina 軟件完成分子對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能，通過PyMol 軟件繪制對(duì)接結(jié)果。

1.2.1.6 GSEA 富集分析 參考Reimand 等[16]的方法，通過GEO 數(shù)據(jù)庫獲取GSE31262 樣本，對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，該樣本包括5 個(gè)正常樣本和5 個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本，準(zhǔn)備基因表達(dá)矩陣，導(dǎo)入GSEA 4.1.0 軟件，設(shè)置GSEA 分析參數(shù)，得到分析結(jié)果，根據(jù)|NES|＞1，NOMP-val＜0.05，F(xiàn)DR q-val＜0.25 進(jìn)行篩選。

1.2.1.7 表達(dá)量差異分析與Kaplan-Meier 生存曲線分析 獲得TCGA 數(shù)據(jù)庫關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的663 個(gè)樣本與正常樣本10 個(gè)，對(duì)上述獲得的10 個(gè)樞紐基因在腫瘤樣本與正常樣本中的表達(dá)情況進(jìn)行比較。參考Hu 等[17]的方法，在GEPIA 數(shù)據(jù)庫，對(duì)上述10 個(gè)樞紐基因獲得相關(guān)的Kaplan-Meier 生存曲線，根據(jù)P＜0.05 進(jìn)行篩選。

1.2.2 體外實(shí)驗(yàn)研究

1.2.2.1 MTT 法檢測(cè)AND 對(duì)U251 細(xì)胞活力的影響 參考Xu 等[18]的方法，設(shè)置分組分別為control組（即藥物濃度為0）、DMSO 組和同種藥物的不同濃度梯度給藥組，給藥組分為5 組，具體濃度分為3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，給藥組加入含不同藥物濃度的AND 的完全培養(yǎng)基，control 組加入完全培養(yǎng)基，DMSO 組加入含DMSO 的培養(yǎng)基，且溶劑組中所加的DMSO 與溶解最高藥物濃度的含量一致。U251 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至75%以上且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞通過胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，按每孔100 μL 的量接種于96 孔板中，待U251 細(xì)胞貼壁后，棄置舊培養(yǎng)基。根據(jù)不同分組進(jìn)行處理后將96 孔板置于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)至24、48、72 h后，加入濃度為5 mg/mL 的MTT 溶劑10 μL，放置培養(yǎng)箱孵育3 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，避光條件下置于搖床上以10 r/min 的速率慢搖15 min使結(jié)晶溶解，使用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力，U251 細(xì)胞活力（%）=（加藥組平均A 值/空白對(duì)照組平均A 值）×100。

1.2.2.2 倒置顯微鏡下觀察6.25 μmol/L 濃度的AND處理后U251 細(xì)胞形態(tài)變化 參考Li 等[19]的方法，待U251 細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿表面面積的75%以上且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，通過胰蛋白酶將細(xì)胞消化后調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè) /mL，按每孔2 mL 的體積接種至六孔板中，設(shè)置分組為對(duì)照組與給藥組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，待U251 細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，空白組加入完全培養(yǎng)基，給藥組加入含有AND 終濃度為6.25 μmol/L 的完全培養(yǎng)基，將六孔板置于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)至24、48、72 h 后，放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.2.3 Western bolt 法檢測(cè)AND 處理U251 細(xì) 胞PI3K/AKT 通路的影響 參考Jia 等[20]的方法，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，將U251 細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，設(shè)置空白對(duì)照組0、12.5 μmol/L 濃度的AND 組，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至75%～85%后，棄去培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，給藥組加入含有AND 終濃度為12.5 μmol/L 的完全培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱（37 ℃，含5% CO2）中培養(yǎng)48 h 后取出加裂解液（RIPI:蛋白酶抑制劑=100:1），離心，吸取上層清液，BCA 法定量，加上樣緩沖液，根據(jù)蛋白定量的結(jié)果計(jì)算上樣量。制12%膠，上樣后進(jìn)行電泳（濃縮膠：80 V，30 min；分離膠：120 V，60 min），轉(zhuǎn)膜（200 mA，80 min），轉(zhuǎn)膜結(jié)束后在牛奶液中封閉（37 ℃，120 min），封閉后TBST 中洗3 次，10 min/次，4℃孵一抗過夜。次日，用TBST 漂洗3 次，10 min/次，孵二抗120 min 后，用TBST 漂洗3 次，10 min/次，顯影。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Western blot 實(shí)驗(yàn)條帶采用Image J 軟件分析灰度值，通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)各組間的差異采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t方法檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立AND 作用靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得AND 的2D、3D 結(jié)構(gòu)式，如圖1。將PharmMapper 獲得的作用靶點(diǎn)經(jīng)Uniprot 校正后得到AND 作用靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫，包含93 個(gè)基因。

圖1 AND 的2D（左圖）、3D（右圖）結(jié)構(gòu)Fig.1 The 2D （left） and 3D （right） structures of AND

2.2 藥物-疾病交集靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫共檢索到神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)基因5086 個(gè)，將其與AND 的93 個(gè)作用靶點(diǎn)通過Funrich 軟件得到交集，制作韋恩圖，得到40 個(gè)交集靶點(diǎn)，具體靶點(diǎn)信息見圖2。

圖2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)基因與AND 作用靶點(diǎn)基因交集與交集基因名Fig.2 The intersection of glioma-associated genes with AND target genes and the name of the intersection genes

2.3 藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與篩選樞紐基因

如圖3 所示，通過STRING 數(shù)據(jù)庫得到初步的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，利用MCODE 找到其中最有意義的板塊，利用cytoHubba，根據(jù)靶基因在網(wǎng)絡(luò)中的屬性如Degrre 值，Edge Percolated component（邊過濾成分）等綜合排序進(jìn)行排名，進(jìn)而篩選出最有意義的10 個(gè)樞紐基因，分別是熱休克蛋白90α家族A 類成員1（HSP90AA1）、有絲分裂原-活化的蛋白激酶14（MAPK14）、Bcl-2 樣蛋白1（BCL2L1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（IGF1R）、Ras 同源基因家族成員A（RHOA）、熱休克蛋白90α家族B 類成員1（HSP90AB1）、聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、酪氨酸激酶受體（MET）、線粒體超氧化物歧化酶2（SOD2），該10 個(gè)樞紐基因最有可能是AND 發(fā)揮治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用時(shí)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選過程Fig.3 PPI network construction and core target screening process

2.4 GO、KEGG 富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)10 個(gè)樞紐基因進(jìn)行KEGG 富集分析和GO 富集分析，獲得樞紐基因所參與的信號(hào)通絡(luò)與生物學(xué)過程，如圖4 所示，GO 功能富集分析結(jié)果表明，在生物過程（Biological Processes，BP）上主要參與神經(jīng)元凋亡過程的調(diào)控、活性氧代謝過程、蛋白激酶B 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA 代謝過程、蛋白復(fù)合物組裝、調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、蛋白向細(xì)胞核定位；在細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）上主要參與胞質(zhì)小泡、分泌顆粒腔、軸突生長(zhǎng)等；在分子功能（Molecular Function，MF）上主要參與組蛋白脫乙酰酶結(jié)合、MHC 蛋白復(fù)合物結(jié)合、DNA 聚合酶結(jié)合、tau 蛋白結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性。KEGG富集結(jié)果顯示，按P＜0.05，共富集到111 條通路與AND 作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤有關(guān)，包括PI3K/AKT 信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路等，該結(jié)果提示AND 作用神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在通路。值得注意的是，PI3K/AKT 信號(hào)通路關(guān)聯(lián)到六個(gè)樞紐基因分別是MET、IGF1R、HSP90AB1、HSP90AA1、CDK2、BCL2L1，為KEGG 富集分析結(jié)果中與樞紐基因關(guān)聯(lián)最多的信號(hào)通路，且本身與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密不可分的關(guān)系，因此本研究側(cè)重對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路進(jìn)行深入研究。

圖4 樞紐基因GO、KEGG 功能富集分析結(jié)果Fig.4 Results of GO and KEGG functional enrichment analysis of hub genes

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

在PDB 數(shù)據(jù)庫和Uniprot 數(shù)據(jù)庫中選擇個(gè)物種選為“Home sapiens”，檢索并獲得10 個(gè)樞紐基因?qū)?yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)，以及對(duì)應(yīng)的蛋白信息，通過Autodock Vina 軟件計(jì)算10 個(gè)樞紐基因與AND 的最低結(jié)合能，見表2。受體蛋白與AND 的最低結(jié)合能（Affinity）結(jié)果均小于-5 kcal·mol-1，所需的能量越少，結(jié)合越穩(wěn)定，表明結(jié)合效果較好。SOD2、CDK2分子對(duì)接結(jié)果如圖5，結(jié)果顯示，AND 與受體蛋白周圍分子通過氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象，分子對(duì)接結(jié)果初步驗(yàn)證了基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果。

表2 樞紐基因的蛋白信息與分子對(duì)接最低結(jié)合能Table 2 Protein information of hub genes and the lowest binding energy for molecular docking

圖5 AND 與SOD2（左）、CDK2（右）分子對(duì)接結(jié)果示意圖Fig.5 Schematic diagram of molecules docking results of AND with SOD2 （left） and CDK2 （right）

2.6 GSEA 富集分析

標(biāo)準(zhǔn)化處理GSE31262 樣本，得到10 個(gè)樣本共17914 個(gè)基因表達(dá)矩陣，進(jìn)行GSEA 分析后結(jié)果如圖6 所示，其中IL6/JAK/STAT3 信號(hào)通路、PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中顯著上調(diào)，這結(jié)果與上述步驟網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中KEGG 富集分析得到的信號(hào)通路結(jié)果一致，而炎癥反應(yīng)、氧化磷酸化等生物過程在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中顯著下調(diào)，GSEA分析的結(jié)果揭示上述通路與生物過程可能是造成神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與正常神經(jīng)細(xì)胞差異的關(guān)鍵通路。

圖6 GSEA 功能富集分析結(jié)果（上調(diào)和下調(diào)前三位）Fig.6 GSEA functional enrichment analysis results （top 3 in up-regulation and down-regulation）

2.7 樞紐基因表達(dá)量差異分析與Kaplan-Meier 生存曲線分析

基于TCGA 數(shù)據(jù)庫的關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的樣本，比較正常樣本與神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本對(duì)于上述10 個(gè)樞紐基因的表達(dá)量，如圖7，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中，HSP90AA1、HSP90AB1、RHOA的表達(dá)中有極顯著升高（P＜0.01），且CDK2、MET的表達(dá)也有高度顯著差異（P＜0.001）。在圖8 中Kaplan-Meier 生存曲線顯示低表達(dá)的BCL2L1、CDK2、SOD2、MET有較高的生存率。

圖7 樞紐基因在正常組織與神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量Fig.7 Expression levels of hub genes in normal and glioma tissues

圖8 樞紐基因在樣本中的Kaplan-Meier 生存曲線Fig.8 Kaplan-Meier survival curves of hub genes

2.8 AND 各濃度對(duì)U251 細(xì)胞活力的影響

如圖9 所示，終濃度為3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L 的AND 分別處理U251 細(xì)胞24、48、72 h后，與control 組相比，隨著藥物濃度的增加與給藥時(shí)間的增加，U251 細(xì)胞活力呈現(xiàn)時(shí)間依賴性與濃度依賴性的降低（P＜0.05）。

圖9 不同濃度的AND 對(duì)U251 細(xì)胞活力的影響Fig.9 Effects of different concentrations of AND on U251 cell viability

2.9 AND 對(duì)U251 細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖10 所示，對(duì)照組細(xì)胞為正常的細(xì)胞形態(tài)，且細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞貼壁良好，而在AND 終濃度為6.25 μmol/L 時(shí)，隨著給藥時(shí)間的增加，U251 細(xì)胞逐漸出現(xiàn)細(xì)胞變圓，細(xì)胞皺縮，貼壁細(xì)胞逐漸減少，懸浮起來的細(xì)胞逐漸增多，原有細(xì)胞形態(tài)逐漸消失，可見大量細(xì)胞碎片，且活細(xì)胞的比例逐漸下降，而死亡細(xì)胞的比例逐漸升高。

圖10 6.25 μmol/L AND 作用于U251 細(xì)胞24、48、72 h 后的形態(tài)（100×）Fig.10 Morphology of U251 cells after the administration of 6.25 μmol/L AND for 24, 48 and 72 h (100×)

2.10 Western blot 檢測(cè)AND 對(duì)U251 細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

Western blot 法及灰度值分析結(jié)果如圖11、圖12所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)過12.5 μmol/L 的AND 干預(yù)48 h 后，通過灰度值分析發(fā)現(xiàn)AND 作用于U251細(xì)胞后PI3K 蛋白的表達(dá)情況，盡管無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從條帶以及灰度分析的數(shù)值可見上述蛋白的活化程度均有所下降。此外，AKT 和對(duì)細(xì)胞增殖更關(guān)鍵的蛋白p-PI3K、p-AKT 蛋白的表達(dá)水平，以及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 的比率均顯著下降（P＜0.05）。

圖11 12.5 μmol/L 的AND 作用48 h 對(duì)U251 細(xì)胞PI3K/AKT 信號(hào)通路的影響Fig.11 Effects of 12.5 μmol/L AND for 48 h on PI3K/AKT signaling pathway in U251 cells

圖12 AND 作用于U251 細(xì)胞后PI3K/AKT 信號(hào)通路Western blot 結(jié)果灰度值分析Fig.12 Grayscale analysis of PI3K/AKT signaling pathway Western blot results after the action of AND on U251 cells

3 討論

本研究以穿心蓮的主要成分AND 具有結(jié)構(gòu)明確、分子量小、脂溶性高、易通過血腦屏障等符合抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療藥物的特性為依據(jù)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)方法探索其抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤效應(yīng)及機(jī)制，結(jié)果篩選出10 個(gè)AND 作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的重要樞紐基因，分別與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)，如HSP90AA1、BCL2L1、IGF1R、HSP90AB1、CDK2、MET等。HSP90AA1可以調(diào)節(jié)多種腫瘤進(jìn)展的相關(guān)蛋白，該基因的抑制劑已成為一種抑制腫瘤進(jìn)展的新方向[21]；BCL2L1是一種重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因，BCL2L1的表達(dá)若增加可以抑制細(xì)胞凋亡，而BCL2L1的表達(dá)量若減少可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]；IGF1R可調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖與侵襲，有研究表明可通過抑制IGF1R來達(dá)到抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用[23-24]；HSP90AB1的功能是作為分子伴侶，通過與蛋白質(zhì)包括激酶、泛素連接酶和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，HSP90AB1還可促進(jìn)腫瘤的形成和癌細(xì)胞增殖[25]；CDK2可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，下調(diào)CDK2可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細(xì)胞周期停滯，阻止細(xì)胞分裂和細(xì)胞分化從而有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[26-27]；MET在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖、生存、遷移、侵襲、血管生成及治療抵抗和復(fù)發(fā)等發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]，臨床中使用的鹽酸安羅替尼可抑制MET的功能，具有抑制腫瘤血管生成與抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，MET抑制劑在腫瘤的治療中已經(jīng)廣泛被應(yīng)用[29]。

在上述基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步通過KEGG、GO通路富集分析方法對(duì)獲得樞紐基因所參與的信號(hào)通絡(luò)與生物學(xué)過程進(jìn)行預(yù)測(cè)，包括PI3K/AKT 信號(hào)通路、JAK/STAT 信號(hào)通路等，上述通路可能是AND作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵通路。GSEA 分析結(jié)果進(jìn)一步證明，相對(duì)于正常樣本，IL6/JAK/STAT3 信號(hào)通路、PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本中顯著上調(diào)。本課題組前期研究證實(shí)，AND 通過抑制JAK/STAT 信號(hào)通路的激活發(fā)揮對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，該結(jié)果與本次研究中的KEGG 通路富集分析、GSEA 富集分析結(jié)果一致，證實(shí)該結(jié)果的可靠性[30]。

在上述基礎(chǔ)上，本研究以人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞為研究對(duì)象，通過體外實(shí)驗(yàn)研究AND 治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用及其機(jī)制。首先，觀察AND 對(duì)U251 細(xì)胞活力影響的時(shí)效關(guān)系及量效關(guān)系，結(jié)果表明，AND在3.125 μmol/L 的濃度下作用48 h 即可發(fā)揮顯著抑制U251 細(xì)胞活力的效應(yīng)，此效應(yīng)具有明顯的濃度依賴性與時(shí)間依賴性。形態(tài)學(xué)方面，在終濃度為6.25 μmol/L 的AND 作用下，與對(duì)照組相比，隨著給藥時(shí)間的增長(zhǎng)，U251 細(xì)胞貼壁不牢，漂浮起來的細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞從長(zhǎng)梭形變成圓形或者橢圓形，喪失原有細(xì)胞形態(tài)，并可見大量細(xì)胞碎片，證實(shí)了AND的體外抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用。因此，本研究進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)的結(jié)果，探討上述生長(zhǎng)抑制作用的機(jī)制。

如前生物信息學(xué)研究結(jié)果顯示，磷酸肌醇3-激酶 （PI3K）-蛋白激酶 B （AKT）信號(hào)通路關(guān)聯(lián)到如前所述的六個(gè)樞紐基因MET、IGF1R、HSP90AB1、HSP90AA1、CDK2、BCL2L1，是KEGG 富集分析結(jié)果中與樞紐基因關(guān)聯(lián)最多的信號(hào)通路，也是多種癌細(xì)胞在增殖、凋亡、衰老、血管生成等方面的重要調(diào)控通路[31-32]。有研究表明，PI3K/AKT 信號(hào)通路與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)、代謝、存活、血管生成、自噬和化療耐藥等息息相關(guān)[33-34]，PI3K 磷酸化形成p-PI3K，其可將PIP2（磷脂酰肌醇4，5-二磷酸）轉(zhuǎn)化為PIP3（磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸），PIP3 可以激活并磷酸化AKT 形成p-AKT，p-AKT 通過TSC1/2（結(jié)節(jié)性硬化癥1/2 復(fù)合物）激活下游效應(yīng)分子并上調(diào)各種轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和運(yùn)動(dòng)。有研究表明，可以通過PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87 和U251 細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移等[35-37]，PI3K/AKT 信號(hào)通路在人類癌癥中經(jīng)常被活化致使細(xì)胞異常增殖，抑制該通路，尤其是抑制其磷酸化，即下調(diào)p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K，可作為腫瘤增殖抑制的重要標(biāo)志[38-39]?？紤]AND 可能作用于上述6 個(gè)樞紐基因進(jìn)而影響PI3K/AKT 信號(hào)通路來發(fā)揮對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)抑制作用，因此在機(jī)制方面，本研究側(cè)重對(duì)PI3K/AKT 信號(hào)通路進(jìn)行深入探討。Western blot 法結(jié)果顯示，12.5 μmol/L AND 作用于U251 細(xì)胞48 h 后，p-PI3K、p-AKT 蛋白的表達(dá)水平以及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 的比率均顯著下降。以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AND 可通過抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路激活抑制U251 細(xì)胞的增殖。本研究為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了初步的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)方法，預(yù)測(cè)了AND 作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的40 個(gè)靶點(diǎn)，然后從中篩選出10 個(gè)與AND 有較強(qiáng)結(jié)合活性的樞紐基因，并預(yù)測(cè)上述基因參與神經(jīng)元凋亡過程的調(diào)控、活性氧代謝等生物過程，且與PI3K/AKT 等信號(hào)通路有關(guān)。此外，PI3K/AKT/mTOR 等信號(hào)通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中顯著上調(diào)。樞紐基因中HSP90AA1、HSP90AB1、RHOA、CDK2、MET在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本與正常樣本間存在顯著差異，低表達(dá)的樞紐基因BCL2L1、CDK2、SOD2、MET在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中有較高的生存率。體外研究證實(shí)，AND 通過調(diào)控PI3K/AKT 通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-AKT、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)U251 細(xì)胞的顯著生長(zhǎng)抑制作用。本文為AND 用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了初步的理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。