徐凱文，廖 帆，雷 磊，譚 磊

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

豬偽狂犬?。╬seudorabies, PR）是由豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）感染所致。盡管近年來(lái)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)對(duì)豬偽狂犬病防控取得諸多進(jìn)展，但目前該病在全國(guó)各地仍廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。不同發(fā)育階段豬群感染豬偽狂犬病所表現(xiàn)的臨床癥狀差異較大，但該病對(duì)仔豬和妊娠母豬危害最大，可導(dǎo)致仔豬腹瀉、嘔吐和神經(jīng)癥狀等；而妊娠母豬則出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等癥狀[1]。隨著PRV在我國(guó)豬場(chǎng)廣泛流行，該病原接觸其他動(dòng)物甚至是人類(lèi)的幾率也相應(yīng)提高，由此引發(fā)動(dòng)物或人類(lèi)感染豬偽狂犬病的報(bào)道也受到廣泛關(guān)注[2]。特別是2020年我國(guó)科研人員首次從感染急性腦炎患者腦脊液中成功分離到一株P(guān)RV變異株，這證實(shí)了PRV可由豬向人進(jìn)行跨物種傳播[3]。

PRV屬于雙鏈DNA病毒，其基因組大小約143 kbp，可編碼超過(guò)70個(gè)蛋白。其中部分蛋白與PRV毒力密切相關(guān)，如gE、gI和TK等，缺失毒力相關(guān)基因（如gE）不影響毒株的免疫原性，但會(huì)降低毒力。目前國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用的PRV疫苗（弱毒疫苗和滅活疫苗）均已將gE等基因（如gE、TK）缺失，得益于此，靶向gE基因序列或抗體設(shè)計(jì)的分子生物學(xué)診斷方法或血清學(xué)診斷方法可有效區(qū)分PRV野毒感染和疫苗免疫豬群[2]。為了解當(dāng)前湖南省PRV野毒流行情況，建立一種特異性好、靈敏度高且可操作性強(qiáng)的PRV-gE SYBR Green I 熒光定量PCR檢測(cè)方法，為PRV的早期診斷與防控提供了有效的方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

pUCmT載體、DL 2 000 DNA Marker和2×PCR easy mix等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶（EcoR I和BamH I）、T4連接酶等購(gòu)自于賽默飛有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自于北京金沙生物技術(shù)有限公司；電泳緩沖液及瓊脂粉等購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司；DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自于AXYGEN公司；DNA凝膠回收及質(zhì)粒提取試劑盒均為美國(guó)OMEGA Biotek公司產(chǎn)品。

2021年7—10月15份疑似PRV感染病料（腦組織、淋巴結(jié)和扁桃體等）保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物疫病防控與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)室；PRV、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒3型（PCV3）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）核酸保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物疫病防控與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 從NCBI網(wǎng)站下載多條PRV gE基因序列，利用DNA Star設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物，PRV-gE-F：5'-CGGACGCACATGCTCTC TCCG-3'；PRV-gE-R:5'-GGTTGGCGGTCACG CCATAG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為300 bp。其后根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)qPCR引物，qPCR-PRV-gE-F：5'-GACCCCGAGGACGAGTTCA-3'；qPCR-PRV-gE-R：5'-ACGCCATAGTTGGGTCCATT-3'。以上引物均由長(zhǎng)沙擎科生物有限公司合成。

1.2.2 陽(yáng)性質(zhì)粒制備 根據(jù)DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取PRV病毒基因組，其后以PRV-gE-F和PRV-gE-R為引物擴(kuò)增目的片段。凝膠回收PCR產(chǎn)物后將其克隆至pUCm-T載體，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑菌和質(zhì)粒提取，最后通過(guò)酶切驗(yàn)證后將陽(yáng)性質(zhì)粒送至長(zhǎng)沙擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒濃度，以此確定質(zhì)粒濃度為4.545×1010拷貝/μL，其后將其進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?.545×10-1～4.545×109拷貝/μL共11個(gè)稀釋度質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 PRV-gE熒光定量PCR方法建立 選取濃度為4.545×104～4.545×109拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其反應(yīng)體系為10.0 μL，包括5.0 μL 2×SYBR Green mix、上下游引物（10 pmoL）各0.2 μL、質(zhì)粒模板1.0 μL及無(wú)RNA酶水3.6 μL，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，并設(shè)置陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為95 ℃5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30s，72 ℃ 15 s，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 選取濃度為4.545×10-1～4.545×106拷貝/μL，每個(gè)濃度樣品重復(fù)3次，每次檢測(cè)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)的陰性對(duì)照，陰性模板為無(wú)RNA酶水，進(jìn)行熒光定量PCR檢驗(yàn)，以確定該方法的最低檢測(cè)濃度。同時(shí)以常規(guī)PCR對(duì)質(zhì)粒模板進(jìn)行擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，比較兩種檢測(cè)方法的靈敏度。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 以PCV2、PPV（豬細(xì)小病毒）、PCV3、PRV、PEDV、TGEV和PRRSV基因組進(jìn)行特異性試驗(yàn)。每個(gè)樣品3次重復(fù)，并設(shè)置陰性對(duì)照，用所建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，確定其特異性。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 選取3個(gè)稀釋度（104拷貝/μL、105拷貝/μL、106拷貝/μL）作為模板，進(jìn)行3次批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)Ct值進(jìn)行分析，用以評(píng)價(jià)所建立的PRV熒光定量PCR檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。

1.3 檢測(cè)方法初步應(yīng)用

選擇15份臨床疑似PR組織樣品，使用DNA/RNA基因組提取試劑盒提取基因組DNA，分別用本文建立的熒光定量PCR方法和普通PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)與分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證

應(yīng)用PRV-gE-F和PRV-gE-R為引物擴(kuò)增目的片段，其后將目的片段膠回收并連接至pUCmT載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取和雙酶切，取酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。結(jié)果如圖1所示，酶切后質(zhì)粒凝膠電泳后可出現(xiàn)2條帶，分別為載體本身?xiàng)l帶（2 800 bp）和目的片段條帶（300 bp），與預(yù)期結(jié)果相符，證明標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 質(zhì)粒雙酶切核酸凝膠電泳

2.2 靶向PRV-gE熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

將陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序并確定序列正確，其后將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行1 0倍梯度稀釋。選擇4.545×104～4.545×109拷貝/μL 6個(gè)濃度作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。結(jié)果如圖2所示，PRV質(zhì)粒濃度與對(duì)應(yīng)的CT值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系：Lg（DNA拷貝/μL）=-0.321x+10.87 （x代表拷貝數(shù)），R2=0.994，E=109.509%。且PRV-gE擴(kuò)增溶解曲線峰值單一，其溶解溫度約90 ℃。

圖2 PRV-gE熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 靶向PRV-gE熒光定量PCR靈敏性測(cè)定

將所構(gòu)建的PRV gE標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒10倍梯度稀釋?zhuān)x取4.545×10-1～4.545×106拷貝/μL進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。如圖3可見(jiàn)，此方法對(duì)4.545拷貝/μL可擴(kuò)增出特異性曲線，具有較高的靈敏性（圖3左）。而PCR反應(yīng)靈敏度僅為4.545×102拷貝/μL（圖3右），說(shuō)明本研究所建立的熒光定量PCR法較傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)靈敏度高近100倍。

圖3 靶向PRV-gE熒光定量PCR（左）和傳統(tǒng)PCR（右）靈敏性測(cè)定結(jié)果

2.4 靶向PRV-gE熒光定量PCR特異性測(cè)定

為探究本文建立檢測(cè)方法的特異性，使用PCV2、PPV、PCV3、PEDV、PRV、TGEV和PRRSV基因組模板為參照，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（已知PRV基因組）和陰性對(duì)照（無(wú)RNA酶水）。結(jié)果如圖4所示，該方法僅對(duì)PRV基因組擴(kuò)增出特異性曲線，陰性對(duì)照及其他病毒基因組均無(wú)特異性擴(kuò)增曲線，表明此方法具有良好的特異性。

圖4 靶向PRV-gE熒光定量PCR法檢測(cè)不同病毒擴(kuò)增曲線結(jié)果

2.5 靶向PRV-gE熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍比稀釋?zhuān)x取不同濃度質(zhì)粒（104拷貝/μL、105拷貝/μL和106拷貝/μL）進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)模板重復(fù)3個(gè)孔，不同時(shí)間進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，分析組內(nèi)及組間數(shù)據(jù)。結(jié)果如表1所示，所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)方差均低于0.5，變異系數(shù)整體低于2%，說(shuō)明所建立的方法具有較好的穩(wěn)定性及重復(fù)性。

表1 偽狂犬病病毒批內(nèi)重復(fù)結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

選擇湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物疫病防控與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)室保存的15份疑似感染PR臨床組織樣品，對(duì)樣品提取基因組后分別使用本文建立的熒光定量PCR和傳統(tǒng)PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針對(duì)PRV gE基因設(shè)計(jì)的熒光定量 PCR檢測(cè)方法共確定3份樣品為PRV gE陽(yáng)性，其陽(yáng)性率為20.0%（3/15）；而普通PCR法只能確定2份樣品為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為13.33%（2/15），說(shuō)明熒光定量PCR法在臨床檢測(cè)上較傳統(tǒng)PCR法更為靈敏，更加適合于疾病監(jiān)測(cè)。

3 討論

當(dāng)前豬偽狂犬病在全世界仍然廣泛流行，其為危害世界養(yǎng)豬業(yè)（尤其是我國(guó)）的重要病原之一。得益于PRV-gE基因缺失疫苗（弱毒疫苗和滅活疫苗）的廣泛應(yīng)用，靶向gE抗體或基因序列的診斷方法可有效區(qū)分疫苗免疫接種豬群和PRV野毒感染豬群。疫苗接種只能避免豬群發(fā)生PR，卻不能清除潛伏感染的病毒和阻止病毒重新激活[4]。因此，建立一種快速、便捷、準(zhǔn)確且靈敏度高的檢測(cè)方法對(duì)于PRV感染早期診斷具有重要意義[5-6]。

相比于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，熒光定量PCR法具有便捷、快速和靈敏等優(yōu)勢(shì)，且無(wú)需電泳，這不但節(jié)省時(shí)間，且避免環(huán)境污染和降低對(duì)人員健康危害[5]。本文基于SYBR Green I所建立的靶向PRV-gE熒光定量PCR法靈敏度為4.545拷貝/μL，其靈敏度與已報(bào)道的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法一致，但其較傳統(tǒng)PCR靈敏度高近100倍，且特異性和重復(fù)性良好。此外，將本方法和傳統(tǒng)PCR對(duì)15份疑似PR的病料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其檢出率較傳統(tǒng)PCR高，分別為20.0%（3/15）和13.33%（2/15），說(shuō)明該方法較傳統(tǒng)PCR具有更高的靈敏性，可以用于偽狂犬病的早期診斷和定量等方面。