雷苛露， 袁明昊， 周 濤， 李建鋼， 曾大富， 郭 力*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137；2.成都晶博生物科技有限責(zé)任公司，四川 成都 611731)

熊膽粉具有清熱解毒、平肝明目、抗炎鎮(zhèn)痛等功效[1]。由于熊膽粉市場(chǎng)價(jià)格昂貴，藥材市場(chǎng)上常以豬、牛、羊等膽粉摻假。目前，僅衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定采用薄層色譜法對(duì)熊膽粉中熊去氧膽酸進(jìn)行定性鑒別，但其靈敏度較低、局限性強(qiáng)[2]。因此，尋找一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的熊膽鑒別方法具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

顏色是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，中藥的顏色往往與內(nèi)在成分含量密切相關(guān)[3]。課題組前期已對(duì)青黛有效成分含量與其色度值進(jìn)行相關(guān)性研究[4]，發(fā)現(xiàn)藥材的顏色是由內(nèi)在成分尤其是呈色成分的外在體現(xiàn)。熊膽粉含有膽汁酸類成分以及膽色素、膽固醇、蛋白質(zhì)等。熊膽粉中仍有一些作用機(jī)制尚不明確，與其中非膽汁酸類成分有關(guān)[5]。膽色素是動(dòng)物膽汁呈色的關(guān)鍵物質(zhì)[6]，其中膽紅素能提高機(jī)體耐缺氧能力[7]，抗炎[8-9]、改善組織損傷[10]等，是膽色素中主要成分及活性物質(zhì)[11]。熊膽歷來以外觀顏色定品質(zhì)[12]，但尚無從顏色特征角度評(píng)價(jià)熊膽質(zhì)量及真?zhèn)蔚膱?bào)道，傳統(tǒng)上對(duì)顏色的判斷主要依靠口傳相授及經(jīng)驗(yàn)傳承，主觀性強(qiáng)。對(duì)性狀指標(biāo)數(shù)據(jù)化，與指標(biāo)成分建立相關(guān)性的“性狀量化-指標(biāo)成分”[13]是新興的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，為傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別的傳承創(chuàng)新和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立提供了新的突破[14]。

因此，選擇膽紅素含量作為顏色相關(guān)性評(píng)價(jià)指標(biāo)，將傳統(tǒng)感官鑒別與色度分析技術(shù)相結(jié)合，客觀量化熊膽及不同動(dòng)物膽粉的色度值，探討顏色與熊膽粉中膽紅素成分的相關(guān)性；同時(shí)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析鑒別熊膽粉與其他動(dòng)物膽粉，為熊膽粉的快速鑒別及質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

熊膽粉樣品由成都晶博生物科技有限責(zé)任公司提供，批號(hào)180905～200406，共計(jì)23批。其他動(dòng)物膽粉共11批由實(shí)驗(yàn)室自制，包括豬膽粉、牛膽粉、羊膽粉、雞膽粉、鵝膽粉、鴨膽粉。膽紅素對(duì)照品(成都普思生物科技有限公司，批號(hào)PS200729-02，純度大于98%)；三氯甲烷(成都科龍化工試劑廠)。

CM-5型分光測(cè)色儀(日本柯尼卡美能達(dá)公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津UV2550)；UP-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)；BP121S型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 膽紅素含量測(cè)定 采用紫外分光光度法，在453 nm波長(zhǎng)處測(cè)定熊膽粉及其他膽粉中膽紅素的含量[15]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取膽紅素對(duì)照品約2 mg，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，加三氯甲烷80 mL，超聲，加三氯甲烷至刻度，搖勻，制成每1 mL含20 μg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 分別稱取23批熊膽粉與11批其他動(dòng)物膽粉約30 mg，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶，分別加入8 mL三氯甲烷，超聲20 min，加三氯甲烷至刻度，搖勻，4 000 r/min離心10 min，分取三氯甲烷層，即得。

2.4 方法學(xué)考察 精密量取膽紅素對(duì)照品1、2、3、4、5、6 mL分別置于10 mL量瓶中，回歸方程為Y=0.093 4X-0.013 9，R2=0.999 3，線性范圍20～120 μg，線性關(guān)系良好；精密量取膽紅素對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.07%，表明該儀器精密度良好；取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，RSD為1.25%，表明膽紅素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；取同一供試品溶液6份，RSD為1.74%，表明該方法重復(fù)性良好；膽紅素平均加樣回收率為103.59%，RSD為1.89%。

2.5 含量測(cè)定 取熊膽粉及其他膽粉樣品，在“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在453 nm處測(cè)定吸光度并計(jì)算含量，重復(fù)3次。

2.6 動(dòng)物膽粉末的顏色測(cè)定 將儀器調(diào)試到反射測(cè)量，測(cè)定光源D65，照明系統(tǒng)排除鏡面反射，測(cè)定試場(chǎng)10°視角，測(cè)試區(qū)域30 mm，起止波長(zhǎng)360～740 nm[4]。對(duì)儀器進(jìn)行白板與黑板校正后，取熊膽粉及其他動(dòng)物膽粉末約2 g于測(cè)色皿中，均勻平鋪于測(cè)色皿底部，測(cè)定粉末顏色，每組樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果見表1。

2.7 動(dòng)物膽粉提取液顏色測(cè)定 將測(cè)量類型調(diào)試為液體測(cè)量，三氯甲烷作為空白溶劑，測(cè)定膽紅素后的樣品溶液于比色皿中，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果見表1。

表1 熊膽粉及其他動(dòng)物膽粉色度值及含量(n=3)

2.8 方法學(xué)考察 取同一樣品適量制備粉末與提取液，分別測(cè)定色度值，測(cè)定6次，RSD均<2%，表明儀器精密度良好；取同一樣品6份，分別制備粉末與提取液，測(cè)定6次，RSD均<3%，該方法重復(fù)性較好；取同一樣品適量制備粉末與提取液，分別在0、1、2、3、4、5 h后測(cè)定，RSD均<3%，表明供試品在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 相關(guān)性分析 以L*、a*、b*值依次為自變量，膽紅素含量為因變量，用SPSS 22.0對(duì)熊膽及其他動(dòng)物膽粉末、提取液的色度值與膽紅素含量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果見表2。膽紅素含量與提取液的L*、a*、b*值的相關(guān)性分別為-0.947、-0.590、0.960，且P<0.01，表明膽紅素含量與L*、a*、b*值顯著性相關(guān)。L*代表明亮度，L*越大，明亮度越大，反之越??；a*代表紅綠色度，a*>0為紅色方向，反之為綠色方向；b*代表黃藍(lán)色度，b*>0為黃色方向，反之為藍(lán)色方向。膽紅素含量與L*、a*值呈負(fù)相關(guān)，與b*值呈正相關(guān)，表明膽類提取液明亮度越低、綠色程度和黃色程度越高，膽紅素含量越高。而膽紅素含量與粉末顏色值相關(guān)性較弱，且不完全具有顯著性。

表2 色度值與膽紅素含量相關(guān)性分析(n=34)

2.10 膽紅素含量與提取液色度值回歸分析 采用SPSS 22.0對(duì)其進(jìn)行回歸分析，建立回歸方程，以此預(yù)測(cè)膽類提取液中膽紅素含量。結(jié)果顯示R=0.974，R2=0.950，表明膽紅素含量受色度值影響的程度為95.0%；方差分析結(jié)果顯示P<0.001，該回歸方程模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 回歸系數(shù)及方程

2.11 熊膽粉鑒別分析

2.11.1 熊膽粉及動(dòng)物膽粉提取液色度值的三維空間分布 采用Origin 2021建立提取液色度值的三維空間分布圖，探討基于色度值鑒別熊膽真?zhèn)蔚目赡苄浴Ｈ鐖D2所示，熊膽粉有明顯的區(qū)域聚集性，主要分布于空間的左側(cè)，而其它動(dòng)物膽粉主要分布于空間右側(cè)，空間分布表明基于色度值鑒別熊膽真?zhèn)尉哂锌尚行浴?/p>

2.11.2 真?zhèn)闻袆e模型的建立 采用SPSS 22.0對(duì)膽類提取液L*、a*、b*值共線性診斷，三者的VIF分別為6.897、1.822和8.147，VIF均<10，容差值介于0和1之間，說明三者不具有多重共線性，可進(jìn)行判別分析。通過Fisher系數(shù)建立非標(biāo)準(zhǔn)化典型判別模型，得到兩個(gè)判別函數(shù)，Y1=0.224L*-3.882a*+0.101b*-21.398(特征值9.369，Wilks的Lambda =0.078，P<0.001)；Y2=-0.107L*-0.567a*-0.043b*-8.829(特征值0.206，Wilks的Lambda=0.809，P=0.042)，判別函數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖3所示，在此判別函數(shù)下，熊膽粉與其它動(dòng)物膽粉可被區(qū)分開，且其他動(dòng)物膽粉中家禽類及哺乳類膽粉能較好區(qū)分。采用此判別函數(shù)對(duì)提取液色度值進(jìn)行檢驗(yàn)，如表4所示，判別函數(shù)對(duì)熊膽、家禽類膽粉與其他哺乳類膽粉的正判率均為100%，交叉驗(yàn)證的正判率為91.2%，僅為其他動(dòng)物膽中類別的誤判，表明判別函數(shù)可正確鑒別熊膽真?zhèn)巍?/p>

表4 分類結(jié)果

2.11.3 主成分分析與聚類分析 采用SIMCA-P14.1對(duì)提取液色度值和膽紅素含量值進(jìn)行PCA主成分分析與聚類分析。由圖4可知，PCA分析顯示兩個(gè)主成分總貢獻(xiàn)率為97.4%，該模型建立良好，表明用提取液色度值和膽紅素含量值能很好的鑒別熊膽粉及其它動(dòng)物膽粉。如圖5所示，聚類分析可將所有批次的熊膽粉與其他膽粉聚類區(qū)分，表明色度分析法對(duì)熊膽粉具有較好的鑒別效果。

3 討論

傳統(tǒng)的感官評(píng)價(jià)是中藥傳承延續(xù)幾千年的質(zhì)量評(píng)價(jià)手段之一，而顏色是感官評(píng)價(jià)必不可少的觀察指標(biāo)[16]。分光測(cè)色儀通過模擬人眼視覺系統(tǒng)和積分光學(xué)系統(tǒng)，把光譜數(shù)據(jù)的三刺激值進(jìn)行積分[17]，利用國(guó)際照明委員會(huì)色度空間系統(tǒng)對(duì)顏色進(jìn)行客觀表達(dá)[4]，以L*、a*、b*值作為中藥顏色的量度，更加快速、直觀、全面地為中藥的鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。本研究利用該技術(shù)區(qū)分熊膽粉及其他常見的動(dòng)物膽粉，為中藥的鑒別分析提供一種新思路。

膽色素是動(dòng)物膽汁中色素的總稱，使各種膽類呈現(xiàn)不同的顏色，膽紅素是膽色素中的主要活性物質(zhì)，探討膽紅素含量與熊膽粉顏色的關(guān)系具有鑒別意義。研究表明，用分光光度法測(cè)定豬膽汁中膽紅素的含量方法可靠，在453 nm處其他雜質(zhì)幾乎無吸收，特異性強(qiáng)[18]。熊膽根據(jù)外觀顏色分為金膽、墨膽、菜花膽和油膽，傳統(tǒng)認(rèn)為金膽品質(zhì)更好[11]，根據(jù)結(jié)果，黃色程度越高的熊膽粉膽紅素含量越高。

綜上所述，基于色度分析原理,熊膽粉的顏色值與膽紅素含量具有顯著相關(guān)性，可以用于熊膽粉及其他動(dòng)物膽粉的鑒別，為熊膽粉的鑒別、質(zhì)量控制及市場(chǎng)監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。