金麗娜， 姜京植， 宋藝蘭， 李良昌， 延光海， 孟慶玲， 李 歡， 鄭明昱

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種慢性的氣道炎癥性疾病，多種細(xì)胞可與上皮細(xì)胞相互作用，引起氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑[1]，其發(fā)病機(jī)制與輔助性T細(xì)胞1(Th1)/輔助性T細(xì)胞2(Th2)失衡有關(guān)。普遍認(rèn)為Th2型相關(guān)細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13等，在哮喘中占主導(dǎo)地位[2]。自噬是細(xì)胞的降解和再循環(huán)過程，是發(fā)生在真核細(xì)胞上由溶酶體介導(dǎo)并且高度保守的過程[3]。Th1/Th2細(xì)胞因子反應(yīng)在自噬過程中起著調(diào)節(jié)作用[4]。Th1細(xì)胞因子刺激自噬，而Th2細(xì)胞因子抑制自噬[5]。UNC-51樣激酶1(ULK1)是啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵蛋白，可調(diào)節(jié)前自噬體的形成[6]，自噬相關(guān)蛋白6(Beclin-1)是自噬體形成過程中必需分子[7]，微管相關(guān)蛋白光鏈3(LC3)是自噬的標(biāo)志物[8]，與自噬有密切的聯(lián)系。研究顯示，Th2型相關(guān)細(xì)胞因子對Beclin-1，LC3具有調(diào)節(jié)作用[9-11]。

鹿茸大補(bǔ)湯出自《東醫(yī)壽世保元》，具有補(bǔ)肺瀉肝、化痰平喘、標(biāo)本兼顧功效，對哮喘緩解期患者有較好的療效[12-13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鹿茸大補(bǔ)湯可以有效抑制哮喘氣道炎性細(xì)胞因子，改善肺組織損傷[14]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)將從自噬角度探討鹿茸大補(bǔ)湯緩解哮喘的作用機(jī)制，為鹿茸大補(bǔ)湯防治哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性豚鼠50只，體質(zhì)量(200±30)g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(吉)2017-0003。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 試劑與藥物 鹿茸大補(bǔ)湯由鹿茸10 g、麥冬7.5 g、薏苡仁7.5 g、麻黃5 g、山藥5 g、杏仁5 g、天冬5 g、五味子5 g組成，購于延吉市北京同仁堂藥店，經(jīng)專家鑒定為正品，各藥材在蒸餾水中浸泡1 h后分別加10、8倍量水提取2次，每次1 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1∶1，備用。卵清蛋白(OVA)(貨號(hào)9006-59-1)、HE染色試劑盒(貨號(hào)G1120)、PAS染色試劑盒(貨號(hào)G1280)、Masson染色試劑盒(貨號(hào)G1345)購自北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鋁凝膠(貨號(hào)77161)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；免疫組化試劑盒(貨號(hào)pv-9000)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IL-4 ELISA試劑盒(貨號(hào)bsk12003)、IL-5 ELISA試劑盒(貨號(hào)bsk12019)、IL-13 ELISA試劑盒(貨號(hào)bsk12006)、LC3抗體(貨號(hào)bs-8878R)、ULK1抗體(貨號(hào)bs-3602R)、Beclin抗體(bsm-33323R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 NE-C29型歐姆龍壓縮式霧化吸入器(大連藥材集團(tuán)有限公司醫(yī)療器械廠)；041BR87950型垂直電泳儀及電泳槽、76120280型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；5404P806820型高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)；180222B EP-OCH型酶標(biāo)儀、9.557.127 Cytation5型細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)(美國Beckman公司)。

2 方法

2.1 分組與造模 將豚鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，鹿茸大補(bǔ)湯低、高劑量組，地塞米松組。除正常組外，其余各組豚鼠腹腔注射1 mL 10%卵清蛋白致敏液(OVA和氫氧化鋁)致敏，每周1次，共2次。第21天時(shí)，模型組，鹿茸大補(bǔ)湯低、高劑量組及地塞米松組豚鼠再腹腔注射1%卵清蛋白溶液，超聲霧化激發(fā)，每次至少30 min，每周3次，連續(xù)8周。第21天起，正常組、模型組豚鼠于激發(fā)前1 h灌胃給予生理鹽水，鹿茸大補(bǔ)湯高、低劑量組豚鼠灌胃給予20、5 g/kg鹿茸大補(bǔ)湯(分別為臨床等效劑量的1、4倍)，地塞米松組豚鼠灌胃給予5 g/kg地塞米松，每天1次，連續(xù)8周。在灌胃過程中豚鼠無死亡，每組最終納入數(shù)量均為10只[15-16]。

2.2 取材 末次給藥24 h后處死豚鼠，即刻打開胸腔，暴露氣管，回收BALF，3 000 r/min離心5 min，并取上清液，在-80 ℃下冷凍保存，剩余沉淀物用于細(xì)胞涂片，Diff-Quick染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行炎癥細(xì)胞分類及計(jì)數(shù)。取豚鼠左肺上葉，在-80 ℃下保存；取左肺中葉，在4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定。

2.3 豚鼠BALF中炎性細(xì)胞因子水平檢測 取豚鼠BALF，解凍后制備洗滌液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，孔內(nèi)加入樣品和抗體進(jìn)行孵育，再依次加入工作液、顯色底物進(jìn)行孵育，最后加入終止液，用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，并計(jì)算BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平。

2.4 豚鼠肺組織病理學(xué)觀察 取豚鼠左肺中葉，石蠟包埋切片，常規(guī)固定、脫水，進(jìn)行HE、PAS、Masson染色，觀察其組織病理學(xué)變化。

2.5 免疫組織化學(xué)染色檢測ULK1蛋白表達(dá) 將肺組織石蠟切片置于60 ℃烤箱中熔蠟以增加切片附著度，脫蠟，脫水，微波加熱抗原修復(fù)，緩沖液冷卻并清洗，一抗、生物酶標(biāo)記的二抗孵育，DAB顯色，蘇木復(fù)染，脫水，中性樹膠封片，觀察肺組織ULK1蛋白陽性表達(dá)。

2.6 Western blot檢測LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1蛋白表達(dá) 提取豚鼠肺組織蛋白，采用BCA法檢測濃度，煮沸5 min后經(jīng)8%、10%、12%、15% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉-TBST溶液常溫封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜，洗膜后加入相應(yīng)二抗，常溫?fù)u床孵育2 h，將膜取出后用ECL試劑曝光，分析蛋白相對表達(dá)。

2.7 免疫熒光法檢測ULK1、LC3蛋白表達(dá) 將標(biāo)本置于60 ℃烤箱中熔蠟以增加切片的附著度，脫蠟，脫水，微波加熱抗原修復(fù)，一抗孵育過夜，清洗后用熒光二抗孵育，最后加入DAPI封片，在微孔成像儀下觀察拍照。

3 結(jié)果

3.1 鹿茸大補(bǔ)湯對豚鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)的影響 與正常組比較，模型組豚鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)；與模型組比較，鹿茸大補(bǔ)湯各劑量組和地塞米松組豚鼠BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，見圖1。

3.2 鹿茸大補(bǔ)湯對豚鼠BALF中炎性細(xì)胞因子水平的影響 與正常組比較，模型組豚鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平升高(P<0.05)；與模型組比較，鹿茸大補(bǔ)湯各劑量組和地塞米松組豚鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平降低(P<0.05)，見圖2。

3.3 鹿茸大補(bǔ)湯對豚鼠肺組織病理變化的影響 HE染色顯示，正常組豚鼠氣道無明顯改變；模型組豚鼠氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，黏膜下層增寬，黏膜上皮增生，管腔被黏液所堵塞；鹿茸大補(bǔ)湯各劑量組和地塞米松組豚鼠雖可見炎癥細(xì)胞浸潤等病理表現(xiàn)，但較模型組有所減輕。PAS染色顯示，與正常組比較，模型組豚鼠出現(xiàn)明顯的杯狀細(xì)胞增生與黏液分泌；與模型組比較，鹿茸大補(bǔ)湯各劑量組和地塞米松組豚鼠上述情況有所減輕。Masson染色顯示，正常組豚鼠氣道周圍膠原纖維沉積較少；模型組豚鼠氣道周圍膠原纖維沉積增多；鹿茸大補(bǔ)湯各劑量組和地塞米松組豚鼠氣道周圍膠原纖維沉積減少，見圖3。

3.4 鹿茸大補(bǔ)湯對豚鼠肺組織ULK1蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組豚鼠氣道周圍ULK1聚集明顯；與模型組比較，鹿茸大補(bǔ)湯各劑量組和地塞米松組豚鼠ULK1聚集程度有所減弱，見圖4。

3.5 鹿茸大補(bǔ)湯對豚鼠肺組織LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組豚鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，鹿茸大補(bǔ)湯各劑量組和地塞米松組豚鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表達(dá)降低(P<0.05)，見圖5。

3.6 鹿茸大補(bǔ)湯對豚鼠肺組織ULK1、LC3蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組豚鼠肺組織ULK1、LC3蛋白表達(dá)升高；與模型組比較，鹿茸大補(bǔ)湯各劑量組和地塞米松組豚鼠肺組織ULK1、LC3蛋白表達(dá)降低，見圖6。

4 討論

哮喘是一種常見的全球性呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率和死亡率都很高。本研究利用OVA誘導(dǎo)哮喘豚鼠模型來探索鹿茸大補(bǔ)湯對哮喘氣道炎癥的影響。以地塞米松為陽性對照藥物，觀察了鹿茸大補(bǔ)湯對哮喘豚鼠肺部炎癥的影響。HE染色可以觀察到鹿茸大補(bǔ)湯能減輕OVA誘導(dǎo)后氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤；PAS染色顯示鹿茸大補(bǔ)湯能減輕杯狀細(xì)胞增生與黏液分泌；Masson染色證明鹿茸大補(bǔ)湯可以減輕氣道周圍膠原纖維增生。以上研究結(jié)果顯示，鹿茸大補(bǔ)湯能改善OVA誘導(dǎo)的哮喘豚鼠的肺部炎癥。

Th1/Th2細(xì)胞亞群的失衡是哮喘的發(fā)病機(jī)制之一，已知Th2型相關(guān)細(xì)胞因子可促進(jìn)哮喘患者肺部嗜酸性粒細(xì)胞的積累[17]。研究顯示，IL-13促進(jìn)氣道杯狀細(xì)胞分泌過量黏液，激活上皮細(xì)胞自噬，相反，抑制自噬能降低IL-13誘導(dǎo)的氣道黏液分泌，降低IL-5表達(dá)，減少BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量[10,18]。本研究結(jié)果顯示，OVA誘導(dǎo)哮喘豚鼠中炎性細(xì)胞因子水平升高，而鹿茸大補(bǔ)湯可以減少炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，證實(shí)其對哮喘有抗炎作用。

支氣管哮喘屬朝鮮族醫(yī)學(xué)的“哮喘”范疇。李濟(jì)馬根據(jù)臟腑的虛實(shí)，將人分為4種體質(zhì)。其中太陰人以“肝大肺小”為臟腑功能特點(diǎn)，因其“肺小”在四象人中最易患肺部疾病，因此太陰人哮喘應(yīng)以補(bǔ)肺瀉肝為治法。鹿茸大補(bǔ)湯為太陰人方劑，方中以鹿茸為主藥補(bǔ)肺、益精血；麥門冬、薏苡仁、五味子、山藥為輔藥補(bǔ)肺健胃，助鹿茸益精血；天門冬潤肺滋腎；杏仁止咳平喘；麻黃解肺之表邪[14]。諸藥合用共湊補(bǔ)肺瀉肝，化痰平喘，標(biāo)本兼顧之功效，符合朝鮮族醫(yī)學(xué)“藥乃局限于人”的藥性觀。

自噬是一個(gè)高度保守的基本進(jìn)化過程，在細(xì)胞生長發(fā)育、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)及程序化細(xì)胞死亡中起著至關(guān)重要的作用[19]。研究顯示，自噬可能是哮喘發(fā)展的一個(gè)重要因素，減少肺組織自噬可以改善哮喘[20]。自噬涉及哮喘發(fā)病機(jī)制的幾個(gè)關(guān)鍵特征，包括嗜酸性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑[21-22]。ULK1和ATG13是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[23]。研究表明，小鼠因缺乏ULK1基因?qū)е伦允晒δ苁艿揭种芠24]。Beclin-1作為哺乳動(dòng)物中Atg6的同源蛋白，是ULK1下游的直接靶點(diǎn)，Beclin-1可以從干預(yù)自噬體的形成至成熟[25]。LC3-Ⅰ是通過從新合成的LC3中去除C末端的22個(gè)氨基酸而形成的，然后將一部分LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，因此常用LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值來評(píng)估細(xì)胞的自噬表達(dá)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、ULK1在OVA誘導(dǎo)的哮喘豚鼠中呈高表達(dá)，表明自噬與哮喘氣道炎癥的發(fā)病機(jī)制之間存在聯(lián)系；而經(jīng)鹿茸大補(bǔ)湯治療后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ULK1、Beclin-1表達(dá)被抑制，表明鹿茸大補(bǔ)湯可能是通過抑制自噬從而抑制哮喘氣道炎癥。

綜上所述，鹿茸大補(bǔ)湯可能通過抑制ULK1信號(hào)通路對自噬起調(diào)節(jié)作用，減輕哮喘豚鼠氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤，從而改善哮喘豚鼠氣道炎癥反應(yīng)，緩解哮喘。本次研究仍存在一定的局限性，為了進(jìn)一步了解鹿茸大補(bǔ)湯在該通路的作用機(jī)制，還需要多途徑、多靶點(diǎn)深入研究。