李祥孟，曾繁浩，倪茂，唐振華，顏汝平

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650000)

1 細胞脹亡的來源和形態(tài)學(xué)特征

“脹 亡”(oncosis) 來 源 于 希 臘 文“ onkos”, 其表示的意思為腫脹(swelling)。在1910 年，vonReckling-hausen 首次描述在缺血死亡之前的骨細胞出現(xiàn)水分增多而腫脹的現(xiàn)象，后Majno G等[1]將這種細胞死亡稱之為細胞脹亡，并認為細胞脹亡不同于細胞凋亡，凋亡和脹亡僅是細胞死亡的兩種方式。光鏡下可見脹亡細胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)主要為細胞體積逐漸增大、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核出現(xiàn)腫脹，核膜、核仁周圍出現(xiàn)染色質(zhì)分離凝集現(xiàn)象，最后常表現(xiàn)為核溶解現(xiàn)象；胞膜逐漸起泡，而液體是膜泡中的主要成分，隨著細胞膜通透性增加，細胞膜出現(xiàn)崩解，隨即胞內(nèi)容物出現(xiàn)外溢，細胞呈現(xiàn)自溶樣的改變，同時周圍常伴有明顯的炎癥反應(yīng)，這個過程類似于細胞水樣變性、氣球樣變等一系列形態(tài)學(xué)的改變[2]。

2 細胞脹亡的分子機制

細胞脹亡的分子機制在龔小紅[2]有關(guān)細胞脹亡的文章中提到的有“與細胞膜損傷有關(guān)的分子機制、與caspase 有關(guān)的分子機制、與死亡受體有關(guān)的分子機制、與線粒體有關(guān)的分子機制、與Bcl-2 家族有關(guān)的機制”等五個機制，其中與線粒體相關(guān)的機制可進一步細分為線粒體功能失調(diào)導(dǎo)致的ATP含量降低和ATP 耗竭相關(guān)機制[3]。此以外，水通道蛋白相關(guān)分子機子也可誘導(dǎo)細胞脹亡，在Tsai[4]的實驗中，通過水通道蛋白激動劑促使大量的水進入癌細胞內(nèi)，使癌細胞發(fā)生不可逆性的腫脹，進而使細胞發(fā)生脹亡。

3 細胞脹亡的檢測方法

為了更好的研究細胞脹亡在腫瘤治療中的作用機制，科學(xué)有效的檢測是相關(guān)研究的基礎(chǔ)。經(jīng)過近些年的快速發(fā)展，相關(guān)的檢測方法也越來越全面且精確。(1)用光鏡、時差顯微鏡觀察檢測，還可以用電鏡[5]、采用細胞核染料染色的熒光顯微鏡[6]以及與其相結(jié)合的多通道全息顯微鏡觀察法來觀察細胞的細胞核、細胞器、細胞膜等結(jié)構(gòu)的細胞形態(tài)學(xué)變化來檢測。光鏡觀察顧名思義就是利用光學(xué)顯微鏡觀察脹亡細胞的形態(tài)學(xué)變化，若發(fā)生細胞脹亡則出現(xiàn)細胞腫脹、細胞質(zhì)空泡化改變等現(xiàn)象；時差顯微鏡相對于光鏡的優(yōu)點在于不需要移動細胞，顯微鏡觀察與細胞培養(yǎng)都在同一個視野內(nèi)，可以對所有細胞在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)上的變化進行觀察，這樣就更加容易對細胞進行研究；電鏡可觀察到光鏡、時差顯微鏡觀察不到的超微細胞結(jié)構(gòu)，比如細胞膜、細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器以及各個細胞器在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)上的變化情況，它是判定細胞脹亡非常重要的一種手段。由于自身觀察的局限性，電鏡還需在觀察的同時聯(lián)合其他的檢測手段進行相互檢測；熒光顯微鏡觀察是將細胞核進行染料標(biāo)記，從觀察細胞核形態(tài)，而多通道全息顯微鏡觀察則是在熒光的基礎(chǔ)上同全息顯微鏡相結(jié)合，以便更容易的轉(zhuǎn)換進行成像。(2)細胞發(fā)生凋亡的后期細胞膜的完整性則被破壞，而細胞脹亡啟動了細胞脹亡的開關(guān)[7]致細胞膜通透性增加的同時細胞膜完整性則就已被破壞，細胞膜的損傷可能來自于膜表面Na+-K+泵以及Ca2+泵功能的障礙和膜受體的改變。其機制主要是缺血性的損害可導(dǎo)致細胞 Na+-K+-ATP 酶活性降低,Na+經(jīng)過氧化應(yīng)激激活非選擇性陰離子通道從而進入細胞引起細胞脹亡[8]，通過獲得細胞懸液之后, 觀察細胞膜的通透性是否缺陷可判斷細胞是否脹亡。因此碘化丙啶作細胞核染料染色的碘化丙啶吸收試驗法、細胞內(nèi)容物泄漏試驗[9]、7-ADD 染色法[10]等。這些染料通過不完整的細胞膜,與胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)進行結(jié)合, 細胞膜的完整性可通過熒光強度檢測即可得出；乳酸脫氫酶釋放試驗[11]則是細胞內(nèi)乳酸脫氫酶通過有功能不足的細胞膜釋放到細胞外，釋放量一般同細胞膜受損程度相關(guān)，所以可以通過檢測乳酸脫氫酶釋放量來反映細胞膜受損程度，從而有助于對細胞脹亡的判定[11]。(3)線粒體膜電位檢測[9]，由于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子或其他離子分布不均而導(dǎo)致膜電位的形成，有研究報道細胞脹亡與細胞線粒體膜電位的下降有關(guān)[12]；但是細胞線粒體膜電位下降的現(xiàn)象也存在于其他細胞死亡方式之中，故對于細胞脹亡而言，通過檢測細胞線粒體膜電位來判斷細胞脹亡不具有特異性，還需其他有效地方法進行輔助檢測。(4)細胞三磷酸腺苷水平檢測[13]，細胞脹亡不需要三磷酸腺苷的介導(dǎo)，而細胞凋亡則是需要消耗三磷酸腺苷，因此細胞內(nèi)三磷酸腺苷含量的檢測對于鑒別細胞脹亡或者細胞凋亡具有非常重要的作用。但是針對特異性來說，細胞內(nèi)三磷酸腺苷含量的檢測對于細胞脹亡而言也無特別強的特異性，還需要其他的方法進行輔助檢測。(5)細胞ROS 水平檢測[14]，有文獻報道ROS 的過量生成與細胞發(fā)生脹亡有關(guān)，其原理是由ROS 介導(dǎo)的細胞脹亡[14]；但其特異性不高，同樣需要結(jié)合其他輔助檢查。(6)實時流式細胞術(shù)動力學(xué)分析法[15]就是用用染料分別標(biāo)記檢測細胞的線粒體和細胞膜電位，通過流式細胞儀進行檢測。這種檢測可將凋亡細胞與脹亡細胞進行區(qū)分。(7)通過Western blot 實驗來檢測porimin 和calpain 蛋白的表達情況的相關(guān)檢測方法[16]，porimin 也被稱為促脹亡受體。通過對能表達porimin 蛋白的進行檢測這一方法，從而判定細胞脹亡具有重要的作用，同時calpain 在細胞脹亡方面起著非常重要的作用，所以一般檢測porimin時也同時檢測calpain 蛋白。以上方法有的是比較成熟準(zhǔn)確的檢測方法，而有的方法其特異性則較低，如7-ADD 染色法、光鏡觀察法、線粒體膜電位檢測等。總而言之，細胞脹亡的檢測是以細胞的形態(tài)學(xué)檢查為基礎(chǔ)進行的過程，其他檢測方法都基于形態(tài)學(xué)上展開，作為輔助檢查手段。

4 腫瘤性疾病是威脅人類長壽的主要障礙之一

4.1 隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展、人口老齡化越發(fā)嚴重和人口的迅速增長，伴隨而來的是全世界的腫瘤發(fā)病率和腫瘤死亡率也迅速增長。據(jù)2018 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，非傳染性疾病(NCD)現(xiàn)在是造成全球大多數(shù)死亡的原因，而腫瘤也將成為21世紀世界各國人民是否長壽的主要原因和面對的挑戰(zhàn)性問題。依據(jù)世界衛(wèi)生組織2015 年的預(yù)估，在172 個國家中腫瘤將是其中91 個國家70 歲以前死亡的第一或第二大原因，而在其他22 個國家中因腫瘤死亡的原因排名第三或者第四[17]。對此，積極探索癌癥的治療方法將有助于提高人類的生活質(zhì)量以及為人類的長壽再助力助跑。

4.2 以細胞脹亡的方式誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡

在腫瘤的治療中也有許多通過使腫瘤細胞以細胞脹亡的死亡方式來達到腫瘤的治療作用[4]。也EnAd(Enadenotucirev) 是從一個腺病毒血清型庫中通過生物選擇分離出的一種嵌合體B 組腺病毒，被證明能夠誘導(dǎo)肺腺癌細胞、卵巢癌細胞等癌細胞通過以細胞脹亡的方式裂解死亡，起到癌治療的作用效果[18]。除此以外，細胞脹亡也參與了諸如肺、腎、肝[19]等癌細胞以及多種耐藥癌細胞[20]、乳腺癌[21,22]、胃癌[23]、腦膠質(zhì)瘤[24]、選擇性殺傷胚胎干細胞預(yù)防畸胎瘤的發(fā)生[6]等癌細胞的死亡，進而達到殺傷癌細胞，為癌癥的治療尤其是耐藥癌的治療提供了一種有效的治療方法。其作用機制主要為線粒體功能失調(diào)導(dǎo)致的ATP 含量降低和ATP 耗竭以及在水通道蛋白激動劑作用下促使大量的水進入癌細胞內(nèi)，使癌細胞發(fā)生不可逆性的腫脹，進而使細胞發(fā)生脹亡。

5 總結(jié)與展望

隨著對細胞脹亡的不斷深入研究，越來越多的研究表明，對目前可用的治療方法有抵抗力的癌細胞，誘導(dǎo)其以脹亡的方式死亡是一種有效的治療方法。在眾多研究中，“病毒療法”誘導(dǎo)癌細胞以脹亡的方式死亡就是一種非常具有潛力和優(yōu)勢的方法。利用腺病毒(如EnAd 腺病毒)誘導(dǎo)細胞以腫瘤細胞以細胞脹亡的方式死亡達到治療腫瘤的效果不僅為腫瘤的治療提供了一個非傳統(tǒng)的治療方法，而且還為“溶瘤疫苗”概念及研究奠定了機制基礎(chǔ)。但目前該方法還僅停留在臨床前研究階段，臨床相關(guān)性尚未得到驗證，有諸多因素限制其在臨床試驗的應(yīng)用。如：(1)病毒細胞毒性的確切機制可能因細胞類型而異，導(dǎo)致其產(chǎn)生的治療效果也有可能因細胞類型而產(chǎn)生差異;(2)EnAd 對人細胞的特異性嚴重限制了用于免疫原性臨床前檢測的動物模型。建立動物模型的昂貴花銷;(3)細胞生命周期短的腺病毒如何在人體產(chǎn)生抗病毒抗體之前將腫瘤細胞徹底殺死等。另外一個即水通道白激動劑的應(yīng)用，目前也存在一定的問題需要解決，如AqF026 激動劑可能會促進癌細胞遷移，惡化轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)。因此，需要確定合適的體外劑量或體內(nèi)濃度；除此以外，AqF026 對癌細胞而非正常細胞的特異性的選擇，這表明存在劑量或濃度的上限，從而不影響正常細胞的水通道蛋白等問題需要解決。盡管存在以上問題，但仍不可否認，細胞脹亡參與腫瘤細胞的死亡從而達到治療的效果將是一個非常有價值和前景的研究。關(guān)于脹亡與腫瘤兩者關(guān)系的研究才開始, 相信隨著人類不斷深入的研究, 對二者認識也將會更加明白, 相信更多的發(fā)現(xiàn)將有助于對腫瘤的預(yù)防和治療。針對組織發(fā)育和機體穩(wěn)態(tài)來說，細胞死亡顯得十分重要。目前已知焦亡、脹亡、旁凋亡、自噬、凋亡等都屬于細胞死亡的方式。其中，細胞凋亡是機體的一種正常代謝性活動，它是由基因調(diào)控的細胞主動性死亡的過程，細胞主要以萎縮和核碎裂為主要表現(xiàn)形式。臨床上有通過誘導(dǎo)細胞凋亡的方式來發(fā)揮抗腫瘤作用的藥物，但是腫瘤細胞耐藥的出現(xiàn)導(dǎo)致未能達到理想的效果，治療效果未達到醫(yī)患的期望。對于細胞死亡方式的研究已經(jīng)較為成熟、深入和透徹，同時檢測方法也比較全面。細胞脹亡不是一種主動性的細胞死亡方式，它是由生物不相容的物理條件或化學(xué)條件非特異性毒性引起的死亡。一系列的前期發(fā)展研究表面，細胞脹亡在細胞死亡方式中占有重要的地位，青蒿酯、黃連素、茄邊堿等化合物可誘導(dǎo)細胞脹亡的發(fā)生。細胞脹亡和細胞凋亡是兩個不同的概念，因此對于存在凋亡通路缺陷或者凋亡耐藥的腫瘤來說，誘導(dǎo)細胞脹亡是克服腫瘤細胞對化療藥物的耐藥的有效方法，進而發(fā)揮抗腫瘤的作用，除此以外，細胞凋亡的細胞死亡方式也有助于解決凋亡耐藥的問題、有利于抗腫瘤新靶點的探索以及抗腫瘤新方法的制定。另外，細胞脹亡同樣存在于心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)性疾病等的發(fā)生發(fā)展過程，對以上系統(tǒng)等的預(yù)防以及治療具有潛在的重大意義，對此也猜測，細胞凋亡也可能參與泌尿生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展、對細胞凋亡的深入研究，將有助于提高各系統(tǒng)腫瘤疾病的治療效果，改善患者的生活質(zhì)量。