羅干，倪吉祥，徐彪，談華棟

三峽大學人民醫(yī)院 宜昌市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，湖北宜昌443000

肺纖維化是一種進行性發(fā)展且致命的疾病，受遺傳、環(huán)境、衰老表觀遺傳變化相互作用影響，導致肺泡上皮細胞（AEC）損傷，從而引發(fā)AEC 異?；罨；罨纳掀ぜ毎置诖罅考毎蜃?，如轉化生長因子β（TGF-β），從而促進成纖維細胞遷移和增殖，并使成纖維細胞分化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞分泌大量細胞膠原蛋白，從而導致膠原蛋白進一步沉積。在損傷修復階段，激活細胞凋亡途徑和巨噬細胞的吞噬作用，可恢復內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在肺纖維化中存在一種嚴密調控的非凋亡性但具有壞死形態(tài)特征的新細胞死亡方式，此過程被稱為調節(jié)性細胞壞死。調節(jié)性細胞壞死包括細胞程序性壞死、細胞焦亡、細胞鐵死亡等?，F將幾種常見的調節(jié)性壞死方式涉及的信號通路及其在肺纖維化中的作用機制綜述如下。

1 細胞程序性壞死與肺纖維化的關系

1.1 細胞程序性壞死 細胞程序性壞死是一種受死亡受體以及Toll樣受體的配體和某些病原體調控的促炎癥性反應，但不依賴半胱氨酸天冬氨酸壞死細胞的死亡形式。這種細胞死亡過程依賴于受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶1（RIPK1），并且可被程序性壞死抑制素-1（nec-1）抑制［1］。隨著研究深入，程序性壞死被定義為由RIPK1、絲氨酸/蘇氨酸激酶3（RIPK3）、混合譜系激酶結構域樣蛋白（MLKL）三者相互介導，如在小鼠巨細胞病毒感染、一氧化氮誘導的胰腺β細胞死亡和成纖維細胞死亡中發(fā)現混合譜系激酶結構域樣假激酶（MLKL）作為細胞程序性壞死的效應器，進一步增強了這一效應表達［2-3］。最具有特征性的程序性壞死形式由腫瘤壞死因子α（TNF-α）引發(fā)，也可由TNF-α死亡配體家族的其他成員引發(fā)，如死亡因子配體和TNF 相關凋亡誘導配體以及干擾素、Toll 受體信號和通過Z 型DNA 結合蛋白1 的病毒感染誘導［4］。在典型的壞死途徑中，TNF-α 與其受體腫瘤壞死因子1 型受體（TNFR1）結合并將其激活，促進TNF 受體相關死亡域結合蛋白的募集（TRADD）。TRADD 通過其細胞內DD 結構域與TNFR1 的細胞內死亡結構域結合，并招募TNF 受體相關因子蛋白、細胞凋亡抑制劑蛋白、線性泛素組裝復合物、RIPK1、血紅素氧化IRP2泛素連接酶1L（HOIL-1L）、HOIL-1L 相互作用蛋白，共同形成TNFR復合物Ⅰ并誘導核因子-κB（NF-κB）信號傳導［5］。圓柱瘤蛋白是一種導致TNFR 復合物Ⅰ失去穩(wěn)態(tài)的去泛素化酶，可導致TNFR復合物Ⅰ與胞漿中的受體分離，并通過形成兩種類型的TNFR復合物Ⅱ促進細胞死亡。雖然信號傳導在凋亡和程序性壞死之間相互作用，但最終信號傳導依賴于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶8（Caspase-8）。當TNFR復合物Ⅱa形成時，死亡因子相關死亡域和Caspase-8被組裝以誘導細胞發(fā)生凋亡。相反，當TNFR 復合物Ⅱa 中的Caspase-8 激活受損時，TNFR 復合物Ⅱb（即壞死小體）形成，RIPK1 通過RIPK3 募集和激活啟動程序性壞死［6］。參與RIPK3 激活的信號通路涉及RIP 同型相互作用基序（RHIM）域的受體、適配器和激酶的同型相互作用。RIPK1 和RIPK3 的RHIM結構域啟動細胞程序性壞死，介導壞死小體的淀粉樣信號復合物形成，這一過程由熱休克蛋90 和細胞分裂周期37輔助完成［7］。一旦壞死小體形成，RIPK3磷酸化，導致MLKL自身磷酸化寡聚并轉移到細胞膜上，形成質膜孔，使細胞破裂及細胞膜通透性增強，細胞內物質釋放，形成損傷相關分子模式（DAMP），經典DAMP包括熱休克蛋白（HSP）、促進炎癥的高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、S100蛋白家族［5，8］。

1.2 細胞程序性壞死在肺纖維化中的作用 肺纖維化的病理特征為AEC 損傷，導致傷口愈合失調，促炎性應激反應，從而導致肌成纖維細胞分化和肺間質中異常的膠原沉積。過去認為上皮細胞凋亡是肺纖維化發(fā)病機制中調節(jié)性壞死的主要形式。然而有關研究在TUNEL分析中檢測到肺泡上皮細胞存在非凋亡DNA片段，表明TUNEL陽性細胞不僅包括凋亡細胞，還包括壞死細胞。損傷后的上皮細胞向細胞外空間釋放趨化因子和DAMP、熱休克蛋白和白細胞介素［9］。DAMP 可以激活鄰近上皮細胞和免疫細胞上的模式識別受體，直接刺激促纖維化細胞因子釋放，進而參與成纖維細胞激活。上皮細胞還分泌促炎性細胞因子，這些細胞因子相互聚集并激活適應性免疫細胞（T淋巴細胞、B淋巴細胞），進一步分泌促纖維化因子（IL-33、IL-4、IL-5、IL-13）。據報道，體外受損上皮細胞釋放的HMGB1 導致IL-1β 水平上調，進而激活TGF-β1，促進AEC間質轉化［10］。LI等［11］證明HMGB1可以通過激活TGF-β1/Smad2信號通路介導氣道上皮細胞的上皮間質轉化（EMT）。WANG等［12］隨后證明，HMGB1誘導的TGF-β1釋放先于肺成纖維細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ⅰ型膠原蛋白（COL1）表達上調。總之，以上研究表明，受損上皮細胞釋放的HMGB1可能通過持續(xù)上調TGF-β1，導致成纖維細胞活化、分化和膠原蛋白沉積，從而促進纖維化的發(fā)展。尤其是在AEC 中，觀察到RIPK3 和磷酸化的MLKL 在內的壞死性標志物表達顯著高于健康對照組［13］。同樣觀察到，在博來霉素（BLM）誘導小鼠的AEC 中RIPK3、磷酸化的MLKL 表達上調，并釋放HMGB1 和IL-1β；且在RIPK3 基因敲除小鼠模型中得以證實，在BLM 誘導下，細胞炎癥化和纖維化的表達均減弱［11，13］。這表明細胞程序性壞死有助于纖維化的發(fā)展，且能被nec-1有效抑制。表明細胞程序性壞死釋放的DAMP通過調節(jié)炎癥和肌成纖維細胞的積聚，對肺纖維化的發(fā)病機制進行調控。

2 細胞焦亡與肺纖維化的關系

2.1 細胞焦亡 細胞焦亡是調節(jié)性細胞壞死一種新的途徑，一種不同于細胞凋亡的死亡方式，發(fā)生在實質及非實質細胞間，涉及細胞腫脹破裂、滲透溶解和細胞內容物（IL-1β、IL-18、HMGB1）的釋放，且伴有細胞器變形、DNA 斷裂和核濃縮，從而導致炎癥反應［14］。細胞焦亡最初被認為只是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（Caspase-1）介導的細胞死亡。隨著研究的深入，發(fā)現Caspase-3、4、5、8 和11 也能介導細胞焦亡［15］。經典的細胞焦亡信號調節(jié)，通過模式識別受體和炎癥小體蛋白復合物介導微生物產物激活Caspase-1。最具廣泛特征性炎癥小體家族是NLRP3 炎癥小體的NOD 樣受體結構域，由NLRP3、NLR 家族的細胞溶質傳感器、銜接分子凋亡相關斑點樣蛋白和激活的Caspase-1 組成。炎癥小體的組裝始于細胞溶質模式識別受體（包括炎癥小體傳感器），能夠識別DAMP 和危險相關分子模式，后者是細胞應激的次級產物［16］。炎癥小體的激活需要兩步激活和啟動信號。啟動信號由TLR 配體或干擾素信號介導，并通過活化NF-κB 誘導某些炎癥小體成分的轉錄。炎癥小體組裝后，Caspase-1 被激活，并水解成2 個片段，形成一個二聚體。一方面，Caspase-1在Asp275位點切割堿性執(zhí)行蛋白GSDMD，形成C 末端（GSDMD-C）和N 末端（GSDMD-N）。GSDMD-N 能穿透細胞膜，形成內徑10～14 nm 的非選擇性孔，導致細胞腫脹［17］。另一方面，Caspase-1 分解促炎細胞因子IL-1β、IL-18 的前體，這些前體通過GSDMD 形成的孔釋放來增加細胞膜通透性，包括IL-1β、IL-18 在內的細胞質內容物滲出，進一步觸發(fā)細胞焦亡［18］。非經典途徑由Caspase-4、-5、-11介導，其中Caspase-4、-5 存在于人類中，Caspase-11 存在于小鼠中。該途徑由脂多糖（LPS）直接激活，激活后的Caspase-4、-5、-11誘導細胞溶質蛋白GSDMD分裂為GSDMD-N 和GSDMD-C。N 末端片段在細胞膜內寡聚形成熱解孔，導致細胞的通透性屏障破壞，K+外流，誘導NLRP3 炎性小體組裝，最終導致細胞焦亡［19］。但研究發(fā)現，細胞膜半通道蛋白（Pannexin-1）是另一個關鍵蛋白，在Caspase-11 誘導的非經典途徑中介導細胞焦亡。在LPS 刺激下，激活的Caspase-11 可以特異性剪切和修飾Pannexin-1，導致細胞釋放ATP，從而誘導通過離子通道P2X7受體介導的細胞死亡［20］。

2.2 細胞焦亡在肺纖維化中的作用 有研究表明，在矽肺、肺纖維化引起的肺損傷中，Caspase-1、NLRP3、IL-1β、IL-18 和GSDM 家族蛋白都與患者的纖維化發(fā)展呈正相關［21］。TGF-β是一種主要的促纖維化細胞因子，Caspase-1、NLRP3 和NF-κB 已被確定為TGF-β/SMAD 軸的重要上游激活劑［22］。由于細胞焦亡是纖維化的關鍵部分，因此對抗細胞焦亡可以作為抗纖維化治療的新靶點。HUSSAIN 等［23］將原代人支氣管上皮樣細胞（HBE 細胞）充分暴露于多壁碳納米管中，后將人胚肺成纖維細胞（MRC-5）以多壁碳納米管時間-劑量方式培養(yǎng)于HBE 細胞稀釋后的培養(yǎng)基中。經過一段時間處理后，促纖維化標志物的mRNA 表達顯著增加，但TGF-β 表達并無變化。但當條件培養(yǎng)基中添加IL-1β、IL-11 中和抗體或使用NLRP3 小干擾RNA 轉染HBE 細胞的條件培養(yǎng)基后，促纖維化標志物表達顯著降低。這說明上皮細胞中NLRP3 炎性小體激活是MRC-5 細胞促纖維化基因表達的關鍵介質。另外，LIANG 等［24］通過觀察石蒜堿（LYC）對BLM 誘導的肺纖維化小鼠模型和NLRP3炎癥小體激活，發(fā)現LYC在BLM誘導的小鼠急性肺損傷期間能抑制活性Caspase-1 表達和乳酸脫氫酶釋放。并且體外試驗表明，LYC 抑制LPS/ATP 誘導的NLRP3 炎癥小體激活及骨髓源性巨噬細胞焦亡。LYC 可通過靶向pyrin 結構域（PYD）來干擾NLRP3與凋亡相關微粒蛋白（ASC）的相互作用。結果表明，LYC 的保護作用依賴于通過靶向ASC 的PYD 結構域來抑制NLRP3 炎癥小體激活和細胞焦亡，從而改善BLM 誘導的肺纖維化。LI等［25］研究表明，二氧化硅持續(xù)激活NLRP3 炎癥小體，并且IL-1β 和IL-18 的細胞外表達水平持續(xù)升高。并通過短發(fā)夾RNA介導NLRP3表達下調，抑制了細胞焦亡。使用NLRP3選擇性抑制劑MCC950和Caspase-1 抑制劑Z-YVAD-FMK 能降低二氧化硅誘導的炎癥細胞數量及α-SMA 的表達。并通過分析表明，TKA1-MAPK/NF-κB 通路參與了NLRP3 炎癥小體介導的EMT。上述研究表明，通過下調NLRP3表達，抑制NLRP3 炎癥小體本身的激活及其效應物均可以緩解二氧化硅誘導的EMT。提示NLRP3 炎癥小體通過IL-1β-TAK1 MAPK/NF-κB 途徑調節(jié)二氧化硅誘導的EMT，從而誘導肺纖維化。因此，細胞焦亡是一種以炎癥為特征的免疫調節(jié)反應，調節(jié)肌成纖維細胞的激活，導致細胞外基質及膠原蛋白沉積，從而導致肺纖維化。NLRP3 炎癥小體參與了肺纖維化發(fā)展過程，干預NLRP3 炎癥小體可改善肺纖維化發(fā)展，所以NLRP3 炎癥小體未來有可能成為肺纖維化治療的新靶點。

3 細胞鐵死亡與肺纖維化的關系

3.1 細胞鐵死亡 DIXON 等［26］首次將細胞鐵死亡描述為一種新的調節(jié)性細胞壞死，細胞鐵死亡的激活受脂質修復酶的潛在調節(jié)，脂質修復酶包括谷胱甘肽（GSH）和GSH 過氧化物酶4（GPX4）。細胞鐵死亡由鐵依賴性活性氧（ROS）和脂質過氧化物的過度聚集引起，其特征是線粒體膜密度增加和細胞體積縮小，線粒體嵴在形態(tài)學上不同于凋亡和壞死［27］。胱氨酸-谷氨酸反向轉運體（System Xc-）調控途徑系統，由催化亞單位溶質載體家族7 成員11（SLC7A11）和調節(jié)亞單位溶質載體家族3 成員2（SLC3A2）組成，該轉運體是一種促進胱氨酸進入細胞的胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白，在調節(jié)細胞鐵死亡中起重要作用。System Xc-介導細胞內胱氨酸和細胞外谷氨酸的交換，比例為1∶1。細胞內的胱氨酸可以轉化為半胱氨酸，半胱氨酸是合成GSH 的限速底物。GSH 對細胞抗氧化防御系統很重要，可以直接與ROS/氮物種、親電體相互作用，也可以作為各種抗氧化酶的輔助因子［27-28］。研究表明，GSH 在控制細胞鐵死亡中所起的關鍵作用歸因于GPX4 輔助因子的功能。GPX4 通過抑制細胞膜的過氧化作用保護細胞免受鐵死亡的影響。細胞內游離鐵和脂質過氧化物的存在都是執(zhí)行細胞鐵死亡的先決條件［28］。雖然通過β-巰基乙醇增加胱氨酸攝取和通過靶向激活轉錄因子4促進SLC7A11基因轉錄可以抑制細胞鐵死亡，但通過其抑制劑（包括erastin、柳氮磺胺吡啶、谷氨酸）阻斷System Xc-可導致胱氨酸吸收不足，GSH 消耗，抗氧化能力降低、脂質ROS 積累，從而誘導細胞鐵死亡［29］。除了關鍵的細胞鐵死亡調節(jié)途徑外，多個小分子蛋白53、核因子紅細胞樣蛋白2 相關因子2（Nrf2）和絲裂原活化蛋白激酶均參與了細胞鐵死亡的調節(jié)。

3.2 細胞鐵死亡在肺纖維化中的作用 研究表明，肺纖維化患者肺中的總鐵水平、鐵相關氧自由基和含鐵巨噬細胞較正常組均有所增加［30］。鐵死亡是一種與炎癥病理學有關的程序性細胞死亡。有研究發(fā)現，ROS 聚集增加和GSH 消耗與細胞鐵死亡過程密切相關，在肺纖維化的發(fā)病機制中也起著關鍵作用［31］。放射性肺纖維化（RILF）是胸部放射治療中一種嚴重的危及生命的并發(fā)癥。LI 等［32］發(fā)現鐵死亡促進RILF的發(fā)生發(fā)展，并且闡明ROS聚集是這一過程中細胞鐵死亡的關鍵誘因。在RILF 小鼠模型照射組中發(fā)現，肺組織體積縮小，線粒體密度增加，嵴減少，外膜中斷，這些均呈現典型的鐵死亡特征，且ROS 水平上調，GPX4 水平下調。鐵死亡抑制劑liproxstatin-1（Lip-1）可使RILI 小鼠肺結構損傷減輕，出血減少，線粒體收縮減少，GPX4 水平增加，膠原蛋白沉積被抑制，下調了RILF 小鼠肺內ROS 和HYP 的水平，降低了血清炎性細胞因子水平。但是RILF 小鼠中的Nrf2、血紅素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化還原酶1（NQO1）蛋白、mRNA 表達均被Lip-1 上調。因此，Lip-1 通過激活Nrf2、上調HO-1 和NQO1表達、下調TGF-β1表達、抑制肺組織細胞鐵死亡來減弱RILF。另外，鐵死亡與百草枯（PQ）誘導的肺損傷有關，鐵死亡抑制劑有望治療PQ中毒。在肺纖維化氧化藥物和細胞壽命模型中，鐵死亡激活劑erastin 降低人胎肺成纖維細胞中GPX4 的活性，并促進脂質過氧化物、α-SMA、COL1的表達，促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化［33］。鐵死亡抑制劑Fer-1增加GPX4 表達并降低脂質過氧化物，消除TGF-β1和erastin 對細胞鐵死亡的影響，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，延緩IPF 進程［34］。WANG等［35］研究證明，PM2.5 誘導內皮細胞會破壞細胞內鐵和氧化還原平衡，進而導致內皮細胞鐵死亡，并分泌炎性細胞因子。并且由鐵依賴性脂質過氧化引起的PM2.5 誘導的鐵死亡，可在藥理學上通過脂質氧化抑制劑和鐵螯合劑進行挽救。

綜上所述，隨著對調節(jié)性細胞壞死的進一步了解，細胞程序性壞死、細胞焦亡、細胞鐵死亡區(qū)別于之前所研究的細胞凋亡及細胞壞死。通過多種細胞死亡途徑來提高了對肺纖維化機制的認知。調節(jié)性細胞壞死的發(fā)生受某些免疫過程的影響，這些免疫過程中出現的調節(jié)網路可能對肺部疾病的治療至關重要。在未來的工作中，需要深入研究肺纖維化中調節(jié)性細胞壞死通路之間的相互聯系，取得肺部疾病臨床治療的歷史性突破。