楊劍波， 曹倪豪， 程飛， 梁增亮， 楊菲

(南通市海門區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇省南通市 226100)

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，常采用經尿道膀胱腫瘤切除術治療?；熢诎螂装┑闹委熤邪l(fā)揮重要作用，但化療產生的不良反應較大并可產生化療耐藥性，因而尋找安全有效的抗膀胱癌藥物具有重要意義。研究表明，部分中醫(yī)藥可起到抑制膀胱癌的作用，然而尚未明確其作用機制[1-3]。土貝母苷甲是土貝母的主要活性成分，可通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，通過調控miR-21表達而抑制膠質瘤細胞增殖及促進細胞凋亡[4]。miRNA可通過靶向調節(jié)靶mRNA而調控細胞增殖及凋亡等生物學行為。研究表明，miR-215-5p在前列腺癌中表達下調，上調其表達可抑制前列腺癌細胞轉移[5]，但miR-215-5p是否可作為土貝母苷甲治療膀胱癌的潛在靶點尚未可知。本研究探討土貝母苷甲在膀胱癌中的抗癌作用，并通過miR-215-5p探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 試劑

土貝母苷甲(上海一研生物公司)；人膀胱癌細胞T24(南京科佰生物公司)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)；Matrigel基質膠、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、Transwell小室、CCK-8試劑(北京索萊寶公司)；RNA反轉錄試劑與熒光定量PCR試劑(北京天根生化公司)；miR-215-5p mimics、anti-miR-215-5p、miR-NC、anti-miR-NC(廣州銳博生物公司)；兔抗人基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、MMP-9抗體、二抗(美國Santa Cruz公司)；RNA提取試劑(北京全式金生物公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

于96孔板(100 μL/孔)接種對數生長期T24細胞，分別加入不同質量濃度(10、20、30 mg/L)土貝母苷甲培養(yǎng)基處理24 h[6]，分別記為低劑量組、中劑量組、高劑量組；同時將正常培養(yǎng)的T24細胞記為對照組；將miR-NC、miR-215-5p mimics分別轉染至T24細胞，分別記為miR-NC組、miR-215-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-215-5p分別轉染至T24細胞，轉染成功后加入30 mg/L土貝母苷甲培養(yǎng)基處理24 h，分別記為土貝母苷甲30 mg/L+anti-miR-NC組、土貝母苷甲30 mg/L+anti-miR-215-5p組。

1.3 CCK-8實驗檢測細胞增殖

各組T24細胞以100 μL/孔接種于96孔板，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃恒溫箱孵育2 h。酶標儀檢測450 nm處光密度(OD)值并計算細胞存活率。

1.4 平板克隆形成實驗

各組T24細胞以500個/孔接種于6孔板，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)14天，當出現細胞集落時棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛進行細胞固定20 min，并以1%結晶紫染色處理20 min，采用PBS洗滌后將其晾干，最后進行細胞計數。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲

遷移檢測：采取無血清培養(yǎng)基處理各組T24細胞，獲得單細胞懸液(細胞濃度1×105個/mL)，上室接種控制為100 μL/孔，并在下室放入600 μL完全培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)24 h,加入多聚甲醛予以細胞固定20 min，然后結晶紫連續(xù)染色20 min，進行漂洗晾干，記錄顯微鏡計數結果。侵襲檢測：混勻培養(yǎng)基以及Matrigel基質膠，二者比例為1∶6，并將40 μL稀釋液放入上室，37 ℃恒溫箱凝固處理4 h備用,其他步驟同遷移測定。

1.6 qRT-PCR檢測細胞miR-215-5p水平

用RNA提取試劑提取各組T24細胞總RNA，按照試劑盒說明書進行反轉錄及完成qRT-PCR過程。2-ΔΔCt法計算miR-215-5p相對表達量(U6為內參)。

1.7 Western blotting檢測MMP-2、MMP-9蛋白

用二喹啉甲酸法測定蛋白水平，緩沖液加入50 μg蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，用MMP-2(1∶1 000)、內參GAPDH(1∶2 000)、MMP-9(1∶1 000)一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，再用二抗稀釋液(1∶5 000)室溫孵育1 h。Image J軟件獲得蛋白相對灰度值。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 土貝母苷甲對T24細胞增殖及克隆形成的影響

與對照組比較，低、中、高劑量組細胞存活率降低(P<0.05)，克隆形成數減少，且呈劑量依賴性遞減(P<0.05；圖1)。

圖1 土貝母苷甲對T24細胞增殖及克隆形成的影響

2.2 土貝母苷甲對T24細胞遷移、侵襲的影響

低、中、高劑量組遷移及侵襲細胞數均低于對照組(P<0.05；圖2)。

圖2 土貝母苷甲對T24細胞遷移及侵襲的影響

2.3 土貝母苷甲對T24細胞miR-215-5p表達、MMP-2和MMP-9蛋白水平的影響

與對照組比較，低、中、高劑量組miR-215-5p表達升高，MMP-2、MMP-9蛋白水平降低，且均呈劑量依賴性(P<0.05；圖3)。

圖3 土貝母苷甲對T24細胞miR-215-5p表達、MMP-2和MMP-9蛋白水平的影響

2.4 miR-215-5p過表達對T24細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響

miR-215-5p組細胞存活率以及MMP-2、MMP-9蛋白水平低于miR-NC組(P<0.05)，細胞克隆形成數、遷移及侵襲細胞數也均低于miR-NC組(P<0.05；圖4)。

圖4 miR-215-5p過表達對T24細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響

2.5 抑制miR-215-5p表達可逆轉土貝母苷甲對T24細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的作用

土貝母苷甲30 mg/L+anti-miR-215-5p組細胞存活率、克隆形成數、遷移及侵襲細胞數以及MMP-2、MMP-9蛋白水平均高于土貝母苷甲30 mg/L+anti-miR-NC組(P<0.05；圖5)。

圖5 抑制miR-215-5p表達可逆轉土貝母苷甲對T24細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響

3 討 論

膀胱癌細胞轉移是導致患者復發(fā)率高及預后不良的重要原因，手術結合放化療是膀胱癌的主要治療手段，但具有較大的不良反應，目前中藥提取物成為治療膀胱癌的研究重點[7]。miRNA可結合3′UTR的目標信使RNA(mRNA)并影響其轉錄過程，還可能作為膀胱癌治療的潛在靶點[8-9]。但中藥提取物是否以miRNA為靶點而發(fā)揮抗膀胱癌作用尚需進一步探究。

土貝母苷可抑制非小細胞肺癌[10]、膠質母細胞瘤[11]、前列腺癌[12]細胞增殖和轉移。本研究結果顯示，土貝母苷甲具有降低T24細胞存活率以及減少其克隆形成功效，且呈質量濃度依賴性，證實土貝母苷甲能夠對膀胱癌細胞增殖過程與克隆形成產生抑制作用。MMP-2、MMP-9可通過降解細胞外基質而增強細胞轉移[13]。本研究結果顯示，對于癌細胞遷移與侵襲、MMP-2及MMP-9能夠產生明顯抑制作用，呈現藥物劑量依耐性降低趨勢，證實土貝母苷甲能夠對T24細胞的侵襲與遷移行為具有抑制作用。

miR-215-5p可通過靶向Sox9而抑制乳腺癌細胞侵襲[14]。miR-215-5p低表達量與結直腸癌患者臨床分期、不良預后有關[15]。miR-215-5p可抑制結直腸癌細胞增殖及轉移[16]。miR-215-5p可抑制間皮瘤進展[17]。本研究結果顯示，隨著土貝母苷甲質量濃度的不斷升高，膀胱癌細胞中miR-215-5p的表達量逐漸升高，抑制miR-215-5p表達可降低土貝母苷甲對膀胱癌細胞惡性行為的抑制作用；提示土貝母苷甲通過調控miR-215-5p表達而調節(jié)膀胱癌細胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，土貝母苷甲可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲行為，其作用機制與促進miR-215-5p的表達有關。但關于其具體作用機制仍需進一步探究。