王大林，劉永剛，李昌武，謝式云，廖 柱

（1.羅牛山股份有限公司，海南 ?？?570125；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650000；3.海南羅牛山畜牧有限公司，海南 ?？?570100）

在我國畜牧生產(chǎn)中，豬的養(yǎng)殖生產(chǎn)占有重要地位，豬產(chǎn)仔數(shù)對商品豬生產(chǎn)的意義不言而喻。因此，發(fā)掘及篩選長大二元母豬高產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的基因及分子標(biāo)記，并積極用這些基因或分子標(biāo)記，以促進(jìn)養(yǎng)豬生產(chǎn)，提升經(jīng)濟(jì)效益具有重要的意義。DIS3L2（DIS3 Like 3'-5' Exoribonuclease 2，DIS3 3'-5'外切核糖核酸酶2），是一種高度保守的3'-5'外切核糖核酸酶[1]，DIS3L2在RNA代謝中起到關(guān)鍵作用，并參與多種生物學(xué)和生理過程，如細(xì)胞分裂、增殖、分化和凋亡[2-3]。Ching-Jung等[4]的研究表明，DIS3L2的損失完全阻斷了雄性果蠅的精子發(fā)生，導(dǎo)致雄性不育，同時揭示了異常的基因表達(dá)程序，并表明非編碼RNA可能優(yōu)先受到DIS3L2的影響。但截至目前，大多關(guān)于DIS3L2的研究是關(guān)于人類Perlman（帕爾曼）綜合征，其主要表征為胎兒羊水過多、巨大兒、獨(dú)特面部外觀等[5]，造成該疾病具有此臨床特征的主要原因是由RNA代謝紊亂引起的，雖然DIS3L2的確切靶標(biāo)尚未被表征，但在細(xì)胞模型中已經(jīng)確認(rèn)DIS3L2低表達(dá)與細(xì)胞生長和分裂過程中出現(xiàn)異常有關(guān)[6-8]。目前還未見關(guān)于利用豬DIS3L2基因作為長大的二元母豬產(chǎn)仔數(shù)的遺傳標(biāo)記來進(jìn)行長大二元母豬產(chǎn)仔數(shù)標(biāo)記輔助選育的報道。本文為確定DIS3L2基因PCR-TaqI-RFLP多態(tài)性位點(diǎn)與長大的二元母豬產(chǎn)仔數(shù)差異是否相關(guān)，建立的PCR-TaqI-RFLP方法進(jìn)行多態(tài)性檢測，以分析豬不同基因型與總胎次活產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)關(guān)系。

1 研究目的

探明DIS3L2基因與長大母豬的總胎次產(chǎn)仔數(shù)是否存在關(guān)聯(lián)，探明DIS3L2基因與長大母豬的總胎次活仔數(shù)是否存在關(guān)聯(lián)。試驗(yàn)于2021年在海南海口進(jìn)行。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)豬群及數(shù)據(jù)分析

隨機(jī)選擇200頭7胎齡的長大二元母豬為試驗(yàn)材料，采用PCR-TaqI-RFLP方法進(jìn)行多態(tài)性檢測，并分析豬不同基因型與產(chǎn)活仔數(shù)的相關(guān)關(guān)系。采用Statistical Analysis System （SAS）統(tǒng)計軟件GLM程序進(jìn)行單標(biāo)記方差分析并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，所采用模型為：Yijk=μ+Gi+Yi+Pk+eijk，Yijk為性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)；加性效應(yīng)用1、0和-1分別代表AA、AC和CC基因型，顯性效應(yīng)用1、-1和1分別代表AA、AC和CC基因型）；Yi、Pk為固定效應(yīng)，分別為年度和胎次效應(yīng)；eijk為殘差效應(yīng)。

2.2 試驗(yàn)方法

（1）從豬耳組織中提取基因組DNA，根據(jù)豬DIS3L2基因序列和所述的兩條遺傳標(biāo)記特異引物（表1），用該兩條引物在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min，35個循環(huán)94 ℃ 50 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，然后72 ℃10 min，最后4 ℃終止反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系：2.0 μL DNA（100 ng），2.5 μL 2 mmol/L mixed dNTPs，2.5 μL 10×Taq DNA polymerase buffer，2.5 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 20 μmol/L引物1，1 μL 20 μmol/L第2引物，2 unit of Taq DNA polymerase（1 U/μL），11.5 μL無菌水，最后得到PCR產(chǎn)物。

表1 DIS3L2基因作為長大母豬總胎次產(chǎn)仔數(shù)和總胎次活仔數(shù)遺傳標(biāo)記的兩條特異引物

（2）將步驟（1）中得到的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶TaqI酶切，TaqI酶切反應(yīng)體系為：10 μL PCR產(chǎn)物，7 μL無菌水，1 μL Taq I（10 U），2 μL 10×buffer。PCR產(chǎn)物TaqI酶切反應(yīng)條件為：混合物在水浴鍋65 ℃恒溫加熱4 h。在2%的含有EB（溴化乙錠）的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄基因型。

3 結(jié)果與分析

3.1 試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)條帶差異，可分為3種基因型，具有228 bp、176 bp 2條帶的是AA型，只有404 bp 1條帶的是CC型，同時具有404 bp、228 bp、176 bp 3條帶的是AC型（圖1）。

圖1 長大母豬DIS3L2基因分型檢測結(jié)果

3.2 DIS3L2基因型與長大二元母豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

在200頭長大二元母豬群中進(jìn)行了不同基因型與產(chǎn)仔數(shù)間關(guān)聯(lián)分析，統(tǒng)計分析結(jié)果總結(jié)見表2。

表2 DIS3L2基因型與長大二元母豬產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

4 結(jié)論與討論

由結(jié)果可以看出，在長大二元母豬中，基因型AA及AC個體的總胎次產(chǎn)仔數(shù)和總胎次活仔數(shù)極顯著高于CC基因型個體（P<0.01）。通過選留DIS3L2基因位點(diǎn)含有A等位基因的長大二元母豬個體作為種畜，可以提高其總胎次產(chǎn)仔數(shù)和總胎次活仔數(shù)。