曹穩(wěn)根， 史曄瑤， 王 晴， 張 穎， 段 紅， 翟科峰

(宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，現(xiàn)已成為繼心腦血管疾病、癌癥之后嚴(yán)重危害人類健康的第三大疾病，其中2型糖尿病約占糖尿病總數(shù)的90%。糖尿病危害極大，目前仍缺乏安全性和依從性高且長(zhǎng)效的治療方法。研究表明，從中草藥中提取的有效成分對(duì)調(diào)節(jié)血糖和防治糖尿病及其并發(fā)癥都有特殊的療效，日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者高度關(guān)注[1-3]。黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物次生代謝產(chǎn)物中的生物活性小分子化合物，在自然界中存在形式多樣，大量研究證實(shí)，黃酮類化合物具有降糖等多種藥理作用[4-14]。

王棗子Isodonamethystoides(Benth) Cy Wu et Hsuan為唇形科香茶菜屬多年生草本植物，全草皆可入藥，為皖北地區(qū)的道地藥材，2014年9月“宿州王棗子” 獲國(guó)家工商總局商標(biāo)局核準(zhǔn)注冊(cè)中藥材地理標(biāo)志商標(biāo)[15]。研究表明，王棗子葉含有豐富的黃酮類物質(zhì)[16-18]，但有關(guān)王棗子葉總黃酮的降糖活性研究未見報(bào)道。在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)探討王棗子葉總黃酮體外降糖活性。采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，經(jīng)王棗子葉總黃酮不同劑量組連續(xù)灌胃4 周，檢測(cè)不同時(shí)間段小鼠空腹血糖、口服糖耐量以及血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平的變化，探討其體內(nèi)降糖活性，以期為道地藥材王棗子總黃酮有效成分的開發(fā)與利用提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 王棗子葉(宿州綠源中醫(yī)藥科技有限公司)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周建理教授鑒定為正品。蘆丁對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Y01D8S49613)；α-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)L25 M9Y62118、E1828029)；四氧嘧啶[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號(hào)H1808033]；阿卡波糖(杭州中美華東制藥有限公司，批號(hào)1809224)；鹽酸二甲雙胍片(上海上藥信誼藥廠有限公司，批號(hào)48181223)；DS-3樂(lè)生邦德血糖試紙(上海盛邦生物科技有限公司，批號(hào)KSB1726A2)；TC、TG、HDL-C試劑盒(南京建成生物工程研究所)。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 DS-3型樂(lè)生邦德血糖測(cè)試儀(上海盛邦生物科技有限公司)；Multiskan GO型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；ST3100型實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；723型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；JY96-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HK-04A200 g型手提式粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)；R-1001LN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

2 方法

2.1 王棗子葉總黃酮制備與純化 將新鮮王棗子葉去雜質(zhì)后置于55 ℃烘箱中干燥2 h，粉碎過(guò)80目篩備用，通過(guò)纖維素酶-超聲提取方法得到王棗子葉總黃酮粗提液，得率為13.92%[18]，再經(jīng)過(guò)AB-8大孔樹脂純化[19]得王棗子葉總黃酮純化液，備用。

2.2 王棗子葉總黃酮體外抑制α-葡萄糖苷酶活性的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道方法進(jìn)行檢測(cè)，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，王棗子葉總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式為抑制率=[1-(A-B)/(C-D)]×100%，A為樣品組(酶液+樣品)測(cè)得的吸光度值；B為樣品空白組(磷酸鹽緩沖液+樣品)測(cè)得的吸光度值；C為陰性對(duì)照組(酶液+溶劑)測(cè)得的吸光度值；D為空白組(磷酸鹽緩沖液+溶劑)測(cè)得的吸光度值。

2.3 王棗子葉總黃酮對(duì)四氧嘧啶型糖尿病小鼠降糖活性的檢測(cè)

2.3.1 糖尿病小鼠模型的建立 選取健康雄性ICR小鼠90只，體質(zhì)量 (25±2) g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，取10只小鼠作為正常組，其余80只小鼠禁食24 h(自由飲水)后，腹腔一次性注射2%四氧嘧啶生理鹽水(150 mg/kg)進(jìn)行造模。5 d后，小鼠禁食4 h，尾靜脈取血測(cè)量空腹血糖，血糖值>11 mmol/L判定為造模成功。

2.3.2 分組及給藥 選取造模成功的ICR小鼠50只，隨機(jī)分成5組，即模型組，陽(yáng)性對(duì)照組(100 mg/kg二甲雙胍)，王棗子葉總黃酮低、中、高劑量組(100、150、200 mg/kg)，給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，模型組和正常組灌胃給予等量生理鹽水，每天定時(shí)給藥3次，每次0.2 mL，連續(xù)4周。

2.3.3 血糖檢測(cè) 分別在0、7、14、21、28 d，空腹尾靜脈采血，用血糖儀測(cè)量每組小鼠血糖值。

2.3.4 口服糖耐量檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[2]報(bào)道方法進(jìn)行檢測(cè)。于第28天將小鼠禁食12 h，檢測(cè)其血糖(0 min)，然后灌胃2.0 g/kg葡萄糖溶液，分別在30、60、90、120 min檢測(cè)小鼠血糖。

2.3.5 血清TC、TG、HDL-C水平檢測(cè) 28 d后，小鼠摘眼球采血，分離取血清備用，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TC、TG、HDL-C水平。

3 結(jié)果

3.1 王棗子葉總黃酮體外對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響 如圖1所示，在質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，王棗子葉總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制活性，且呈量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，王棗子葉總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到73.3%，略低于阿卡波糖，是良好的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

3.2 王棗子葉總黃酮對(duì)小鼠血糖的影響 如圖2所示，給藥0 d，與正常組比較，模型組及各給藥組血糖值升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組以及王棗子葉總黃酮各劑量組小鼠14、21、28 d血糖均降低(P<0.05，P<0.01)，其中王棗子葉總黃酮低劑量組降糖效果較好。

3.3 王棗子葉總黃酮對(duì)小鼠糖耐量的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組及各給藥組小鼠血糖值在灌胃葡萄糖30 min后達(dá)到高峰，之后開始下降，但在120 min內(nèi)仍處于較高水平(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組以及王棗子葉總黃酮各劑量組不同時(shí)間段的血糖值均降低(P<0.05)，表明王棗子葉總黃酮能控制小鼠血糖水平的升高，改善糖耐量異常，其中低劑量組效果較好。

3.4 王棗子葉總黃酮對(duì)小鼠脂代謝的影響 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠血清TC、TG水平升高(P<0.01)，HDL-C水平降低(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組以及王棗子葉總黃酮各劑量組小鼠血清TC、TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)，表明王棗子葉總黃酮能有效地改善糖尿病小鼠脂代謝紊亂，其中低劑量組效果較好。

4 討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖、伏格列波糖等)是一類新型的口服降血糖藥物，可有效抑制小腸體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶活性，目前已廣泛應(yīng)用于2型糖尿病及并發(fā)癥的防治。α-葡萄糖苷酶能夠水解低聚糖α-1,4糖苷鍵，生成可以直接被人體吸收的葡萄糖。通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶活性可使單糖消化吸收過(guò)程受阻，緩解餐后血糖升高的癥狀[10,20]。2型糖尿病的顯著特征之一是血糖水平升高，控制血糖升高是減少和減輕糖尿病及其并發(fā)癥的重要方法。研究證實(shí)，糖耐量異常是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中常見的現(xiàn)象，糖耐量實(shí)驗(yàn)是機(jī)體血糖調(diào)節(jié)機(jī)能的一種檢查方法。脂代謝異常是2型糖尿病及其并發(fā)癥的原發(fā)性病理、生理過(guò)程，患者通常伴有脂代謝異常，且能進(jìn)一步演變成嚴(yán)重的心血管疾病[2]。

本研究通過(guò)α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)及四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，探討王棗子葉總黃酮體內(nèi)外降糖活性。研究表明，王棗子葉總黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制活性，且呈量效關(guān)系；王棗子葉總黃酮各劑量組均能降低糖尿病小鼠血糖和血清TC、TG水平，升高HDL-C水平，改善葡萄糖糖耐量的異常及糖尿病引起脂代謝紊亂情況，其中低劑量組效果最好，接近二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組。但有關(guān)王棗子葉總黃酮的降糖機(jī)理還需進(jìn)一步探討。