劉璐，景潔，王家浩，劉菊香，權(quán)金星(通信作者*)

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

0 引言

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一組由遺傳和環(huán)境因素引起的，導(dǎo)致胰島功能下降，胰島素敏感性逐漸惡化和胰腺胰島素分泌減少，形成相對(duì)胰島素缺乏的狀態(tài)，導(dǎo)致高血糖，以慢性高血糖為主要特征的代謝性疾病，嚴(yán)重降低了人類的生活質(zhì)量，預(yù)計(jì)到 2030 年將影響到5.784 億人，成為全球最常見的致殘的慢性疾病之一[1]。非酒精性脂肪肝已經(jīng)發(fā)展成為全世界最常見的慢性肝病[2]，據(jù)最新研究報(bào)道，T2DM 中NAFLD 的患病率為 54.3%-64.9%[3]。一份來自22 個(gè)國(guó)家的850萬人的最新研究表明，80%以上的人都是超重或者肥胖，72%的人有不正常的血脂，44%的人是2型糖尿病。非酒精性脂肪性肝病是一種與內(nèi)臟脂肪和代謝綜合征密切相關(guān)的肝損傷類型[4]，其亞型主要有非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎，成為肝硬化、肝癌的主要病因。非酒精性脂肪肝和2 型糖尿病之間相互作用，兩者在病理生理機(jī)制上有密不可分的聯(lián)系[5]。糖尿病合并脂肪肝的發(fā)生與高血糖、胰島素抵抗和高脂血癥等密切相關(guān)[6]。糖尿病患者在長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)下，血清中氧化應(yīng)激產(chǎn)物及NF-κB、IL-6、IL-18 等炎癥介質(zhì)增加，從而影響脂類物質(zhì)在血液與肝臟之間的交換和代謝[7]，同時(shí)炎癥因子將炎癥細(xì)胞募集到肝臟并通過線粒體增加活性氧應(yīng)激并促進(jìn)細(xì)胞死亡[8]。MicroRNAs(miRNAs，miRs) 是 一 類 長(zhǎng) 約20-25 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與靶基因的mRNA 的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)結(jié)合，促進(jìn)靶基因mRNA 的降解或抑制蛋白的合成，負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)[9]。miRNA 可以在細(xì)胞外被檢測(cè)到，包括在血液、尿液和其他體液中，它們的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定[10]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 通過控制胰島細(xì)胞功能、脂肪細(xì)胞胰島素抵抗、肝細(xì)胞胰島素信號(hào)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)，在調(diào)節(jié)葡萄糖和脂代謝中發(fā)揮作用，因此可能參與相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制[11]。

1 目前非酒精性脂肪肝的診斷

非酒精性脂肪肝是一種異質(zhì)性疾病，從組織學(xué)的角度可以分為非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。非酒精性脂肪肝是指有至少5%的肝臟脂肪變性，且沒有肝細(xì)胞氣球樣變的跡象。非酒精性脂肪肝是指有至少5%的肝臟脂肪變性，伴或者不伴纖維化。從流行病學(xué)觀點(diǎn)來看，NAFLD 中晚期階段心血管的代謝危險(xiǎn)升高，例如中晚期NASH 伴纖維化[12,13]。因此改進(jìn)現(xiàn)有的診斷方法，并進(jìn)一步發(fā)展具有創(chuàng)新性的、非侵入性工具來診斷這些不同階段的疾病，是非常必要的。

臨床實(shí)踐中對(duì)于肝臟脂肪變性的診斷，超聲的應(yīng)用是非常廣泛的，整體敏感性85%，特異94%，精確度較高[14]。但是和磁共振質(zhì)子波普成像相比，肝臟超聲檢測(cè)肝臟脂肪變性的能力較差[15]，只有當(dāng)肝臟脂肪含量達(dá)到至少12.5%時(shí)，肝臟超聲才會(huì)有其高敏感度，約為80-85%[16]。磁共振質(zhì)子波普成像價(jià)格高昂，較少用于臨床。目前應(yīng)用的肝臟脂肪變性的診斷指標(biāo)中，廣泛應(yīng)用的脂肪肝指數(shù)的靈敏度為73%，特異度為74%[17]。計(jì)算機(jī)斷層成像技術(shù)(CT)對(duì)于脂肪肝的診斷是非常精準(zhǔn)的，但是由于射線的量比較大，較少應(yīng)用于臨床。目前采用各種非侵入性手段診斷非酒精性脂肪肝的關(guān)鍵是確定是否存在脂肪性肝炎，特別是中重度纖維化(至少F2 纖維化階段)來衡量疾病的嚴(yán)重程度。血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度升高并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)疾病的嚴(yán)重程度，即使血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度是正常上限的兩倍(＞70 U/L)，也只能預(yù)測(cè)NASH，其敏感性為50%，特異性為61%[18]。所以，在評(píng)價(jià)肝臟疾病的本質(zhì)和嚴(yán)重性方面，肝組織切片活檢仍是最明確的檢測(cè)方法。但是，由于組織切片的費(fèi)用和可能出現(xiàn)的并發(fā)癥，使人們對(duì)開發(fā)一種新的、無創(chuàng)的治療方式產(chǎn)生了濃厚的興趣[19]。

2 miR-675 參與NAFLD 的發(fā)生發(fā)展

2.1 miR-675 是由H19 的第一個(gè)外顯子產(chǎn)生的，H19 是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA[20]，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，miR-675 在口腔癌[21]、乳腺癌[22]、胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌[23]、肝細(xì)胞癌[24]等惡性腫瘤中細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，通過多種途徑參與腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲。高糖狀態(tài)下，應(yīng)用Targetscan 生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-675 的靶基因，進(jìn)而用DAVID KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行分類，從而識(shí)別miR-675 參與的通路，發(fā)現(xiàn)miR-675 參與了胰島素信號(hào)通路、脂肪因子信號(hào)通路等[25]。VDR 是miR-675 的靶基因之一，H19/miR675/VDR/EGR1 的負(fù)反饋回路參與了DN 的發(fā)展[26]。

2.2 內(nèi)臟脂肪組織的積累與代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，肝臟在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著核心作用，而脂質(zhì)代謝和胰島素信號(hào)的破壞與NAFLD 密切相關(guān)。因此，確定控制脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗的調(diào)控因子是至關(guān)重要的。心包脂肪沉積在心臟周圍的兩個(gè)位置:心外膜(EAT)和心旁脂肪組織，已被證實(shí)心外膜脂肪沉積與胰島素抵抗、中心性肥胖存在正相關(guān)關(guān)系[27]，在該研究中miR-675 在高血糖期間在EAT 中顯著上調(diào)[25]。高血糖狀態(tài)下miR-675 的靶基因預(yù)測(cè)表明PCK-2 是miR-675 的靶點(diǎn)。PCK-2 編碼了線粒體同工酶，與甘油發(fā)生有關(guān)，通過脂肪組織中的甘油三酯-脂肪酸循環(huán)影響脂肪酸的儲(chǔ)存和調(diào)節(jié)釋放。[28]甘油發(fā)生是糖異生的一種簡(jiǎn)化形式，即從丙酮酸、乳酸或丙氨酸等底物中產(chǎn)生甘油-3-磷酸，甘油生成在脂肪組織和肝臟中很重要，以維持甘油三酯-脂肪酸循環(huán)。甘油異生，像糖異生一樣，是由PCK 活性調(diào)節(jié)的[29]。PCK 參與肝臟、脂肪組織甘油三酯的儲(chǔ)存，可能在脂質(zhì)儲(chǔ)存調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，有研究證實(shí)，小鼠肝臟過表達(dá)PCK-2 會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗和2 型糖尿病[30]。

2.3 miR-675 參與人間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪形成過程中脂滴形成[31]，該研究通過RNA 分離和RNASeq分析篩選了95 種與脂滴形成的相關(guān)的miRNA，測(cè)定了人間充質(zhì)干細(xì)胞7d、14d、21d、28d 的miRNA 水平的變化,發(fā)現(xiàn)miR-675 顯著差異性上調(diào)，并用TargetScan 軟件預(yù)測(cè)了其靶基因，主要靶向ACSL1( 長(zhǎng)鏈脂酰COA 合成酶)、APOB( 載脂蛋白)、METTL7A( 甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白7A)、PLIN1(人圍脂滴蛋白1)和PLIN4(人圍脂滴蛋白4)等，可能成為代謝綜合征(如肥胖癥、2 型糖尿病、脂肪變性、動(dòng)脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松癥)的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

2.4 NAFLD 的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，遺傳和環(huán)境均有影響，可以用“二次打擊”假說解釋，胰島素抵抗始終是關(guān)鍵，第二次打擊時(shí)，肝臟內(nèi)過多的游離脂肪酸在線粒體內(nèi)代謝時(shí)，產(chǎn)生大量氧活性自由基，氧化肝臟內(nèi)的脂質(zhì)成為脂質(zhì)過氧化物。而氧自由基和游離脂肪酸同時(shí)也是動(dòng)脈粥樣硬化的高危因素[32]。miR-675 與超敏C 反應(yīng)蛋白(CRP)在動(dòng)脈粥樣硬化患者中同時(shí)高表達(dá)，miR-675 成為動(dòng)脈粥樣硬化的重要預(yù)后標(biāo)志物[33]。有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化糖尿病大鼠的髂主動(dòng)脈組織樣本中鑒定728 種miRNA，其中的9 種miRNA 顯著差異上調(diào)，包括miR675[34]。

2.5 miR-675 的前體長(zhǎng)鏈非編碼基因H19，通過miR-675/IGF-1 信號(hào)通路參與調(diào)控肝臟的發(fā)育成熟[20]。雖然凋亡和壞死都導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但兩者對(duì)周圍組織微環(huán)境和隨后的免疫反應(yīng)的影響有明顯不同[35,36]。與細(xì)胞凋亡不同，壞死是高度炎癥性的，在該研究中發(fā)現(xiàn)miR-675 和H19 在肝硬化肝臟中升高，miR-675 靶向FADD 下調(diào)，增強(qiáng)了炎癥信號(hào)下的肝臟壞死性凋亡，這種調(diào)節(jié)刺激和增強(qiáng)了肝臟的炎癥反應(yīng)[37]，已有研究表明，H19能增強(qiáng)NF-κB 的活化，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖[38]。該研究我們證明了H19 的這個(gè)功能至少可以部分歸因于miR-675 的活性，通過miR-675處理后可增強(qiáng)體內(nèi)幾個(gè)NF-κB 靶基因的表達(dá)，特別是促炎細(xì)胞因子。該研究發(fā)現(xiàn)在注射了miR-675 的小鼠的肝臟中看到了巨噬細(xì)胞的募集。以上結(jié)果強(qiáng)烈表明，miR-675 通過增加 NF-κB 的激活來增強(qiáng)肝臟炎癥。

2.6 lncRNAs 和miRNAs 均 參 與 調(diào) 節(jié) 了HBV 相關(guān)肝病[39], 劉青[40]等將HBx 轉(zhuǎn)染到L02 細(xì)胞中后ALT、AST 升高從而構(gòu)建肝細(xì)胞損傷模型，lncRNAH19 和miR-675 的表達(dá)顯著上調(diào)，從而說明lncRNAH19 和miR-675 軸參與了HBV 相關(guān)的肝炎和肝細(xì)胞損傷。免疫反應(yīng)因子，特別是促炎細(xì)胞因子，在HBV 誘導(dǎo)的肝損傷中發(fā)揮重要作用[41]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HBx 過表達(dá)顯著提高了IFN-γ、IL-6 和IL-18 的產(chǎn)生，而抑制lncRNAH19 或miR-675 明顯抑制了其升高，所以表明lncRNAH19/miR-675 軸調(diào)控了HBx 誘導(dǎo)的炎癥因子。為了進(jìn)一步研究H19/miR-675 軸在HBx 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中的潛在分子機(jī)制，我們使用Miranda 和TargetScan 預(yù)測(cè)了miR-675 假定的靶基因，最終篩選PPARα 作為研究重點(diǎn)，該研究在隨后的雙熒光素酶報(bào)告證明miR-675 直接靶向PPARαmRNA 的3'-UTR。該研究對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證，在慢性乙型肝炎患者組織中PPARα 的表達(dá)顯著下調(diào)，且lncRNA H19 的表達(dá)與PPARα或miR-675 與PPARα 呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示H19/miR-675/PPARα 軸可能在慢性乙型肝炎中發(fā)揮重要作用。隨后該研究又進(jìn)一步證實(shí)了LncRNA H19/miR-675 /PPARα 軸通過Akt/mTOR信號(hào)調(diào)控乙型肝炎蛋白誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和能量代謝重塑。

3 小結(jié)

綜上所述：miR-675 可能在2 型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的病理發(fā)生機(jī)制具有重要作用，miR-675 是一種具有潛力的新的治療靶標(biāo)，它可以從多個(gè)角度、多途徑參與 NAFLD 的發(fā)病機(jī)理，從而為 NAFLD 的治療提供新的方法和方法。但在此基礎(chǔ)上，仍然存在著許多需要進(jìn)一步解決的問題。比如，在動(dòng)物試驗(yàn)中非常有效的miR-675 是否也能在人類身上產(chǎn)生同樣的作用？是否可以在臨床上推廣？它是怎樣在臨床上使用的？miR-675 的研究是一個(gè)充滿了未知與驚奇的過程，它的作用靶標(biāo)和機(jī)理有待于進(jìn)一步的深入探討。