顧璐萍，張 鈺，李俊華，常翠華，楊嚴俊，蘇宇杰,*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室（江南大學），江蘇 無錫 214122；2.國家功能食品工程技術研究中心（江南大學），江蘇 無錫 214122；3.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

中國每年產(chǎn)生約400 萬噸蛋殼，目前主要作為廢棄物處理，造成環(huán)境污染及巨大的資源浪費。蛋殼膜是緊貼蛋殼內(nèi)壁的一層薄膜，含有豐富的蛋白質(zhì)、黏多糖等成分，具有很高的營養(yǎng)價值[1-2]。其中蛋白質(zhì)以角蛋白為主，還含有膠原蛋白、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白等，種類豐富[3]；黏多糖主要為透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素兩種[4]，透明質(zhì)酸被譽為最理想的天然保濕因子，具有極好的保濕作用，可抗皮膚衰老和皺紋的生成[5]；硫酸軟骨素具有調(diào)節(jié)代謝、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生理功能，如今已被用于風濕病、腎炎、消化性潰瘍等疾病的臨床醫(yī)治[6-8]。

盡管蛋殼膜具有很高的營養(yǎng)價值，但由于其主要成分為角蛋白，其分子中含有大量的二硫鍵，導致蛋殼膜的水溶性極差，僅為5%左右，限制其在食品中的應用[9]。有文獻報道，可采用酶解工藝來提高蛋殼膜的水溶性，在酶的作用下蛋殼膜蛋白分子鏈被切成分子量較小的肽段，與環(huán)境溶液中的水分子間作用力增強，水溶性增加[10]。與蛋白質(zhì)大分子相比，低分子量的生物活性肽在進入人體后更容易被吸收，且具有許多重要的生理活性，如抗氧化性、抗炎性、抗菌活性等[11-12]。但由于蛋殼膜水溶性差，與酶作用的活性位點少，導致酶解反應耗時長、效率低。許多研究者有研究報道，可對蛋殼膜進行預處理以提高酶解效率，如使用強堿、有機試劑等，但這些預處理方法會給產(chǎn)品分離純化及廢水處理帶來負擔且存在安全隱患[13-14]。目前蛋殼膜多肽產(chǎn)品主要采用強堿結(jié)合酶解工藝制備，但該產(chǎn)品風味不好，消費者接受度低。

擠壓膨化是在短時高溫高壓和強剪切力的條件下作用于物料，使其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變[15]，可用于各種蛋白質(zhì)、多糖提取及酶法制備大豆多肽的前處理步驟[16]。但擠壓膨化工藝用于殼膜多肽的制備尚未見報道。

鑒于此，本文以蛋殼膜粉為原料，采用擠壓膨化協(xié)同酶解工藝制備殼膜多肽，考察工藝條件對D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響，并對蛋殼膜多肽的體外和細胞抗氧化性、分子量分布情況及氨基酸組成進行分析，以期為蛋殼膜多肽的開發(fā)與應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋殼膜粉 黑龍江興和生物科技有限公司；堿性蛋白酶（酶活力2×105U/g） 安琪酵母生物科技有限公司；還原性谷胱甘肽 國藥集團化學試劑有限公司；ABTS 標準品、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、2,2’-偶氮（2-甲基丙基脒）（AAPH）、菲咯嗪 SIGMA 公司；其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

FMHE 36-24 雙螺桿擠壓機 湖南富馬科食品工程技術有限公司；K 9840 凱氏定氮分析儀 海能儀器公司；Scientz-10 ND 冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；UH 5300 紫外-可見分光光度計 天美科學儀器有限公司；Waters 600 高效液相色譜 美國Waters 公司；Lapscale 研發(fā)型切向流超濾系統(tǒng) 美國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋殼膜多肽的制備

1.2.1.1 擠壓膨化工藝優(yōu)化 取適量蛋殼膜粉進行擠壓膨化預處理，具體工藝參數(shù)為螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min，水分含量20%，溫度140 ℃。擠壓膨化處理后，樣品粉碎過100 目篩，取3 g 樣品與碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH10）混合，固液比為1:10 g/mL，振蕩3 h 后離心（6500 r/min，20 min，4 ℃），取上清，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，測定濾液中D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率。在此條件基礎上，依次改變溫度、螺桿轉(zhuǎn)速和水分含量，對預處理條件進行優(yōu)化。所選具體參數(shù)為溫度：120、140、160 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速：80、100、120 r/min，水分含量：10%、20%、30%。以未經(jīng)過擠壓膨化處理的蛋殼膜粉作為對照組。

1.2.1.2 酶解工藝優(yōu)化 預處理結(jié)束后，用3 mol/L HCl 將pH 調(diào)節(jié)至10.0，加入10000 U/g 堿性蛋白酶在55 ℃下反應6 h。酶解后，90 ℃下加熱2 min 滅酶，6000 r/min 離心20 min，硅藻土過濾后再經(jīng)0.45 μm濾膜微濾后，測定D-葡萄糖醛酸提取量、總氮回收率和抗氧化活性，最后進行冷凍干燥（-50 ℃，12 h）得到蛋殼膜多肽。在此條件基礎上，依次改變時間、加酶量和溫度，對酶解條件進行優(yōu)化。所選具體參數(shù)為時間：2、4、6、8、10 h，加酶量：6000、8000、10000、12000、14000、16000 U/g，溫度：45、50、55、60、65、70 ℃。

1.2.2 D-葡萄糖醛酸提取量的測定 蛋殼膜水解液中D-葡萄糖醛酸提取量可用于衡量蛋殼膜中活性多糖的提取能力。透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素均由固定比例的D-葡萄糖醛酸組成，D-葡萄糖醛酸分子質(zhì)量在透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素中分別占51%和42%，因此可用D-葡萄糖醛酸含量間接表示透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素的含量[17]。D-葡萄糖醛酸提取量的測定參照QB/T 4576-2013 透明質(zhì)酸鈉 咔唑-硫酸法。

1.2.3 總氮回收率的測定 總氮回收率是指蛋殼膜水解液中總氮含量占蛋殼膜粉總氮含量的比例，可用于衡量蛋殼膜中可溶性蛋白及多肽提取能力。蛋殼膜粉的蛋白質(zhì)含量高達78.86%，占干重的88.88%?？偟康臏y定參照GB 5009.5-2016 食品中蛋白質(zhì)測定凱氏定氮法。

1.2.4 體外抗氧化活性的測定

1.2.4.1 ABTS 自由基清除率的測定 參照Jun 等[18]的方法并加以修改。ABTS 工作液是由88 μL 過硫酸鉀（2.6 mmol/L）和5 mL ABTS 儲備液（7.4 mmol/L）混合，避光靜置12～16 h，在使用前用5 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）稀釋至0.70±0.02。將樣品分散在去離子水中至濃度為（0.1 mg/mL），取0.5 mL樣品溶液與3 mL ABTS 稀釋液混合，混勻10 s 后室溫避光靜置6 min 于734 nm 處測吸光度。ABTS 自由基清除率的計算公式如式（1）所示，以去離子水作為對照組。

式中：A對照為對照組的吸光值；A樣品為樣品組的吸光度值。

1.2.4.2 OH 自由基清除率 參照Li 等[19]的方法并加以修改。樣品組試管中依次加入1 mL PBS 緩沖液（pH7.4，0.2 mol/L）、1 mL 2.5 mmol/L 鄰菲咯啉溶液、1 mL 樣品溶液（5 mg/mL）、1 mL 2.5 mmol/L FeSO4充分混合后，加入0.5 mL 20 mmol/L H2O2溶液混勻，37 ℃保溫60 min 后于536 nm 處測吸光度。空白組中用去離子水代替樣品溶液，對照組中用去離子水代替樣品及H2O2溶液。OH 自由基清除率的計算公式如式（2）所示：

式中：A樣品為樣品組的吸光度值；A空白為空白組的吸光度值；A對照為對照組的吸光度值。

1.2.4.3 Fe2+螯合能力 參照Zhu 等[20]的方法并加以修改。樣品組為1 mL 樣品（0.4 mg/mL）與0.05 mL 2 mmol/L FeCl2、1.85 mL 去離子水、0.1 mL 5 mmol/L菲咯嗪溶液混勻，室溫靜置10 min 后于562 nm 處測吸光度，對照組為用去離子水代替樣品。Fe2+螯合能力的計算公式如式（3）所示：

式中：A對照為對照組的吸光度值；A樣品為樣品組的吸光度值。

1.2.5 細胞抗氧化活性的測定 參照張晶等[21]的方法，采用CAA 方法評估殼膜多肽的細胞內(nèi)抗氧化活性。具體操作如下：取對數(shù)生長期HepG2 細胞按照104個/孔的密度接種至96 孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，移除培養(yǎng)基，加入100 μL 樣品溶液（含25 μmol/L DCFH-DA），樣品濃度為1、2.5、5、10 μg/mL，每組6 個平行。培養(yǎng)1 h 后，吸棄溶液，每孔加入100 μL AAPH 溶液（600 μmol/L），立即置于酶標儀中讀數(shù)，每5 min 測定一次。激發(fā)波長為538 nm，發(fā)射波長為485 nm，僅加入培養(yǎng)基作為對照組。CAA 計算公式如式（4）所示：

式中：∫ CA為 對照組的曲線下積分面積；∫ SA為樣品組的曲線下積分面積。

1.2.6 分子量分布分析 色譜條件如下：Waters 600高效液相色譜儀（配2487 紫外檢測器和M32 工作站）；色譜柱：TSKgelG 2000 SW×L300 mm×7.8 mm。流動相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V）；檢測波長：UV 220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。樣品制備：吸取樣品0.02 g 于100 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，用微孔過濾膜過濾后進樣。相對分子量校正曲線所用標準品：細胞色素C（12500）、抑菌肽（6500）、桿菌肽（1450）、Gly-Gly-Arg-Tyr（451）、Gly-Gly-Gly（189）。

1.2.7 氨基酸組成分析 將0.1 g 樣品加入水解管中，加入8 mL 6 mol/L HCl 溶液，在氮氣保護下酒精噴燈上封口。110 ℃下反應24 h 后，將冷卻的水解液過濾，再用0.02 mol/L HCl 溶液溶解，然后用去離子水定容至50 mL，收集上清液0.22 μm 過濾，采用氨基酸分析儀進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)至少采用3 個平行，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。采用Prism 8 和SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖，多重比較之間的差異采用單因素方差分析和Duncan 檢驗進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 擠壓膨化工藝的確定

本文采用擠壓膨化作為制備殼膜多肽的前處理步驟，目的是促進更多的蛋白質(zhì)溶出，以利于后續(xù)的酶解工藝，從而獲得殼膜多肽。由于黏多糖不是以游離狀態(tài)存在于蛋殼膜中，而是與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成糖蛋白，在蛋白質(zhì)溶出時，黏多糖也同時釋放出來。因此，本文以總氮回收率和D-葡萄糖醛酸提取量為指標，確定擠壓膨化的最佳工藝。如圖1a 所示，擠壓膨化處理可以顯著提高總氮回收率和D-葡萄糖醛酸提取量（P＜0.05）。且總氮回收率隨溫度提高逐漸增加，超過140 ℃后增加不顯著（P＞0.05），D-葡萄糖醛酸提取量先逐漸提高，140 ℃時達到峰值，隨后又迅速降低。主要原因是高溫可以使蛋殼膜中的角蛋白分子間或分子內(nèi)二硫鍵斷裂，從而提高蛋白的溶解性，并且釋放出更多的黏多糖。但溫度過高會破壞組織結(jié)構(gòu)，使物料在套筒內(nèi)焦糊并硬化，造成黏多糖提取量降低[22]。

由圖1b 可知，螺桿轉(zhuǎn)速提高使D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率逐漸增加并趨于平穩(wěn)。隨著螺桿轉(zhuǎn)速的增加，物料在套筒內(nèi)受到更大的擠壓和剪切作用，加速角蛋白中二硫鍵的斷裂，使蛋白和黏多糖溶出。當轉(zhuǎn)速持續(xù)增加時，物料在套筒中滯留時間短，反應不充分，造成提取量提高不顯著（P＞0.05）[23]，故選擇螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min。

圖1 擠壓膨化對蛋殼膜中D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響Fig.1 Effects of extruding expansion on D-glucuronic acid extraction amount and total nitrogen recovery

從圖1c 可以看出，隨著物料含水量的增加，葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率在含水量為20%時達到最大值；水分含量增加至30%時，葡萄糖醛酸提取量無顯著變化（P＞0.05），而總氮回收率反而下降。這可能是因為當含水量過低時，物料在機器中易發(fā)生堵塞而無法順利通過膜孔[24]。適當?shù)暮靠梢允刮锪鲜杷刹⑿纬闪黧w狀態(tài)，順利通過膜孔。而含水量過高時，物料在套筒內(nèi)流動性加快，造成剪切力降低，擠壓不充分，總氮回收率下降[25]。

綜上所述，擠壓膨化的最佳工藝為溫度140 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min，水分含量20%，此時D-葡萄糖醛酸提取量為3.34 mg/g，總氮回收率為6.25%。

2.2 酶解工藝的確定

2.2.1 不同酶解時間對蛋殼膜酶解效果的影響 如圖2 所示，在酶解初期，D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率逐漸增加，直到6 h 后達到平衡，總氮回收率無顯著變化（P＞0.05），D-葡萄糖醛酸提取量緩慢下降。此變化趨勢與朱文婷等[26]的研究結(jié)果一致，當超過某個酶解時間后，透明質(zhì)酸被破壞降解，得率降低。這可能是因為透明質(zhì)酸長時間處于堿性環(huán)境下容易被分解[4]。因此，酶解時間為6～8 h 時，蛋殼膜的酶解效果較好。

圖2 酶解時間對D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis time on D-glucuronic acid extraction amount and total nitrogen recovery

一般來說，多肽的生物活性取決于多肽的氨基酸組成和序列[27]。從圖3 可以看出，隨著水解時間的延長，蛋殼膜多肽的OH 自由基清除率逐漸增強，在6 h 時達到最大值。這歸因于蛋白質(zhì)在酶解過程中會釋放出具有抗氧化活性的序列及氨基酸殘基[28]。而ABTS 自由基清除率和鐵螯合率能力呈現(xiàn)不同的趨勢，在酶解2～6 h 時無明顯變化，但隨著酶解時間的延長，抗氧化能力反而下降，這可能是因為每種體外抗氧化性的反應機制不一樣，呈現(xiàn)出不同的結(jié)果[29]。綜合考慮，選擇酶解時間為6 h。

2.2.2 不同加酶量對蛋殼膜酶解效果的影響 如圖4 所示，當加酶量從6000 到14000 U/g 時，D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率均迅速增加，到14000 U/g后不再增加。這是因為在一定范圍內(nèi)，提高加酶量可以增加酶與底物的碰撞幾率，加快酶解速率。但當?shù)孜镆淹耆幌?，過量的酶并不能持續(xù)加速催化反應[30]。

圖4 加酶量對D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響Fig.4 Effects of the amount of enzyme on D-glucuronic acid extraction amount and total nitrogen recovery

如圖5 所示，蛋殼膜多肽的抗氧化活性隨著加酶量提高逐漸增加，當超過12000 U/g 時，顯著下降（P＜0.05）。這是因為較高的加酶量使蛋殼膜過度酶解成活性不高的小肽或氨基酸[31]。因此，選擇加酶量為12000 U/g。

圖5 加酶量對抗氧化活性的影響Fig.5 Effects of enzyme amount on antioxidant activity

2.2.3 不同溫度對蛋殼膜酶解效果的影響 溫度會影響酶分子的催化效率，由圖6 可知，45～55 ℃時，D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率呈上升趨勢，在55～60 ℃時達到最高值，隨后顯著降低（P＜0.05）。這是因為適當?shù)纳郎赜兄谔岣呙傅拇呋?；而進一步升高溫度反而會導致酶發(fā)生變性，造成催化效率下降[32]。

圖6 溫度對D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響Fig.6 Effects of temperature on D-glucuronic acid extraction amount and total nitrogen recovery

如圖7 所示，蛋殼膜多肽的抗氧化活性隨著溫度升高不斷提高，但55～60 ℃變化不顯著（P＞0.05），超過60 ℃后顯著下降（P＜0.05）。這可能是由于隨著溫度升高，一方面酶的催化能力提高，另一方面反應體系能量增加，從而增加單位時間內(nèi)有效碰撞次數(shù)，促使酶反應加速進行。但溫度繼續(xù)升高，超過一定限度時，蛋白酶則會變性失去催化活性，造成酶反應速度降低[33]。綜合考慮，選擇酶解溫度為55 ℃。

圖7 溫度對抗氧化活性的影響Fig.7 Effects of temperature on antioxidant activity

綜上所述，酶解的最佳工藝為時間6 h，加酶量12000 U/g，溫度55 ℃，此時D-葡萄糖醛酸提取量達12.4±0.2 mg/g，總氮回收率達60.8%±0.7%，殼膜多肽的ABTS 自由基清除率為29.46%±0.27%，OH自由基清除率為26.58%±2.56%，F(xiàn)e2+螯合能力為50.25%±0.43%。

2.3 細胞抗氧化活性分析

采用最佳擠壓膨化協(xié)同酶解工藝制備殼膜多肽，并進一步對其細胞抗氧化活性進行分析。谷胱甘肽是公認的具有較強抗氧化性的物質(zhì)，因此常作為抗氧化性評價對照組[21]。由圖8 可知，殼膜多肽的細胞抗氧化性隨著濃度增加而增強，與對照組谷胱甘肽相比，殼膜多肽的抗氧化性略低。當殼膜多肽的濃度為10 μg/mL 時，細胞抗氧化性達65%，說明產(chǎn)物具有良好的細胞抗氧化性。

圖8 殼膜多肽的細胞抗氧化活性Fig.8 Cellular antioxidant activity of eggshell membrane peptides

2.4 分子量分布情況分析

本文采用高效液相色譜對殼膜多肽進行分析，通過出峰面積積分計算可獲得其分子量分布情況（圖9）。結(jié)果顯示，蛋殼膜多肽分子量主要分布在252～2435 Da，占總量81.8%，252 Da 以下的游離氨基酸占7.0%，在2435 Da 以上的肽鏈占11.2%。結(jié)果表明，殼膜多肽以低聚肽為主。

圖9 蛋殼膜多肽分子量分布的高效液相色譜圖Fig.9 High performance liquid chromatography of molecular weight distribution of eggshell membrane peptides

2.5 氨基酸組成分析

表1 顯示了蛋殼膜多肽的氨基酸組成，Asp 和Glu 的總含量占27.93 g/100 g 蛋白。大量研究表明，某些氨基酸殘基與抗氧化活性具有良好的相關性，如Chen 等[34]研究發(fā)現(xiàn)具有疏水性氨基酸的肽可以提高抗氧化活性。本文制備的蛋殼膜多肽中含有較多的疏水性氨基酸，含量為44.70 g/100 g 蛋白，這可能與其具有良好的抗氧化活性有關。

表1 蛋殼膜多肽的氨基酸分析Table 1 Amino acid analysis of eggshell membrane polypeptide

3 結(jié)論

本文探究了擠壓膨化協(xié)同酶解工藝制備殼膜多肽的最佳參數(shù)為：擠壓膨化溫度140 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min，水分含量20%，酶解時間6 h，加酶量12000 U/g，溫度55 ℃。在該工藝條件下，D-葡萄糖醛酸提取量為12.4 mg/g，總氮回收率為60.8%，產(chǎn)物具有較高的體外和細胞抗氧化活性。相對分子質(zhì)量分布結(jié)果表明殼膜多肽中主要成分為低聚肽（252～2435 Da），占總量81.8%。氨基酸組成分析結(jié)果表明殼膜肽富含Asp 和Glu，且與抗氧化活性有關的氨基酸含量為44.70 g/100 g 蛋白。因此，本文制備的殼膜多肽有潛力作為天然抗氧化劑應用到食品、化妝品、保健品等領域。