中國抗癌協(xié)會(huì)腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會(huì)

隨著液態(tài)活檢的快速發(fā)展，采用體液對(duì)患者的分子特征進(jìn)行分析成為可能，特別是基于循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的高通量測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)，因其無創(chuàng)或微創(chuàng)、檢測(cè)時(shí)間短、能夠反映瘤內(nèi)和轉(zhuǎn)移灶異質(zhì)性、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療療效等優(yōu)勢(shì)而在臨床得到越來越廣泛的應(yīng)用。與腫瘤組織樣本相比，采用ctDNA進(jìn)行基因檢測(cè)在樣本收集和處理、檢測(cè)技術(shù)要求、結(jié)果解讀和臨床應(yīng)用等方面存在諸多不同，且目前國內(nèi)尚缺少ctDNA基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，因此限制了其在臨床上的規(guī)范應(yīng)用。為此，中國抗癌協(xié)會(huì)腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會(huì)組織國內(nèi)腫瘤臨床、病理、檢驗(yàn)、生物信息分析和高通量檢測(cè)領(lǐng)域?qū)＜遥瑓⒖紘鴥?nèi)外ctDNA臨床應(yīng)用共識(shí)、指南和最新文獻(xiàn)，結(jié)合國內(nèi)外現(xiàn)有的高通量測(cè)序技術(shù)要求和臨床實(shí)踐，從ctDNA的生物學(xué)特征、臨床應(yīng)用價(jià)值和范圍、高通量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)要求及其未來發(fā)展趨勢(shì)等方面提出本共識(shí)，以促進(jìn)ctDNA NGS的健康規(guī)范發(fā)展。

1 ctDNA概述

ctDNA通常由腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分泌或在腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死過程中釋放入循環(huán)系統(tǒng)中的DNA片段，長度132～145 bp，半衰期較短（一般＜2 h）。ctDNA會(huì)攜帶來源于腫瘤細(xì)胞相關(guān)的遺傳學(xué)特征，如基因突變、甲基化、擴(kuò)增或重排等，可作為腫瘤篩查、伴隨診斷、治療療效評(píng)估及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層的重要指標(biāo)。

ctDNA水平一般呈動(dòng)態(tài)變化，且受多種因素影響：⑴腫瘤病理組織類型、部位、分期、腫瘤負(fù)荷等因素可影響ctDNA的釋放。在腫瘤負(fù)荷較輕、特定部位（如顱內(nèi)腫瘤）和特定組織學(xué)（如膠質(zhì)瘤），以及增殖、凋亡和/或血管化水平較低的腫瘤患者中，ctDNA水平通常較低［1］。⑵大量其他來源的DNA干擾。如其他正常細(xì)胞或白細(xì)胞來源的DNA，與ctDNA一起被稱為游離DNA（cell free DNA，cfDNA）。多種生理和病理因素，如懷孕、劇烈運(yùn)動(dòng)、外傷、炎癥、心肌梗死、自身免疫性疾病和急性中風(fēng)等也會(huì)影響cfDNA的釋放［2-3］。⑶克隆性造血細(xì)胞產(chǎn)生的cfDNA攜帶的基因突變信息可能會(huì)干擾ctDNA檢測(cè)結(jié)果［4］。此外，其突變基因還受不同內(nèi)外因素影響（包括年齡、吸煙、種族和腫瘤治療等），如ASXL1突變?cè)谖鼰熣咧懈患?，DNA損傷應(yīng)答（DNA-damaged response，DDR）基因（TP53、PPM1D、CHEK2）突變?cè)诮邮芊派?、鉑類藥物和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑治療的腫瘤患者中更為常見［5］。⑷ctDNA半衰期較短（一般＜2 h），不同采樣時(shí)間可能影響ctDNA含量［6］。⑸藥物治療影響ctDNA含量。有研究顯示，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者接受酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治療后，ctDNA含量在24 h達(dá)到頂峰，隨后快速降低，提示藥物也會(huì)影響ctDNA含量［7］。

與組織學(xué)檢測(cè)相比，ctDNA檢測(cè)具有無創(chuàng)或微創(chuàng)，可反復(fù)取材，收集、處理和分析報(bào)告周轉(zhuǎn)時(shí)間（turn-around time，TAT）短等優(yōu)勢(shì)［8］。同時(shí)能克服腫瘤空間異質(zhì)性，可相對(duì)全面地實(shí)時(shí)反映患者的腫瘤分子特征［9］。與單獨(dú)組織活檢相比，血漿ctDNA還可增加驅(qū)動(dòng)基因突變檢出率［10］。然而，與組織標(biāo)本相比，外周血ctDNA含量較低，容易造成臨床檢測(cè)假陰性結(jié)果。由于胚系變異或克隆性造血突變的存在，若未用白細(xì)胞作為對(duì)照，也可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果［11-12］。此外，不同腫瘤患者或同一患者不同時(shí)段釋放入血的ctDNA量也存在差異，這也給ctDNA的臨床檢測(cè)和結(jié)果解讀帶來困難。一項(xiàng)對(duì)中國66家ctDNA NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控的回顧分析顯示，ctDNA檢測(cè)報(bào)告書寫質(zhì)量相對(duì)滿意的實(shí)驗(yàn)室僅占42.4%，其中74.2%的報(bào)告僅列了相應(yīng)癌種與目前治療藥物最相關(guān)的基因變異結(jié)果，對(duì)檢測(cè)方法細(xì)節(jié)和相應(yīng)檢測(cè)局限缺乏詳細(xì)的描述［13］。

專家共識(shí)：ctDNA是由腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分泌或腫瘤細(xì)胞在凋亡或壞死過程中釋放入循環(huán)系統(tǒng)的DNA片段；其豐度受多種因素影響，波動(dòng)較大，在內(nèi)外因素特別是治療壓力下，其攜帶的生物信息可能會(huì)發(fā)生演變，且受正常細(xì)胞胚系變異或克隆性造血細(xì)胞體系突變干擾，在臨床檢測(cè)和報(bào)告解讀過程中應(yīng)特別注意。

2 ctDNA NGS檢測(cè)的臨床應(yīng)用

2.1 ctDNA NGS檢測(cè)在腫瘤伴隨診斷中的價(jià)值

伴隨診斷（companion diagnostics，CDx）被認(rèn)為是腫瘤個(gè)性化醫(yī)療中不可或缺的工具，其要求測(cè)試結(jié)果所提供的信息足以保證相應(yīng)治療藥物的安全性和有效性，預(yù)期用途為指導(dǎo)用藥，識(shí)別能夠從特定治療中受益的患者。ctDNA檢測(cè)作為CDx在最早的臨床實(shí)踐應(yīng)用是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變檢測(cè)，主要用于識(shí)別可能從EGFR TKI獲益的晚期NSCLC患者。在ENSURE研究中，ctDNA檢測(cè)EGFR 19del和L858R突變的特異性為98.2%，敏感性為76.7%；而根據(jù)ctDNA檢測(cè)結(jié)果接受厄洛替尼治療的患者較化療患者的PFS明顯改善［14］。基于該研究結(jié)果，F(xiàn)DA于2016年批準(zhǔn)首款液體活檢CDx產(chǎn)品Cobas EGFR Mutation Test v2，隨后國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）于2019年批準(zhǔn)該款CDx產(chǎn)品在國內(nèi)上市。在FLAURA研究中，ctDNA T790M陽性患者對(duì)奧希替尼的客觀緩解率（objective response rate，ORR）與腫瘤組織活檢陽性患者一致［15］。據(jù)此，2020年FDA批準(zhǔn)Guardant360 CDx用于血漿ctDNA檢測(cè)以識(shí)別可獲益于奧希替尼治療的EGFR L858R/19del/T790M突變，埃萬妥單抗（JNJ-6372）對(duì)應(yīng)的EGFR 20ins突變以及索托拉西布對(duì)應(yīng)的KRAS G12C突變的NSCLC患者［16］。隨后又批準(zhǔn)適用范圍更廣的一款CDx產(chǎn)品FoundationOne Liquid CDx，主要用于識(shí)別包括NSCLC EGFR敏感突變（L858R/19del）、ALK重排、MET 14號(hào)外顯子跳躍，前列腺癌BRCA1/2及ATM突變，上皮性卵巢癌/輸卵管癌或原發(fā)性腹膜癌BRCA1/2突變以及乳腺癌PIK3CA突變，以指導(dǎo)其藥物［17］。

當(dāng)前EGFR、ALK、ROS1、BRAF、MET、RET、NTRK及KRAS（G12C突變）等驅(qū)動(dòng)基因陽性的晚期NSCLC一線靶向治療藥物相繼獲批，基于ctDNA檢測(cè)結(jié)果的臨床治療選擇日益獲得注冊(cè)臨床試驗(yàn)與真實(shí)世界研究的證據(jù)支持。有研究顯示，在轉(zhuǎn)移性NSCLC中，對(duì)于指南推薦的生物標(biāo)志物，ctDNA檢測(cè)較僅采用組織活檢的患者可額外增加48%的檢出率，且可顯著降低檢測(cè)報(bào)告TAT（9 d vs 15 d，P＜0.0001）［8］。 NSCLC NCCN 指 南2022 V1版推薦不宜開展有創(chuàng)活檢的晚期患者，或所獲得的組織標(biāo)本質(zhì)量不佳，或標(biāo)本量不足以開展必需的多基因變異檢測(cè)時(shí)，可以開展包含EGFR、ALK、ROS1、BRAF、MET、RET和 KRAS（G12C突變）等在內(nèi)的ctDNA NGS檢測(cè)，但也同時(shí)提醒ctDNA NGS檢測(cè)存在30%左右的假陰性，以及相應(yīng)分析會(huì)受到克隆性造血影響［18］。2021年，國際肺癌研究協(xié)會(huì)（IASLC）共識(shí)指出，ctDNA可作為初診NSCLC晚期患者進(jìn)行基因分型的有效工具，其結(jié)果通常可與組織分析結(jié)果互補(bǔ)，也可以作為診斷生物標(biāo)志物評(píng)估和監(jiān)測(cè)靶向治療療效的首選策略（其中血漿優(yōu)先）［19］。

基于SOLAR-1研究［20］結(jié)果，F(xiàn)DA于2019年批準(zhǔn)第二款液體活檢CDx產(chǎn)品Therascreen PIK3CA RGQ PCR Kit。該產(chǎn)品主要通過血漿ctDNA檢測(cè)識(shí)別受益于PIK3CA抑制劑阿培利司（與氟維司群聯(lián)合）治療的PIK3CA突變晚期HR+/HER2-乳腺癌患者［21］。一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的薈萃分析顯示，ctDNA檢測(cè)PIK3CA突變的敏感性和特異性分別為86%和98%［22］。乳腺癌NCCN指南2022 V1版推薦，復(fù)發(fā)不可切除或轉(zhuǎn)移性HR+/HER2-乳腺癌應(yīng)進(jìn)行基于穿刺組織或ctDNA的PIK3CA突變分析，若首選ctDNA檢測(cè)但結(jié)果呈陰性時(shí)，應(yīng)再次進(jìn)行組織檢測(cè)確認(rèn)［23］。

在胃食管腺癌中，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶往往存在異質(zhì)性，ctDNA檢測(cè)可全面反映全身腫瘤情況，從而更有效地指導(dǎo)精準(zhǔn)治療［24］。研究顯示聯(lián)合組織和血漿ctDNA HER2擴(kuò)增檢測(cè)可提高對(duì)食管癌及食管胃交界部癌患者抗HER2治療的預(yù)測(cè)價(jià)值［25］。胃癌和食管癌及食管胃交界部癌NCCN指南2022 V1建議不適合組織活檢的胃癌和食管癌患者可考慮進(jìn)行血漿ctDNA NGS檢測(cè)［26-27］，但同時(shí)強(qiáng)調(diào)ctDNA檢測(cè)為陰性時(shí)并不排除經(jīng)組織分析基因變異的存在。此外，由于尚缺乏有效的治療手段，NCCN指南2022 V1建議轉(zhuǎn)移性胰腺癌在無法經(jīng)活檢獲得足夠組織時(shí)可考慮進(jìn)行ctDNA NGS檢測(cè)，且至少應(yīng)包括ALK、NRG1、NTRK、ROS1融合基因變異與BRAF、BRCA1/2、HER2、KRAS、PALB2基因突變分析［28］。皮膚惡性黑色瘤NCCN指南2022 V1也提及ctDNA NGS檢測(cè)可作為其分子分型的替代性方式［29］。

近期已有研究［30-32］初步顯示，基于ctDNA NGS檢測(cè)篩選參與臨床試驗(yàn)患者具有足夠的準(zhǔn)確性，且在不影響療效的情況下可提高試驗(yàn)入組率，縮短篩查時(shí)間。這些研究結(jié)果提示ctDNA NGS檢測(cè)在臨床試驗(yàn)中具有一定優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。然而，除了已獲批的伴隨診斷產(chǎn)品，大多數(shù)ctDNA在其他靶向治療指導(dǎo)的有效性和實(shí)用性證據(jù)依然不足，尚需大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床試驗(yàn)支撐，后續(xù)研究應(yīng)盡可能納入預(yù)期適用人群，通過嚴(yán)格設(shè)計(jì)的臨床研究充分驗(yàn)證其臨床意義［33］。針對(duì)不同癌種，血漿ctDNA腫瘤基因突變檢測(cè)與腫瘤組織基因突變檢測(cè)的一致性仍存在較大差異，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果差異較大的癌種，應(yīng)綜合考慮其臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)，慎重考慮ctDNA NGS檢測(cè)作為組織基因檢測(cè)替代方式的可行性。

專家共識(shí)：目前已有臨床證據(jù)支持ctDNA NGS檢測(cè)可應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期實(shí)體腫瘤的伴隨診斷，但涉及的驅(qū)動(dòng)基因及其變異類型與相應(yīng)分析體系均有嚴(yán)格限定，若超適應(yīng)癥應(yīng)用時(shí)，建議與患者就檢測(cè)必要性、檢測(cè)費(fèi)用以及局限性等內(nèi)容進(jìn)行充分知情。ctDNA NGS檢測(cè)已被國內(nèi)外專家共識(shí)或指南建議作為多種晚期惡性腫瘤組織基因檢測(cè)的替代方式，但依據(jù)其分析結(jié)果實(shí)時(shí)制定臨床治療策略時(shí)仍需高級(jí)別循證證據(jù)支持。

2.2 ctDNA NGS檢測(cè)對(duì)腫瘤治療療效評(píng)估及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層的價(jià)值

采用腫瘤標(biāo)志物和影像學(xué)等傳統(tǒng)方法評(píng)估分子靶向和免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療療效時(shí)無法動(dòng)態(tài)反映腫瘤特征性的分子演化，ctDNA NGS檢測(cè)可對(duì)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因相關(guān)ctDNA的豐度變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，判斷腫瘤治療應(yīng)答，其中在NSCLC的EGFR靶向治療中，EGFR敏感突變?cè)缙谇宄捎糜陬A(yù)測(cè)EGFR TKI療效［34］。一項(xiàng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)ctDNA預(yù)測(cè)NSCLC臨床治療療效的真實(shí)世界研究發(fā)現(xiàn)，基線ctDNA含量越高或變異數(shù)量越多，預(yù)示著OS越短（治療后ctDNA清除的患者PFS和OS更長），而且ctDNA也是與治療類型和評(píng)估時(shí)相點(diǎn)設(shè)置無關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素［35］。接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的晚期NSCLC患者，ctDNA響應(yīng)（降低＞50%）與影像學(xué)評(píng)估的療效吻合，且與更好的PFS和OS相關(guān)，其中治療后5～9周早期影像評(píng)估為病灶穩(wěn)定的患者，ctDNA評(píng)估為響應(yīng)的患者中位OS顯著延長（31.2個(gè)月 vs 18.4個(gè)月，HR=0.36）［36］。受體型蛋白酪氨酸磷酸酶D（protein tyrosine phosphatase，receptor type D，PTPRD）在多種腫瘤中表達(dá)失活［37］，在非鱗NSCLC中PTPRD磷酸酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生缺失性突變時(shí)，二線治療能更多從阿特珠單抗中獲益（中位OS：24.04個(gè)月 vs 9.69個(gè)月，HR=0.16，P=0.0273），并且PTPRD是獨(dú)立的預(yù)后因素［38］，且不依賴于TMB和PD-L1表達(dá)或（和）TP53、EGFR、KRAS基因突變狀態(tài)。在轉(zhuǎn)移性激素抵抗前列腺癌中，ctDNA水平降低與PSA降低超過30%相關(guān)［39］。TOPARP-A研究也發(fā)現(xiàn)，接受PARP抑制劑治療的晚期前列腺癌患者ctDNA降低與OS相關(guān)［40］。但在近期一項(xiàng)黑色素瘤合并腦轉(zhuǎn)移免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療研究中發(fā)現(xiàn)血漿ctDNA分析并不能很好地監(jiān)測(cè)顱內(nèi)病灶療效，這顯示了血腦屏障對(duì)ctDNA檢測(cè)的不利影響［41］。

微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）概念最早來自血液腫瘤。實(shí)體腫瘤的MRD概念更多被稱為分子殘留病灶（molecular residual disease，MRD），是指經(jīng)過治療后，傳統(tǒng)影像學(xué)（包括PET/CT）或其他實(shí)驗(yàn)室方法不能發(fā)現(xiàn)，但通過液體活檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤來源分子異常，代表腫瘤持續(xù)存在和臨床進(jìn)展可能。TracerX研究證實(shí)了ctDNA作為MRD檢測(cè)的可行性并評(píng)估了MRD檢測(cè)對(duì)NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值［42］。一項(xiàng)回顧性研究納入了22例接受新輔助治療（大多為新輔助免疫治療）的ⅠB～ⅢA期NSCLC患者，其ctDNA動(dòng)態(tài)分析結(jié)果與術(shù)后病理學(xué)評(píng)價(jià)高度一致，敏感性為100.00%、準(zhǔn)確性為91.67%，其中術(shù)后3～8 d ctDNA檢測(cè)陽性的患者具有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)（HR=5.37），且基于ctDNA NGS檢測(cè)預(yù)測(cè)分子復(fù)發(fā)事件較影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估的中位時(shí)間提前了6.83個(gè)月［43］。2021年《非小細(xì)胞肺癌分子殘留病灶專家共識(shí)》將肺癌分子異常定義為在外周血可穩(wěn)定檢測(cè)出豐度≥0.02%的ctDNA，包括肺癌驅(qū)動(dòng)基因或其他Ⅰ/Ⅱ類基因變異［44］。一項(xiàng)通過檢測(cè)ctDNA監(jiān)測(cè)MRD的臨床研究納入261例可手術(shù)根治切除的NSCLC患者，結(jié)果顯示，術(shù)前ctDNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)36.4%的患者為陽性，表明可能存在未發(fā)生ctDNA脫落的腫瘤（non-shedding tumor），但不影響術(shù)后MRD監(jiān)測(cè)［45］。該研究還發(fā)現(xiàn)術(shù)后單個(gè)節(jié)點(diǎn)MRD檢測(cè)陰性患者的預(yù)后顯著優(yōu)于陽性患者（HR=0.08，95%CI：0.02～0.33），說明動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可進(jìn)一步提升預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，這一結(jié)果首次定義了潛在治愈人群，且發(fā)現(xiàn)術(shù)后MRD陰性人群不能從輔助治療獲益；僅腦部復(fù)發(fā)的患者M(jìn)RD檢出比例顯著降低（20%，1/5）。在結(jié)腸癌患者中，術(shù)后ctDNA連續(xù)監(jiān)測(cè)較影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估最多可提前16.5個(gè)月預(yù)測(cè)分子復(fù)發(fā)事件［46］。多項(xiàng)研究表明，結(jié)直腸癌術(shù)后及輔助治療后ctDNA陽性與疾病復(fù)發(fā)之間呈強(qiáng)相關(guān)性，術(shù)后的ctDNA分析結(jié)果可作為預(yù)后預(yù)測(cè)依據(jù)［47-48］。近期，首項(xiàng)基于ctDNA的結(jié)腸癌術(shù)后輔助治療隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)DYNAMIC結(jié)果顯示，ctDNA指導(dǎo)下的輔助化療策略可以在不影響患者總體無復(fù)發(fā)生存期的前提下，降低接近50%（從28%降低至15%）的術(shù)后輔助化療率，避免了部分患者的無效化療［49］。該研究為Ⅱ期結(jié)腸癌患者的術(shù)后輔助治療決策提供了直接依據(jù)。IMvigor010是一項(xiàng)高危肌層浸潤性尿路上皮癌輔助免疫治療的Ⅲ期臨床研究，研究結(jié)果顯示ctDNA陽性患者接受阿替利珠單抗的中位無病生存期和OS顯著改善，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低42%，死亡風(fēng)險(xiǎn)降低41%［50］。目前，眾多公司推出實(shí)體瘤MRD檢測(cè)產(chǎn)品，但并無獲批（FDA/NMPA）產(chǎn)品上市，亟待通過大樣本、多中心、前瞻性臨床試驗(yàn)驗(yàn)證這些產(chǎn)品的臨床效用［51］。

專家共識(shí)：晚期實(shí)體腫瘤分子靶向或免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療開始后，基于NGS檢測(cè)的ctDNA水平定量和動(dòng)態(tài)變化分析，有望成為新興的療效評(píng)估途徑。ctDNA MRD檢測(cè)是全新的個(gè)性化技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尚難以建立通用性技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，亟待通過大樣本、多中心、前瞻性的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證其臨床效用。ctDNA NGS檢測(cè)在臨床上用于靶向或免疫治療評(píng)估和分層時(shí)，建議就檢測(cè)價(jià)值、局限性和費(fèi)用等進(jìn)行充分知情。

2.3 ctDNA NGS檢測(cè)用于腫瘤獲得性耐藥機(jī)制分析的價(jià)值

獲得性耐藥是影響腫瘤精準(zhǔn)治療療效的重要因素，也是抗腫瘤藥物臨床應(yīng)用全程管理面臨的最大挑戰(zhàn)。ctDNA NGS檢測(cè)由于自身優(yōu)勢(shì)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤獲得性耐藥分子機(jī)制分析及后續(xù)的用藥指導(dǎo)。如接受奧希替尼治療的晚期NSCLC患者發(fā)生耐藥時(shí)，EGFR基因常檢出新的突變，其中EGFR G796/C797突變占24.7%，EGFR L792突變占10.8%，EGFR L718/G719突變占9.7%［52］?；赾tDNA NGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ALK抑制劑耐藥機(jī)制具有高度異質(zhì)性，如克唑替尼耐藥時(shí)常發(fā)生ALK L1196M、I1171T、D1203N、G1269A/F1174L等繼發(fā)突變，可能存在旁路激活相關(guān)的NRAS G12V、EGFR R108K、PIK3CA E545K等突變；塞瑞替尼耐藥時(shí)常發(fā)生 ALK G1128A、G1202R、G1269A、I1171T/E1210K等繼發(fā)突變，可能存在旁路激活相關(guān)KIT D820E、MET E1012*、EGFR P265_C291del等突變；阿來替尼耐藥時(shí)常發(fā)生ALK G1202R、W1295C、G1202R/L1196M等繼發(fā)突變，可能存在旁路激活相關(guān)EGFR P753S突變；洛拉替尼耐藥時(shí)常發(fā)生ALK G1202R/G1269A繼發(fā)突變，可能存在旁路激活BRAF V600E、MET D1246N等突變［53］。在接受抗EGFR單抗治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，RAS信號(hào)通路中蛋白編碼基因的突變和/或EGFR胞外結(jié)構(gòu)域（extra-cellular domain，ECD）改變可能是導(dǎo)致耐藥的主要分子機(jī)制［54-57］。在胃癌治療中，ctDNA監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)HER2拷貝數(shù)改變提示曲妥珠單抗耐藥性，因此認(rèn)為ctDNA中的HER2拷貝數(shù)可作為監(jiān)測(cè)曲妥珠單抗治療進(jìn)展期胃癌的療效指標(biāo)［58-59］。

腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療獲得性耐藥機(jī)制復(fù)雜，治療選擇壓力下的腫瘤亞克隆演進(jìn)僅為部分原因。在當(dāng)前最活躍的腫瘤轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域中，ctDNA靶向測(cè)序、全外顯子和（或）全基因組檢測(cè)，乃至單細(xì)胞組學(xué)、宏基因組、空間基因組學(xué)等諸多新技術(shù)已開始被應(yīng)用。在阿維魯單抗（avelumab）聯(lián)合EGFR單抗、改良FOLFOX6方案治療微衛(wèi)星穩(wěn)定、RAS/BRAF野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，基于ctDNA NGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)選擇性壓力下會(huì)繼發(fā)PD-L1突變亞克隆演化，少數(shù)患者可出現(xiàn)導(dǎo)致RNA衰減的PD-L1 K162fs突變以及增強(qiáng)蛋白降解的PD-L1 L88S亞克?。?0］。然而，盡管目前的研究顯示基于ctDNA NGS檢測(cè)在探索腫瘤耐藥分子機(jī)制和用藥指導(dǎo)中有一定優(yōu)勢(shì)，尤其可為疑難或復(fù)雜病例的臨床診斷或治療方案制定提供重要參考，但是作為一種新興的技術(shù)手段，尚缺乏足夠的臨床數(shù)據(jù)支撐其在臨床實(shí)踐中常規(guī)應(yīng)用。相信隨著臨床有效性和效用性研究的不斷深入，ctDNA檢測(cè)在腫瘤耐藥方面將發(fā)揮更大的價(jià)值，從而使更多患者獲益。

專家共識(shí)：在臨床環(huán)境中，ctDNA NGS檢測(cè)可用于識(shí)別分子靶向治療的耐藥機(jī)制，尤其對(duì)于疑難復(fù)雜的腫瘤患者，該結(jié)果有助于后續(xù)的治療選擇決策。免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療獲得性耐藥機(jī)制復(fù)雜，治療選擇壓力下的腫瘤亞克隆演進(jìn)僅為其部分原因，ctDNA靶向測(cè)序、全外顯子和（或）全基因組檢測(cè)僅作為其轉(zhuǎn)化研究工具之一。

3 ctDNA NGS檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)

3.1 ctDNA NGS檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室要求

3.1.1 場(chǎng)地要求 應(yīng)嚴(yán)格遵循腫瘤二代測(cè)序?qū)嶒?yàn)室的總體設(shè)計(jì)與要求，強(qiáng)調(diào)“各區(qū)獨(dú)立，注意風(fēng)向，因地制宜，方便工作”原則，配備滿足開展ctDNA NGS測(cè)序項(xiàng)目所需的儀器設(shè)備。若實(shí)驗(yàn)室同時(shí)開展基因組DNA和ctDNA檢測(cè)，應(yīng)設(shè)置不同的樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)，以避免高濃度組織核酸對(duì)低濃度ctDNA的污染。

3.1.2 試劑耗材要求 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)先選擇獲得NMPA三類醫(yī)療器械證的檢測(cè)試劑和配套耗材。若暫時(shí)沒有，可用經(jīng)過性能確認(rèn)的臨床實(shí)驗(yàn)室自建項(xiàng)目（laboratory developed test，LDT）試劑替代。LDT包括以下情況：FDA注冊(cè)或批準(zhǔn)但實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了修改的試劑或檢測(cè)系統(tǒng)；未經(jīng)FDA注冊(cè)或批準(zhǔn)的試劑或檢測(cè)系統(tǒng)；未提供性能指標(biāo)的試劑或檢測(cè)系統(tǒng)。所有LDT試劑耗材在用于檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行性能確認(rèn)，并形成試劑制備和使用的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（standard operating procedure，SOP），報(bào)上級(jí)主管部門備案。實(shí)驗(yàn)室所建立的LDT試劑禁止在本實(shí)驗(yàn)室以外的實(shí)驗(yàn)室使用。每批試劑應(yīng)進(jìn)行質(zhì)檢，并保存相應(yīng)記錄。

3.2 實(shí)驗(yàn)室體系構(gòu)建

3.2.1 檢測(cè)流程與質(zhì)量控制 ctDNA NGS檢測(cè)的建立與優(yōu)化涉及分析前、分析中以及分析后的三個(gè)階段多個(gè)步驟，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理需貫穿ctDNA NGS檢測(cè)的整個(gè)流程。分析前階段包括樣本采集、運(yùn)輸、保存等處理，每個(gè)步驟應(yīng)制定與實(shí)驗(yàn)室實(shí)際操作相符合的SOP，并按照SOP執(zhí)行。分析中階段包括“濕實(shí)驗(yàn)”和“干實(shí)驗(yàn)”兩個(gè)步驟，“濕實(shí)驗(yàn)”包括核酸提取、引物或探針設(shè)計(jì)合成、文庫制備、上機(jī)測(cè)序等步驟，其中文庫制備可選擇雜交捕獲或擴(kuò)增子建庫，該階段的質(zhì)控應(yīng)對(duì)核酸提取中的核酸濃度、純度和片段分布做出相應(yīng)要求并遵照?qǐng)?zhí)行；“干實(shí)驗(yàn)”涵蓋生物信息學(xué)分析流程各步驟，該階段質(zhì)控應(yīng)對(duì)最低測(cè)序深度、平均測(cè)序深度、覆蓋均一性、鳥嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine，GC）含量、堿基識(shí)別質(zhì)量值、比對(duì)質(zhì)量值和在靶率等作出相應(yīng)要求并遵照?qǐng)?zhí)行。分析后階段包括檢測(cè)報(bào)告解讀、分子腫瘤專家委員會(huì)（molecular tumor board，MTB）討論和遺傳咨詢等，該階段應(yīng)制定結(jié)果報(bào)告及解讀SOP，并遵循準(zhǔn)確、及時(shí)和充分的原則。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，建立室內(nèi)質(zhì)量控制，室間質(zhì)量評(píng)價(jià)以及室間比對(duì)等SOP，并遵照?qǐng)?zhí)行。

3.2.2 試劑性能驗(yàn)證或性能確認(rèn) 實(shí)驗(yàn)室使用已獲批的高通量測(cè)序試劑開展臨床檢測(cè)服務(wù)前，必須對(duì)試劑進(jìn)行性能驗(yàn)證。如果實(shí)驗(yàn)室改變已批準(zhǔn)試劑指定的預(yù)期用途、試劑組分、操作流程，則按照LDT試劑要求進(jìn)行管理，臨床檢測(cè)前需對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)（包含人、機(jī)、料、法、環(huán)等）的分析性能進(jìn)行確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立試劑性能確認(rèn)檢測(cè)操作全過程SOP，明確試劑的分析性能指標(biāo)和檢測(cè)局限性。分析性能評(píng)價(jià)指標(biāo)至少應(yīng)包括精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性（包括干擾物質(zhì)）、可報(bào)告范圍。

3.3 樣本收集、處理原則

3.3.1 樣本采集和前處理 建議采用含細(xì)胞穩(wěn)定劑的抗凝管，如Streck采血管等游離核酸專用采血管，實(shí)驗(yàn)室也可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的采血管。根據(jù)檢測(cè)要求采集適量的外周血，一般為10 mL，采血后輕柔顛倒8～10次，使保存液和血液充分混合，避免凝血或溶血發(fā)生［61］。血液離體后應(yīng)盡快送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況制定保存運(yùn)輸時(shí)限及溫度要求。建議采用兩步離心法分離血漿，第一步：2～8℃，1 600～1 900 g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中；第二步：2～8 ℃，16 000～20 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新離心管。分離血漿可直接抽提ctDNA，或保存于-80℃至使用時(shí)，保存過程中應(yīng)避免反復(fù)凍融［62］。

3.3.2 樣本制備與質(zhì)控 臨床上目前常用的cfDNA提取方法有離心柱法和磁珠法，應(yīng)根據(jù)檢測(cè)要求選擇合適的方法。提取的核酸應(yīng)在2～8℃下儲(chǔ)存且不超過24 h；若超過24 h，建議在-30℃至-15℃下儲(chǔ)存，并避免反復(fù)凍融。進(jìn)行文庫制備前，建議采用合適的技術(shù)方法對(duì)獲得的cfDNA總量和片段分布進(jìn)行分析，判斷是否滿足實(shí)驗(yàn)室制定的質(zhì)控要求。若不滿足后續(xù)檢測(cè)需求，應(yīng)采取相應(yīng)措施處理，必要時(shí)重新采集樣本。

專家共識(shí)：ctDNA NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理需貫穿全程，ctDNA收集、樣本處理和自動(dòng)化過程應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)化和臨床驗(yàn)證程序進(jìn)行，最大程度防范因操作差異而引發(fā)的假陰性可能。樣本采集建議采用含細(xì)胞穩(wěn)定劑的抗凝管，盡快完成血漿分離，提取的cfDNA建議在24 h內(nèi)進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，否則，置于-30℃至-15℃下儲(chǔ)存并避免反復(fù)凍融。

3.4 ctDNA NGS檢測(cè)技術(shù)要點(diǎn)

3.4.1 文庫構(gòu)建策略 采用NGS方法進(jìn)行ctDNA檢測(cè)的靶向測(cè)序策略主要分為兩種：基于雜交捕獲的靶向NGS（hybrid capture NGS）和基于擴(kuò)增子的靶向NGS（amplification-based NGS）［63］?；陔s交捕獲的靶向NGS方法是通過捕獲探針與基因組中特定區(qū)域雜交，從而獲得目的區(qū)域的序列并進(jìn)行分析的方法［64］。該方法操作步驟多，過程相對(duì)復(fù)雜，需要1～2 d完成建庫上機(jī)，可以檢測(cè)點(diǎn)突變，小片段的插入缺失和拷貝數(shù)變異，以及DNA層面的基因重排，且可以發(fā)現(xiàn)一些未知融合，檢測(cè)靈敏度可達(dá)95%以上。目標(biāo)序列捕獲法建庫使用的探針設(shè)計(jì)有DNA探針和RNA探針，主要對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行靶向富集，確保樣本目標(biāo)序列完全富集，提高富集效率和覆蓋的均一性，有效降低測(cè)序成本。基于擴(kuò)增子的靶向NGS方法依賴多重PCR擴(kuò)增步驟富集目標(biāo)序列。實(shí)驗(yàn)過程中，基于擴(kuò)增的文庫制備的實(shí)際操作時(shí)間通常比雜交捕獲方法短。對(duì)于基因數(shù)目較少，用藥相關(guān)熱點(diǎn)突變明確的panel可以采用靶向擴(kuò)增子測(cè)序，擴(kuò)增均一性在引物設(shè)計(jì)時(shí)需要優(yōu)化調(diào)試。兩種測(cè)序策略各有優(yōu)劣，實(shí)驗(yàn)室可依據(jù)檢測(cè)的靶向測(cè)序panel大小、基因種類、突變類型及時(shí)效要求等選擇不同測(cè)序策略，并依據(jù)專利技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，從而提升基因文庫的構(gòu)建質(zhì)量和效率。不論采用何種方法，每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目都應(yīng)設(shè)定明確的合格文庫標(biāo)準(zhǔn)［65］，上機(jī)測(cè)序前應(yīng)對(duì)文庫濃度和文庫片段分布進(jìn)行分析，合格的文庫標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括片段是否相對(duì)集中，有無游離接頭，有無接頭二聚體，片段大小是否在推薦文庫片段范圍內(nèi)等內(nèi)容。

3.4.2 分子標(biāo)簽策略 對(duì)于cfDNA樣本的突變檢測(cè)下限期望達(dá)到0.1%甚至更低時(shí)，僅靠增加測(cè)序深度已不足以提升靈敏度，建庫過程PCR結(jié)果引入的錯(cuò)誤和測(cè)序造成的系統(tǒng)誤差都會(huì)增加假陽性結(jié)果。使用分子標(biāo)簽技術(shù)和優(yōu)化對(duì)應(yīng)的生物信息分析設(shè)置，可以過濾由于測(cè)序平臺(tái)隨機(jī)誤差導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度。其原理是在文庫制備過程中，通過添加一段3～8 bp隨機(jī)序列作為分子標(biāo)簽（unique molecular identifier，UMI），該法可以靈敏地識(shí)別PCR重復(fù)片段并校正PCR擴(kuò)增錯(cuò)誤，從而進(jìn)行正確的DNA片段溯源，提供更可靠的突變分析。

3.4.3 參數(shù)確定策略 對(duì)于大多數(shù)實(shí)體惡性腫瘤，血漿中的ctDNA水平較低，突變等位基因分?jǐn)?shù)在晚期轉(zhuǎn)移性疾病中通常低于10%，在局部晚期非轉(zhuǎn)移性疾病中低于1%［66］。ctDNA水平在癌癥早期和治愈性治療后更低，其突變等位基因頻率通常小于0.1%［67-68］。因此，需要高度靈敏的方法檢測(cè)血漿ctDNA。中國腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟（CAGC）建議血漿cfDNA標(biāo)本的NGS有效測(cè)序深度應(yīng)達(dá)到1 000×以上，并應(yīng)在80%以上的目標(biāo)區(qū)域達(dá)到這個(gè)深度，而非所有區(qū)域的平均，否則在區(qū)域間覆蓋波動(dòng)較大的情況下，會(huì)有大量區(qū)域出現(xiàn)覆蓋不夠的情況［69］。肺癌微小病灶殘留定義、檢測(cè)與應(yīng)用中國胸部腫瘤學(xué)專家共識(shí)中指出：采用NGS靶向測(cè)序多基因檢測(cè)panel進(jìn)行MRD檢測(cè)時(shí)，基本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)是可穩(wěn)定檢出豐度≥0.02%的ctDNA。NCCN指南推薦且應(yīng)用相對(duì)成熟的Signatera擴(kuò)增子NGS技術(shù)的平均測(cè)序深度高達(dá)100 000×以上［70］。這也提示早期癌癥檢測(cè)和微小病灶殘留檢測(cè)需要更高的測(cè)序深度。目前檢測(cè)策略眾多，不同策略對(duì)測(cè)序深度和廣度的標(biāo)準(zhǔn)也有待進(jìn)一步的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。

3.4.4 測(cè)序平臺(tái)選擇 目前使用較多的NGS測(cè)序平臺(tái)是因美納（Illumina）、華大智造（MGI）和賽默飛（Thermo fisher）平臺(tái)。盡管技術(shù)性能相似，但平臺(tái)之間DNA投入要求、試劑成本、運(yùn)行時(shí)間和讀取長度等均存在差異。Illumina平臺(tái)高通用性和可擴(kuò)展性高，可對(duì)不同大小靶向測(cè)序panel進(jìn)行靈活分析。同時(shí)也需要更高的DNA和RNA投入，測(cè)序時(shí)間長，測(cè)序成本高，需要更全面的生物信息學(xué)支持。MGI平臺(tái)在有高通用性和可擴(kuò)展性的同時(shí)，還具有測(cè)序重復(fù)率低、有效數(shù)據(jù)利用率高、測(cè)序速度快、測(cè)序成本相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì)，尤其適合用于需要高數(shù)據(jù)量的ctDNA檢測(cè)。Thermo fisher平臺(tái)通量小、測(cè)序時(shí)間短、測(cè)序成本低，同時(shí)配備內(nèi)置生物信息學(xué)分析流程，便于數(shù)據(jù)自動(dòng)化分析［71］?？傊鬁y(cè)序平臺(tái)各有優(yōu)劣，不同實(shí)驗(yàn)室可以依據(jù)樣本量、測(cè)序數(shù)據(jù)量以及時(shí)效要求等選擇相應(yīng)的測(cè)序平臺(tái)。

3.5 生信方法要求

3.5.1 基于分子標(biāo)簽技術(shù)的數(shù)據(jù)質(zhì)控和數(shù)據(jù)分析 ctDNA檢測(cè)常出現(xiàn)PCR重復(fù)序列比例高（50%～90%）、PCR擴(kuò)增和測(cè)序錯(cuò)誤等引入的背景噪音高等問題。同時(shí)，血液中白細(xì)胞的克隆性造血突變也影響ctDNA變異的鑒定?；诜肿訕?biāo)簽技術(shù)的分析流程可幫助有效去除背景噪音，配對(duì)白細(xì)胞樣本或背景庫的建立可有效去除來自白細(xì)胞中克隆性造血突變引入的假陽性，提升ctDNA檢測(cè)的準(zhǔn)確性。UMI通過給每一條原始DNA片段加上一段特有的標(biāo)簽序列，經(jīng)文庫構(gòu)建和PCR擴(kuò)增后一同測(cè)序，根據(jù)不同的標(biāo)簽序列可以區(qū)分不同來源的DNA模板，分辨源于PCR擴(kuò)增及測(cè)序過程中隨機(jī)錯(cuò)誤產(chǎn)生的假陽性突變，識(shí)別cfDNA中真正來源于腫瘤的突變，從而提高檢測(cè)靈敏度和特異性，可達(dá)0.1%的檢出限［71］。一般推薦1條UMI對(duì)應(yīng)并至少3條reads。

3.5.2 測(cè)序噪音控制 建立背景庫過濾噪聲的大致思路是通過使用相同測(cè)序流程的樣本估計(jì)基因組坐標(biāo)對(duì)應(yīng)區(qū)域或堿基的測(cè)序錯(cuò)誤率，然后使用假設(shè)檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)方法比較目標(biāo)樣本對(duì)應(yīng)坐標(biāo)的突變頻率是否顯著高于估計(jì)得出的測(cè)序錯(cuò)誤率。通過對(duì)患者腫瘤樣本建立背景庫過濾噪聲的常用方法有SiNVICT和OutLyzer。SiNVICT使用腫瘤樣本計(jì)算出一段基因組區(qū)域的噪音水平，通過計(jì)算信噪比的方法過濾潛在的假陽性結(jié)果［72］。OutLyzer通過計(jì)算目標(biāo)突變附近200 bp內(nèi)的每個(gè)坐標(biāo)的測(cè)序錯(cuò)誤率，并通過多次Thompson’s Tau Test過濾離群噪聲［73］。在可用樣本較為充足的情況下，使用多個(gè)患者的正常樣本建立背景庫能較準(zhǔn)確地估計(jì)噪聲水平。其中代表方法有Mutect1/Mutect2（GATK）［74］，該法使用不少于40個(gè)沒有腫瘤細(xì)胞污染的正常樣本構(gòu)建背景庫。在此基礎(chǔ)上發(fā)展的基于不同算法的構(gòu)建背景庫算法，如基于二項(xiàng)分布的TNER、基于高斯分布模擬的IDES［75］、基于泊松分布的AmpliSolve［76］等，均可有效提升突變檢出準(zhǔn)確率和召回率，去除背景噪音。

3.5.3 克隆性造血變異過濾 RAZAVI等［77］發(fā)現(xiàn)ctDNA存在大量未知來源的基因變異（variants of unknown source，VUSo），大部分VUSo突變豐度＜1%，與樣本測(cè)序深度、DNA起始量、位點(diǎn)的測(cè)序深度、樣本染色體拷貝數(shù)無相關(guān)性，且有很好的重復(fù)性結(jié)果。在白細(xì)胞樣本中也檢測(cè)到大量的VUSo，且與年齡呈正相關(guān)，證實(shí)了ctDNA中的大部分VUSo來自白細(xì)胞，并非來源于測(cè)序背景噪音，這部分VUSo突變被定義為克隆性造血突變。因此，在不同ctDNA高通量測(cè)序臨床應(yīng)用場(chǎng)景，需要考慮ctDNA中包含有源于白細(xì)胞的克隆性造血突變。ctDNA檢測(cè)時(shí)通過配對(duì)的白細(xì)胞樣本，或者匯集整合檢測(cè)到的克隆性造血突變，構(gòu)建克隆性造血突變背景庫，可有效幫助去除克隆性造血造成的假陽性。

3.5.4 數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存與管理 隨著測(cè)序深度的增加，ctDNA下機(jī)數(shù)據(jù)有效安全的儲(chǔ)存需要配備相應(yīng)的基礎(chǔ)設(shè)施。高通量測(cè)序會(huì)生成大量文件，下機(jī)的fastq或bam原始文件、vcf結(jié)果文件等需長期保存，同時(shí)應(yīng)保存好測(cè)序過程中完整的日志文件，以便區(qū)分高通量測(cè)序分析軟件版本信息、追溯異常結(jié)果。診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存相關(guān)數(shù)據(jù)至少3年，并在相關(guān)技術(shù)人員的支持下制定數(shù)據(jù)備份計(jì)劃和恢復(fù)計(jì)劃。

專家共識(shí)：ctDNA NGS檢測(cè)應(yīng)根據(jù)項(xiàng)目需求選擇技術(shù)路線，可依據(jù)檢測(cè)基因數(shù)量及覆蓋范圍大小選擇不同測(cè)序策略。在進(jìn)行基于ctDNA的超高靈敏度突變檢測(cè)時(shí)，建議使用分子標(biāo)簽技術(shù)和優(yōu)化對(duì)應(yīng)的生物信息分析設(shè)置，以降低由于測(cè)序平臺(tái)隨機(jī)誤差導(dǎo)致的假陽性結(jié)果；建議通過建立測(cè)序噪音和克隆性造血背景庫的方法降低克隆性造血及背景噪音帶來的影響。

3.6 報(bào)告要求

3.6.1 專業(yè)團(tuán)隊(duì)建設(shè) 實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人應(yīng)具有臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)背景、分子生物學(xué)相關(guān)工作經(jīng)歷、副高級(jí)以上專業(yè)技術(shù)職稱。主要報(bào)告簽發(fā)人員應(yīng)具備臨床醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)等多種專業(yè)背景，了解腫瘤的臨床治療指南以及臨床試驗(yàn)最新進(jìn)展，最好具有2年及以上腫瘤組織多基因NGS檢測(cè)分析工作經(jīng)歷。報(bào)告如涉及基因胚系變異分類與臨床意義闡釋，建議結(jié)合臨床遺傳咨詢同步開展。旨在進(jìn)行ctDNA NGS檢測(cè)全面分析與復(fù)雜臨床場(chǎng)景應(yīng)用的機(jī)構(gòu)，鼓勵(lì)建立由多學(xué)科專家組成的MTB。

3.6.2 報(bào)告內(nèi)容 ctDNA NGS檢測(cè)的臨床報(bào)告應(yīng)包含以下內(nèi)容：⑴受檢者的基本信息。應(yīng)明確包含受檢者姓名、性別、出生日期或年齡、接受檢測(cè)的日期、檢測(cè)的目的（需要明確疾病發(fā)病狀態(tài)或攜帶者狀態(tài)）和受檢者的臨床指征（應(yīng)至少包含疾病的診斷或初步診斷）等。⑵樣本信息。每份樣本應(yīng)有唯一標(biāo)識(shí)，注明樣本類型、采集時(shí)間、采集部位、送檢時(shí)間、檢測(cè)報(bào)告時(shí)間和樣本主要質(zhì)控情況（如DNA質(zhì)量評(píng)估以及測(cè)序質(zhì)量評(píng)估等）。⑶實(shí)驗(yàn)室信息。包括實(shí)驗(yàn)室名稱、實(shí)驗(yàn)操作人員、報(bào)告審核人員、聯(lián)系方式。⑷檢測(cè)項(xiàng)目。包括基因panel的檢測(cè)位點(diǎn)及檢測(cè)范圍、檢測(cè)儀器、檢測(cè)試劑，是否為NMPA批準(zhǔn)使用的檢測(cè)試劑以及NMPA獲批的基因位點(diǎn)信息，或LDT試劑、檢測(cè)方法、檢測(cè)下限等。⑸檢測(cè)結(jié)果及變異解讀。對(duì)基因變異的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行解讀，如檢出的基因型、變異結(jié)果、染色體變化情況、檢測(cè)結(jié)果的致病性分級(jí)、藥物信息及臨床意義、變異解讀引用的參考文獻(xiàn)等；對(duì)于多次檢測(cè)的患者，報(bào)告需要體現(xiàn)既往檢測(cè)結(jié)果，并綜合解讀本次檢測(cè)結(jié)果。⑹標(biāo)注檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果，檢測(cè)局限性及不確定性，以及進(jìn)一步檢測(cè)的建議［78］。

3.6.3 變異結(jié)果的命名規(guī)則 對(duì)基因變異的描述應(yīng)遵循一定的原則和規(guī)范，推薦參考人類基因組變異協(xié)會(huì)命名指南（www.hgvs.org，登錄日期2022年6月22日），轉(zhuǎn)錄本的選擇建議采用基因座參考基因組序列數(shù)據(jù)庫（Locus reference genomic；www.lrg-sequence.org，登錄日期2022年6月22日）界定的轉(zhuǎn)錄本或多個(gè)國際數(shù)據(jù)庫公認(rèn)的主要轉(zhuǎn)錄本。對(duì)遺傳性腫瘤相關(guān)基因變異的說明，建議以美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)院（American college of medical genetics and genomics）指南為標(biāo)準(zhǔn)，在檢測(cè)結(jié)果中列出具體的變異位點(diǎn)信息，包括基因名稱、所參考的人類基因組版本號(hào)、轉(zhuǎn)錄本參考序列版本號(hào)、核苷酸變異、氨基酸變異、外顯子/內(nèi)含子序號(hào)、等位基因雜合性、染色體編號(hào)及坐標(biāo)等［79］。

3.6.4 指導(dǎo)用藥的循證分級(jí)規(guī)范 對(duì)于腫瘤體細(xì)胞突變的臨床意義解讀，建議依據(jù)伴隨診斷、臨床指南、數(shù)據(jù)庫或文獻(xiàn)證據(jù)進(jìn)行分級(jí)，可以將腫瘤體細(xì)胞基因突變分為臨床意義明確（Ⅰ級(jí)）、有潛在臨床意義（Ⅱ級(jí)）、臨床意義不明確（Ⅲ級(jí)）和良性或可能良性突變（Ⅳ級(jí)）。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立突變臨床意義分類及分級(jí)和報(bào)告的SOP，且SOP應(yīng)至少包括以下兩個(gè)方面：⑴對(duì)體細(xì)胞基因突變進(jìn)行分級(jí)的流程;⑵明確報(bào)告中應(yīng)包含哪一級(jí)或哪幾級(jí)突變位點(diǎn)。分級(jí)的流程應(yīng)有記錄，包括證據(jù)來源的指南、文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫、證據(jù)等級(jí)、分級(jí)結(jié)果等。臨床證據(jù)決定突變位點(diǎn)分級(jí)，可參考AMP、ASCO、CAP聯(lián)合發(fā)布的腫瘤樣本測(cè)序突變解讀共識(shí)［80］。

對(duì)胚系突變的臨床意義解讀，可參考中外診療指南及重要參考文獻(xiàn)，Online mendelian inheritance in man（https：//omim.org，登錄日期2022年6月22日）和美國ACMG指南等資源。目前，對(duì)于胚系突變分級(jí)主要參考ACMG指南，其將變異位點(diǎn)致病性等級(jí)分為致病、疑似致病、臨床意義未明、疑似良性和良性等5個(gè)等級(jí)。報(bào)告中應(yīng)列出與遺傳性腫瘤（如遺傳性乳腺癌/卵巢癌綜合征、Lynch綜合征等）相關(guān)的致病以及疑似致病變異，并對(duì)變異的致病性進(jìn)行分析解讀［79］。對(duì)于意義不明位點(diǎn)的處理，實(shí)驗(yàn)室需制定相關(guān)政策，確定是否報(bào)告臨床意義不明的位點(diǎn)，并附上說明和參考數(shù)據(jù)庫，并且要在報(bào)告中注明本實(shí)驗(yàn)室出具臨床報(bào)告的規(guī)則。

3.6.5 其他檢測(cè)方法的結(jié)果驗(yàn)證 對(duì)血液樣本進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)時(shí)如出現(xiàn)較低豐度的突變結(jié)果（通常血液樣本低于檢測(cè)下限）時(shí)，建議綜合評(píng)估高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)平臺(tái)性能、測(cè)序深度以及腫瘤細(xì)胞比例等因素。特別對(duì)于靶向治療相關(guān)的基因，建議使用其他檢測(cè)方法進(jìn)一步驗(yàn)證確認(rèn)，如數(shù)字PCR等方法。

3.6.6 檢測(cè)局限性聲明 外周血中ctDNA含量不足，由于受檢者攜帶的突變可能沒有包含在檢測(cè)基因譜中等原因，檢測(cè)可能存在假陰性結(jié)果。如果血漿檢測(cè)結(jié)果為陰性，必要時(shí)仍需采用其他類型樣本進(jìn)行驗(yàn)證。另外，由于大多數(shù)基于ctDNA NGS未配對(duì)檢測(cè)白細(xì)胞，如果存在胚系變異或由克隆性造血引起的體細(xì)胞突變，也可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果［81］，因此在結(jié)果報(bào)告中應(yīng)對(duì)ctDNA的檢測(cè)基因范圍、檢測(cè)方法和檢測(cè)下限等重要性能指標(biāo)進(jìn)行說明。當(dāng)通過ctDNA NGS檢測(cè)進(jìn)行靶向用藥指導(dǎo)或遺傳性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，其評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)綜合考慮驅(qū)動(dòng)分子事件、臨床治療因素以及分析篩選策略。ctDNA NGS臨床檢測(cè)報(bào)告的解讀對(duì)腫瘤患者預(yù)后、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、用藥指導(dǎo)具有重要的參考價(jià)值。因此，報(bào)告應(yīng)該明確、簡潔、準(zhǔn)確，并具有充分的解讀、可信性和權(quán)威性。

專家共識(shí)：ctDNA NGS臨床檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包含受檢者基本信息、樣本信息、實(shí)驗(yàn)室信息、檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)結(jié)果及變異解讀、檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果、檢測(cè)局限性及不確定性以及進(jìn)一步檢測(cè)的建議等內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立報(bào)告SOP，建議根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)、共識(shí)指南、臨床試驗(yàn)證據(jù)和實(shí)踐對(duì)檢出的腫瘤基因突變進(jìn)行分類或分級(jí)報(bào)告。

4 ctDNA NGS檢測(cè)臨床應(yīng)用展望

目前已有部分基于基因變異信息的復(fù)合預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑和分子靶向治療療效，從而對(duì)患者進(jìn)行分層，如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）和腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）。臨床研究表明基于ctDNA NGS檢測(cè)的bMSI（blood MSI）和bTMB（blood TMB）具有免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效預(yù)測(cè)價(jià)值［35］。FDA于2020年8月26日批準(zhǔn)基于ctDNA NGS數(shù)據(jù)擬合bMSI和bTMB的試劑盒用于泛實(shí)體瘤多個(gè)靶向藥物及免疫檢查點(diǎn)抑制劑的伴隨診斷。但bMSI和bTMB在臨床應(yīng)用中受多種因素影響，如樣本采集時(shí)間、檢測(cè)panel基因覆蓋范圍、panel大小、測(cè)序深度、生信算法及閾值設(shè)定等，因此還需要更多的前瞻性臨床研究證據(jù)支持ctDNA NGS數(shù)據(jù)擬合的bMSI和bTMB的臨床應(yīng)用前景。

同源重組修復(fù)缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）檢測(cè)在聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑和鉑類藥物敏感性預(yù)測(cè)及腫瘤易感性評(píng)估中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值［82］。HRD狀態(tài)可通過同源重組相關(guān)基因突變（homologous recombination repair，HRR）檢測(cè)和基因瘢痕（genomic scar，GS）檢測(cè)兩種方式判斷。目前僅有兩種組織檢測(cè)試劑Myriad MyChoice?CDx以及Foundation FocusTMCDx BRCA LOH獲得FDA批準(zhǔn)用于伴隨診斷及補(bǔ)充診斷。兩者均采用HRR聯(lián)合GS檢測(cè)策略評(píng)估HRD狀態(tài)。由于基于ctDNA NGS對(duì)GS進(jìn)行評(píng)估技術(shù)上具有巨大挑戰(zhàn)，所以目前基于ctDNA NGS檢測(cè)進(jìn)行HRD評(píng)估主要集中在HRR信號(hào)通路基因SNP檢測(cè)，但國內(nèi)外對(duì)HRR基因的定義尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；另外，隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，基于ctDNA NGS評(píng)估GS逐漸成為可能，但目前基于ctDNA NGS檢測(cè)評(píng)估HRD尚有巨大的探索空間。

ctDNA中包含核酸序列、位點(diǎn)突變、拷貝數(shù)、甲基化、MSI、序列長度、序列豐度、出現(xiàn)的時(shí)空模式、在基因組上的位置特征、起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)特征等豐富的生物信息，如腫瘤cfDNA片段的長度分布、核小體位置與正常細(xì)胞顯著不同，這些信息可應(yīng)用于腫瘤篩查和診斷中［83］。為了更好地整合多源異質(zhì)信息，更全面描繪腫瘤生物特征，大幅提高ctDNA數(shù)據(jù)的效力，機(jī)器學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)等人工智能算法也被大量應(yīng)用到腫瘤的篩查和診斷中。CancerSEEK的癌癥早篩項(xiàng)目通過監(jiān)測(cè)ctDNA中16個(gè)基因的突變及血清8個(gè)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物水平，并構(gòu)建Logistic回歸模型，結(jié)果該模型在8種腫瘤共包含1 005例患者中的敏感性為69%～98%，特異性為99%［84］。最新的應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)分類器輔助的深度甲基化測(cè)序能檢測(cè)到52%～81%臨床分期為ⅠA～Ⅲ期的患者，且檢測(cè)限低至萬分之一，顯示了更高的敏感性和特異性（特異性為96%，95%CI：93%～98%）［85］。

總之，基于ctDNA NGS檢測(cè)的bTMB具有免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效預(yù)測(cè)價(jià)值，但仍有諸多因素影響bTMB檢測(cè)在臨床中的應(yīng)用，未來還需開展更多的前瞻性臨床研究。機(jī)器學(xué)習(xí)等人工智能算法不僅能降低假陽性、提高靈敏度，還能有效整合多維度的異質(zhì)信息進(jìn)行全面分析，大幅提高ctDNA數(shù)據(jù)效力，是ctDNA數(shù)據(jù)分析的主要方向。

利益沖突聲明：本共識(shí)由專家組內(nèi)部成員針對(duì)性討論得出，專家組編寫過程中未接受生物醫(yī)藥公司任何形式的贊助，所有專家組成員均聲明不存在利益沖突。

共識(shí)編寫專家委員會(huì)

學(xué)術(shù)顧問（按姓氏拼音排列）

步 宏 四川大學(xué)華西醫(yī)院

邢金良 空軍軍醫(yī)大學(xué)

吳 斌 重慶市中醫(yī)院

編寫組長（按姓氏拼音排列）

輦偉奇 重慶市中醫(yī)院

于津浦 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院

袁響林 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院

張海偉 重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

主要執(zhí)筆專家（按姓氏拼音排列）

蔡 明 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

程 俊 重慶市中醫(yī)院

申 鵬 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院

唐萬燕 重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

嚴(yán)令華 上海桐樹生物科技有限公司

尤 俊 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院

張 哲 廣州燃石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司

趙偉鵬 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院

編寫組專家（按姓氏拼音排列）

白 莉 中國人民解放軍總醫(yī)院

步 宏 四川大學(xué)華西醫(yī)院

蔡 明 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

曹小飛 廣州市第一人民醫(yī)院

程 俊 重慶市中醫(yī)院

陳 銳 重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

陳 威 北京芯高地生物科技有限公司

戴曉芳 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

鄧 昆 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院

高婭文 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院

郭 昊 南京先聲醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司

李炘正 山西省腫瘤醫(yī)院

梁志欣 解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心

林曉鋼 重慶大學(xué)光電工程學(xué)院

劉華文 重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院

劉 沛 北京起源聚禾生物科技有限公司

呂 鋼 重慶市中醫(yī)院

馬 杰 河南省腫瘤醫(yī)院

馬 鑫 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心

倪 夢(mèng) 深圳華大基因股份有限公司

輦偉奇 重慶市中醫(yī)院

聶廣杰 南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院

邱李輝 上海桐樹生物科技有限公司

全雪萍 上海桐樹生物科技有限公司

單光宇 北京優(yōu)迅醫(yī)療器械有限公司

申 鵬 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院

蘇春霞 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院

孫建國 陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院

唐萬燕 重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

唐雪峰 重慶市人民醫(yī)院

王晚萍 山西省長治市人民醫(yī)院

王宏偉 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心

王懷碧 重慶市中醫(yī)院

王秋實(shí) 陸軍特色醫(yī)學(xué)中心

吳 斌 重慶市中醫(yī)院

夏超然 浙江紹興鼎晶生物醫(yī)藥科技股份公司

邢金良 空軍軍醫(yī)大學(xué)

徐 華 重慶市中醫(yī)院

應(yīng)斌武 四川大學(xué)華西醫(yī)院

嚴(yán)令華 上海桐樹生物科技有限公司

尤 俊 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院

于津浦 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院

余秋波 重慶醫(yī)科大學(xué)

袁響林 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院

袁 睿 重慶大學(xué)醫(yī)學(xué)部

張海偉 重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

張 瓊 重慶市中醫(yī)院

張 翼 北京優(yōu)樂復(fù)生醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司

張 哲 廣州燃石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司

趙偉鵬 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院

趙雪琴 臨汾市人民醫(yī)院

趙 征 陜西省腫瘤醫(yī)院

鄭曉東 重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

周 進(jìn) 四川省腫瘤醫(yī)院

周一鳴 角井（北京）生物技術(shù)有限公司

朱師達(dá) 深圳華大基因股份有限公司