沙敬新，薛昊軒，李憲龍，陳正龍，陶嘉樂，李逸明

在人體氣道和肺泡表面覆蓋有一層連續(xù)液體薄膜，稱為肺內(nèi)液[1]。在大的氣道中，這一薄膜是由黏液凝膠層和纖周層組成的雙層液體，而在遠(yuǎn)端細(xì)支氣管和肺泡中，它逐漸過渡到由肺表面活性劑膜[2]所覆蓋的水性下相構(gòu)成的單層液體。肺表面活性物質(zhì)可以降低肺泡氣液界面的表面張力，保持肺泡的穩(wěn)定性，對維持肺的正常呼吸力學(xué)具有非常重要的作用[3，4]。肺泡表面張力隨呼氣運(yùn)動(dòng)時(shí)肺泡表面積的減小而減小，根據(jù)Young-Laplace方程，肺泡向內(nèi)的彈性回縮力減小，有效避免了肺泡在呼氣末期的不穩(wěn)定性。同樣，較低的表面張力可以減小氣道液體層中的負(fù)壓，避免氣道塌陷。此外，肺內(nèi)液體的滲出也受到表面張力的影響。例如在肺水腫患者中，肺泡襯里液表面張力的增加可能會(huì)導(dǎo)致組織間隙液和肺泡內(nèi)液體之間的壓力梯度增大，從而導(dǎo)致液體從組織間隙滲入肺泡空氣腔中。

在臨床急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者的機(jī)械通氣中發(fā)現(xiàn)，肺泡表面張力的改變會(huì)導(dǎo)致機(jī)械通氣時(shí)的容積傷或者剪切傷[5]。通常使用較高的呼氣末正壓和肺復(fù)張動(dòng)作來預(yù)防呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷[6]，而呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷的計(jì)算模型[7]進(jìn)一步表明，肺內(nèi)液的表面張力對肺復(fù)張壓或氣道重新開啟壓力有重要影響。早產(chǎn)兒由于缺乏肺表面活性物質(zhì)，可能會(huì)罹患新生兒呼吸窘迫綜合征[8]（neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）。出生后給予外源性表面活性物質(zhì)已成為NRDS標(biāo)準(zhǔn)臨床治療措施[9]。Filoche M團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究表明[10]，表面活性劑混合藥物的表面張力決定了表面活性劑的給藥效率及其在氣道中分布的均勻性。因此，測量氣道表面液體的表面張力，無論是制定肺保護(hù)性通氣策略，還是在優(yōu)化表面活性劑治療方案方面都具有重要的臨床意義。

目前表面張力的測量技術(shù)主要有Langmuir-Wilhelmy天平法[11]、捕獲氣泡法[12]、懸滴法[13]等。天平法除了能夠測量表面張力外，也被用來測量表面壓力-表面積等溫線[1]。雖然操作簡單，但是所需樣本量大，同時(shí)存在表面活性劑膜泄漏的問題，因此不適用于表面張力的動(dòng)態(tài)測量。捕獲氣泡法不存在膜泄漏的問題，能夠再現(xiàn)肺泡環(huán)境，然而該方法受到光學(xué)限制，不適用于不透明的混濁液體的研究。懸滴法很好地克服了以上測量方法的缺點(diǎn)，不僅所需樣本量小，而且允許測量動(dòng)態(tài)和超低表面張力，因此非常適合測量肺內(nèi)液這類量少且珍貴的液體。筆者設(shè)計(jì)了一套基于懸滴法的肺內(nèi)液表面張力測量實(shí)驗(yàn)裝置，就懸滴法的原理、軟硬件設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和測量誤差進(jìn)行了詳細(xì)的介紹。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)硬件及軟件

實(shí)驗(yàn)裝置的硬件部分包括：環(huán)形燈（Model YRL-74-60-W）、電源適配器（Model YNAPS-24W24-2T）、濾光片（藍(lán)色）（飛爾光學(xué)技術(shù)有限公司，中國），一次性無菌注射器（2.5 mL）、注射器針頭（內(nèi)徑0.84 mm）（康德萊公司，中國），光學(xué)顯微鏡頭、電荷耦合器件型（charge coupled device，CCD）相機(jī)（MER-500-14GC）（大恒公司，中國），帶刻度的二維光學(xué)移動(dòng)平臺(tái)（深圳豐華精機(jī)有限公司，中國）。

實(shí)驗(yàn)裝置的軟件部分包括：相機(jī)配套軟件GigE IP Configurator（×64）和Daheng MER-Series Viewer（×64）軟件，Visual Studio 2017（微軟公司，美國）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)樣本

（1）標(biāo)準(zhǔn)液樣本：二甲基硅油[道康寧（中國）有限公司]（黏度350 cP，密度0.970 g/cm3）和純水。二甲基硅油表面張力標(biāo)準(zhǔn)值21.10 mN/m（25℃）；水的密度0.997 g/cm3，水表面張力標(biāo)準(zhǔn)值72.00 mN/m（25℃）。

（2）臨床標(biāo)本：在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院手術(shù)重癥監(jiān)護(hù)病房招募了5例接受機(jī)械通氣的ARDS患者，取得其肺內(nèi)液（與患者簽訂知情同意書，獲得倫理委員會(huì)證明）。

1.2 方法

1.2.1 懸滴法基本原理

懸滴法測量液體表面張力的原理[14，15]：當(dāng)液滴靜止懸掛于毛細(xì)管口時(shí)，其外形由重力和表面張力共同決定且為軸對稱圖形（圖1）。通過對液滴外形輪廓的采集，根據(jù)重力和表面張力平衡的關(guān)系即可求得液體表面張力。該方法基于Young-Laplace方程，在液滴表面上任意一點(diǎn)P（x，z）建立方程：

其中：ΔP表示P點(diǎn)界面上的壓力差；R1、R2為P點(diǎn)處的第一和第二曲率半徑；γ為液體的表面張力。當(dāng)液滴在表面張力和重力作用下處于平衡狀態(tài)時(shí)，液滴的壓強(qiáng)符合如下規(guī)律：

其中：ΔP0為懸滴液頂點(diǎn)處界面的壓力差；Δρ為懸滴界面的密度；g為重力加速度。根據(jù)靜力平衡與曲率半徑幾何關(guān)系，得到：

其中：R0表示原點(diǎn)處的曲率半徑；θ為P點(diǎn)的法線與對稱軸的夾角；β被稱為形狀因子。

通過邊角的相互關(guān)系和4階Runge-Kutta法求解方程式（3），可以得到液滴的理想曲線。每一個(gè)形狀因子β都對應(yīng)一條擬合曲線，在β的變化范圍內(nèi)可以得到一組不同的擬合曲線（xi，zi），i=1，2，3，…，n，該擬合曲線與液滴的實(shí)際輪廓點(diǎn)（Xi，Zi）之間距離的平方和作為目標(biāo)函數(shù)：

目標(biāo)函數(shù)E是關(guān)于β、R0的函數(shù)，其求解過程計(jì)算量大，通常利用單純形法和二階Newton-Raphson求解[13]。目標(biāo)函數(shù)（5）滿足收斂條件且取最小值時(shí)得到β和R0的解，根據(jù)方程式（4）可知，只要確定了β、R0也就確定了表面張力γ。這種將液滴的實(shí)際輪廓與理論曲線擬合的計(jì)算表面張力的方法稱為軸對稱液滴形狀分析法。見圖1。

圖1 懸滴幾何外形示意圖Fig.1 Geometry schematic diagram of pendant drop

1.2.2 懸滴法邊緣檢測方法

懸滴法測量表面張力需要獲得液滴的幾何圖形，對液滴圖形提取輪廓后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。軸對稱液滴形狀分析算法對圖像精度要求十分嚴(yán)格，要求圖像邊緣清晰，檢測過程中錯(cuò)誤率低、定位準(zhǔn)確。常用的邊緣檢測算法[16]有Sobol算子、Prewitt算子和Canny算子等。Sobol算子和Prewitt算子均對邊緣定位的準(zhǔn)確度不高，無法達(dá)到軸對稱液滴圖像分析算法對圖像的精度要求。在這一點(diǎn)來講，Canny算子相比于其他算子更為優(yōu)異。

該裝置采用OpenCV圖像處理庫中的Canny算子來提取液滴輪廓邊緣。Canny算子邊緣檢測的原理是通過圖像信號(hào)函數(shù)的極大值來判定圖像的邊緣像素點(diǎn)，主要包含以下4個(gè)步驟。

（1）高斯濾波：其主要目的是降噪，用一個(gè)高斯矩陣乘以每一個(gè)像素點(diǎn)及鄰域，取其權(quán)重的平均值作為最后的灰度值。

（2）計(jì)算梯度值和梯度方向：通常圖像中灰度值的變化程度和方向用梯度表示。點(diǎn)乘Sobel或者其他算子獲得x方向的偏導(dǎo)矩陣Gx和y方向的偏導(dǎo)數(shù)矩陣Gy，綜合以下公式計(jì)算梯度值和方向：

（3）過濾非最大值：從上一步得到的梯度圖像存在邊緣粗寬、弱邊緣干擾等眾多問題，通過尋找像素局部的最大值，將非極大值點(diǎn)所對應(yīng)的灰度值設(shè)置為0，以剔除大部分非邊緣的像素點(diǎn)。

（4）雙閾值算法檢測圖像邊緣：設(shè)置高閾值和低閾值進(jìn)行邊緣檢測，將小于低閾值的點(diǎn)定為假邊緣置0，將大于高閾值的點(diǎn)定為強(qiáng)邊緣置1；對于中間的像素點(diǎn)，如果與確定為邊緣的像素點(diǎn)鄰接，則判定為邊緣，否則為非邊緣。

圖2為溫室下采集到的水滴圖像，A為液滴源圖像，B為Canny算子提取液滴邊緣輪廓的效果圖。

圖2 Canny算子邊緣檢測Fig.2 Images of edge detection by Canny detector

1.2.3 實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)

（1）硬件部分：實(shí)驗(yàn)裝置主要由光源、散光片、液滴形狀產(chǎn)生裝置、圖像采集裝置和計(jì)算機(jī)等部分組成（圖3）。光源部分包括環(huán)形燈和電源適配器，提供不同強(qiáng)度的平行光。濾光片在保證光照強(qiáng)度的同時(shí)有效地減少色差的影響，避免出現(xiàn)水滴邊緣圖像的模糊和失真。液滴形狀產(chǎn)生裝置包括一次性無菌注射器和注射器針頭等，注射器針頭末端已磨成圓平面（由于液滴輪廓距針頭末端有一小段距離，針頭末端平面對液滴圖片質(zhì)量基本無影響）。圖像采集裝置包括光學(xué)顯微鏡頭、CCD相機(jī)及帶刻度的二維光學(xué)移動(dòng)平臺(tái)，通過光學(xué)鏡頭和CCD相機(jī)的配合使用，可以有效地減少對焦不準(zhǔn)和光學(xué)畸變的影響，進(jìn)而提高液滴圖像的質(zhì)量；計(jì)算機(jī)主要用來控制CCD相機(jī)、存儲(chǔ)采集到的圖片和計(jì)算表面張力。

圖3 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.3 Schematic diagram of experimental device

實(shí)驗(yàn)過程中需注意以下幾點(diǎn)：①避免振動(dòng)因素影響圖像獲取，最好將整個(gè)實(shí)驗(yàn)放置在減振實(shí)驗(yàn)臺(tái)上；②為保證后期圖像處理中坐標(biāo)與測距準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)采用水平管調(diào)節(jié)液滴產(chǎn)生裝置處于水平位置。

（2）軟件部分。根據(jù)測量需求，該裝置采用大恒公司配套軟件GigE IP Configurator（×64）取得相機(jī)IP與計(jì)算機(jī)保持通信，利用Daheng MER-Series Viewer（×64）軟件控制相機(jī)獲取圖像，采用Visual Studio 2017開發(fā)相應(yīng)程序以實(shí)現(xiàn)如下功能。①讀入相機(jī)采集的圖片，調(diào)用OpenCV圖像處理模塊對圖像進(jìn)行邊緣提取等預(yù)處理。②依據(jù)針管的實(shí)際尺寸標(biāo)定圖像放大倍率，通過鼠標(biāo)獲取輪廓上需要的像素點(diǎn)。③通過Runge-Kutta和Newton迭代求解Young-Laplace方程和目標(biāo)函數(shù)，得到β和R0值。④輸入兩相密度值，根據(jù)公式（4）得出表面張力。其中，調(diào)用OpenCV圖像處理模塊對液滴進(jìn)行包括灰度處理、平滑濾波、圖像縮放，邊緣提取等一系列操作在內(nèi)的圖像處理。提取液滴輪廓邊緣之后，利用圖像處理庫中的At函數(shù)遍歷整個(gè)圖形像素，通過坐標(biāo)判斷求得輪廓邊緣坐標(biāo)點(diǎn)，進(jìn)而利用軸對稱液滴形狀分析算法求解表面張力。圖像處理流程和算法處理過程見圖4。

圖4 Visual Studio 2017圖像算法處理流程圖Fig.4 Flowchart of Visual Studio 2017 image algorithm processing

1.2.4 驗(yàn)證方法

實(shí)驗(yàn)在室溫（25℃）下進(jìn)行，選擇具有可靠表面張力數(shù)據(jù)的二甲基硅油及純水作為標(biāo)準(zhǔn)液對實(shí)驗(yàn)裝置的可靠性和測量精準(zhǔn)度進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)過程中保證光源、液滴和相機(jī)鏡頭在同一直線上。CCD相機(jī)與液滴位置固定，鏡頭聚焦在液滴上，使所得照片準(zhǔn)確清晰。推動(dòng)注射器形成液滴，待液滴頸部出現(xiàn)拐點(diǎn)之后，微調(diào)注射器，盡可能使液滴處于最大、最飽滿的形狀。為了保證采集到具有良好變形形狀的大液滴，將相機(jī)拍攝時(shí)間間隔設(shè)置為250 ms，在相機(jī)連續(xù)拍攝得到的一系列圖片中選擇液滴剛好脫落瞬間的前一張圖片（頸部區(qū)域出現(xiàn)拐點(diǎn)），對采集的圖像進(jìn)行輪廓提取和表面張力的計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)測量30滴液滴，計(jì)算其表面張力。并與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的表面張力儀SDC-200（盛鼎公司生產(chǎn)的商用表面張力儀，采用懸滴選面法[1]測量表面張力）所測得的同一樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)裝置的準(zhǔn)確性。

1.2.5 臨床試驗(yàn)

采用實(shí)驗(yàn)裝置對取自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房5例ARDS患者的肺內(nèi)液進(jìn)行了表面張力的測量。該研究由醫(yī)院的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得了患者或其代理人的書面知情同意。受樣本量的限制，每種樣本的試驗(yàn)次數(shù)并不一致：1～3號(hào)樣本量極少，只進(jìn)行了10次重復(fù)試驗(yàn)；4號(hào)樣本和5號(hào)樣本分別進(jìn)行了29次和54次試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)液表面張力驗(yàn)證

通過計(jì)算可知筆者實(shí)驗(yàn)裝置測得水和硅油表面張力值分別為（72.35±1.00）mN/m、（21.38±0.60）mN/m。二者的測量值與標(biāo)準(zhǔn)值相比，誤差分別為0.48 %、1.33%。利用SDC-200表面張力儀測得二者的表面張力為（71.55±1.03）mN/m、（20.76±1.03）mN/m。誤差分別為0.62%、1.61%。由此可知，與商用表面表面張力儀相比，筆者實(shí)驗(yàn)裝置具有較高準(zhǔn)確度。

2.2 急性呼吸窘迫綜合征患者肺內(nèi)液表面張力

在所測得的表面張力數(shù)據(jù)中，1～3號(hào)樣本肺內(nèi)液表面張力的均方差都較小（≤0.57 mN/m），4、5號(hào)樣本肺內(nèi)液表面張力存在較大的波動(dòng)。在5例肺內(nèi)液樣本測量結(jié)果中最小值為12.22 mN/m，最大值為35.11 mN/m。正常人的肺內(nèi)液表面張力值約為30 mN/m，試驗(yàn)證明了在疾病狀態(tài)下肺內(nèi)液表面張力會(huì)發(fā)生變化，潛在影響患者的呼吸力學(xué)。見圖5。

圖5 5例ARDS患者肺內(nèi)液表面張力測量結(jié)果Fig.5 Measurement results diagrams of pulmonary fluid surface tension in 5 ARDS patients

3 討論

首先討論該測量裝置的不確定度。Shardt N和Elliott JAW[17]報(bào)道溫度波動(dòng)對絕大多數(shù)化合物表面張力的影響小于0.25 mN/（m·K）。該實(shí)驗(yàn)中溫度變化嚴(yán)格控制在1℃以內(nèi)，因此由溫度引起的不確定度小于0.25 mN/（m·K）。實(shí)驗(yàn)測得的肺內(nèi)液最大表面張力小于35.11 mN/m，因此該測量不確定度對應(yīng)大約0.71%的相對誤差。此外，根據(jù)誤差傳播原理[18]及公式（4），表面張力的相對誤差公式為：

等式右側(cè)第一項(xiàng)表示流體密度測量的不確定度，通常小于0.2%。第二項(xiàng)為重力加速度不確定度，由于實(shí)驗(yàn)中重力加速度恒定不變，因此可以忽略不計(jì)。最后兩項(xiàng)源于圖像邊緣檢測時(shí)隨機(jī)擾動(dòng)所致的誤差，Saad SMI和Neumann AW[19]的研究表明該兩項(xiàng)誤差和小于1%。綜上所述，從每個(gè)誤差源傳播到γ總的不確定度小于2%。

研究表明[3，6]ARDS、新型冠狀病毒肺炎等肺部疾病通常伴有肺內(nèi)液體表面張力和流變學(xué)特性的異常改變，有可能導(dǎo)致上述疾病機(jī)械通氣治療時(shí)引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷。因此，肺內(nèi)液表面張力的定量測量對臨床機(jī)械通氣壓力的設(shè)置有重要的參考價(jià)值。1～4號(hào)臨床樣本的表面張力值略低于正常值，而5號(hào)臨床樣本的表面張力接近30 mN/m。這一實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明肺內(nèi)液表面張力在不同的患者表現(xiàn)出很大的差異性。測量肺內(nèi)液或者外源性表面活性劑的表面張力有利于將生理學(xué)原理與臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，探究疾病發(fā)展進(jìn)程，對于治療呼吸窘迫綜合征具有重要的臨床意義。臨床試驗(yàn)的樣本均為疾病狀態(tài)下的肺內(nèi)液，黏度較大且分布不均，在運(yùn)輸過程中存在振蕩問題，因此表面張力測量數(shù)據(jù)存在波動(dòng)。4、5號(hào)樣本誤差可能的原因在于：①樣本內(nèi)存在血色狀黏稠物；②液滴中存在氣泡。其中，由于樣本黏度較大導(dǎo)致液滴中存在氣泡且難以排空，對液滴形狀造成影響，不滿足懸滴法測量表面張力原理中液滴形狀只受液滴本身重力和表面張力的作用的限制性條件。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)了基于懸滴法的肺內(nèi)液表面張力測量裝置，懸滴圖像經(jīng)過Canny算子提取邊緣之后，利用軸對稱液滴形狀分析算法將Young-Laplace方程與液滴邊緣進(jìn)行擬合，從而求解表面張力。筆者設(shè)計(jì)的裝置不僅可以用于肺內(nèi)液表面張力的測量，在外源性表面活性劑的快速吸附成膜、表面活性劑膜的低壓縮性等相關(guān)特性的研究方面也具有一定的優(yōu)勢。試驗(yàn)對5例ARDS患者病理狀態(tài)下的肺內(nèi)液進(jìn)行了測量，發(fā)現(xiàn)在所測量的樣本中，表面張力最大值為35.11 mN/m，最小值為12.22 mN/m，測量的均方差均小于0.57 mN/m。同時(shí)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)液測量樣本的質(zhì)量（是否夾雜氣泡或者血色黏稠狀物等）對測量結(jié)果具有非常大的影響。該裝置仍然存在許多需要改進(jìn)的地方，由于振動(dòng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，可以考慮對實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)行機(jī)械設(shè)計(jì)，構(gòu)建減振平臺(tái)；肺內(nèi)液的表面張力的臨床數(shù)據(jù)一般是在37℃條件下測量的，因此可以考慮在實(shí)驗(yàn)裝置中加入溫控模塊，以獲得更加準(zhǔn)確和可信的數(shù)據(jù)。