楊海軍， 嚴(yán)寶飛， 張 寧， 劉美輝

(江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 211800)

結(jié)腸癌是全世界范圍內(nèi)第三大最常見的惡性腫瘤類型，同時被認(rèn)為是最致命的癌癥之一[1-2]。近年來，隨著人們生命周期的延長，結(jié)腸癌發(fā)病率正迅速增加[3-4]。盡管在結(jié)腸癌治療方面已取得了重大進(jìn)展，但患者預(yù)后仍不理想，術(shù)后并發(fā)癥及死亡率居高不下[4]。目前，結(jié)腸癌的靶向藥物治療和免疫治療取得了突破性進(jìn)展，但這些療法對于患者基因?qū)傩砸筝^高，且成本高昂，故化療依然是治療結(jié)腸癌的主要選擇[5-6]。奧沙利鉑為結(jié)腸癌的一線化療藥物，但長期應(yīng)用其化療可造成結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗[3-4]。因此，尋找能夠改善結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥性的藥物迫在眉睫。

黃酮類成分野黃芩苷在唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的根、莖、葉中含量較高，具有抗腫瘤、抗炎、抗血栓形成、神經(jīng)保護(hù)等顯著作用[7-9]。據(jù)報道，野黃芩苷能增敏順鉑對肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞的增殖抑制、促凋亡和自噬作用，同時降低順鉑腎毒性[10]。但尚未有研究報道野黃芩苷是否能增敏奧沙利鉑抗結(jié)腸癌作用，故本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116為對象，基于細(xì)胞活力、凋亡和自噬角度研究野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑對HCT116細(xì)胞的作用，并初步探討這些作用的可能機制，以期為改善結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥提供思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人源結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、飽和濕度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物 奧沙利鉑(純度≥99%，批號0124003)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；野黃芩苷(純度≥98%，批號YHQG20210106)，購自南京秋實生物科技有限公司。二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，批號V900090)、DMEM培養(yǎng)基(批號D6429)，購自德國默克公司；AnnexinV-FITC/PI試劑盒(批號C1062S)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Hochest染液(33342，批號BL803A)、JC-1熒光探針試劑盒(批號BL711A)，購自合肥白鯊生物科技有限公司；聚偏氟乙烯膜(PVDF，批號LC2002)、胎牛血清(批號10099141C)、BCA蛋白定量試劑盒(批號23246)，購自美國Thermo公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，批號5174T)、一抗微管相關(guān)蛋白l輕鏈3(LC3，批號12741S)、p62(批號23214S)、B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白(Bax，批號5023T)、B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2，批號15071T)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3，批號9661T)、二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(HRP-IgG，批號32935S)，購自美國Cell Signaling Technology公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK8，批號ab228554)、一抗p53(批號ab26)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK，批號ab184699)、磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK，批號ab201015)、蛋白激酶B(Akt，批號ab38449)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt，批號ab8805)、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(c-Met，批號ab51067)，購自英國Abcam公司。

1.3 儀器 PLUS-E2-20TJ型純水系統(tǒng)，購自南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；TS100型和TS2R型顯微鏡，購自日本尼康公司；MultiskanMK3型酶標(biāo)儀，購自美國Thermo公司；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀，購自美國BD公司；MINI-4型垂直電泳儀，購自美國Bio-Rad公司。

1.4 藥物配制 精密稱取野黃芩苷和奧沙利鉑適量，分別溶于無菌DMSO中，配制成200 mmol/L野黃芩苷母液(-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?和60 mmol/L奧沙利鉑母液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，再以培養(yǎng)基稀釋至實驗所需濃度。

1.5 CCK8法檢測HCT116細(xì)胞活力

1.5.1 野黃芩苷對細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，分別加入100 μL含0.1% DMSO(空白組)及40、80、120、160、200、240、280 μmol/L野黃芩苷的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度(A)，另設(shè)置不作任何處理的空白孔調(diào)零，計算細(xì)胞活力。

1.5.2 奧沙利鉑對細(xì)胞活力的影響 HCT116細(xì)胞按“1.5.1”項下方法處理，以100 μL含0.1% DMSO(空白組)及10、20、30、40、50、60 μmol/L奧沙利鉑的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，計算細(xì)胞活力。

1.5.3 野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑對細(xì)胞活力的影響 HCT116細(xì)胞按“1.5.1”項下方法處理，分為空白組、20 μmol/L奧沙利鉑組、25 μmol/L野黃芩苷組、50 μmol/L野黃芩苷組、20 μmol/L奧沙利鉑+25 μmol/L野黃芩苷組和20 μmol/L奧沙利鉑+50 μmol/L野黃芩苷組，隨后加入含對應(yīng)藥物的DMEM培養(yǎng)基，空白組加入含0.1% DMSO的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，計算細(xì)胞活力。

1.6 Hochest染色觀察細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期HCT116細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)24 h，分為空白組(含0.1% DMSO培養(yǎng)基)、奧沙利鉑組(20 μmol/L奧沙利鉑)、野黃芩苷組(50 μmol/L野黃芩苷)、藥物聯(lián)用組(20 μmol/L奧沙利鉑+50 μmol/L野黃芩苷)，加入相應(yīng)藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，參考文獻(xiàn)[11]報道進(jìn)行Hochest染色，并于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 HCT116細(xì)胞按“1.6”項下方法進(jìn)行分組及給藥，參考文獻(xiàn)[11]報道進(jìn)行Annexin V/PI雙染實驗，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位變化 HCT116細(xì)胞按“1.6”項下方法進(jìn)行分組及給藥，參考文獻(xiàn)[12]報道進(jìn)行JC-1熒光探針染色。正常細(xì)胞線粒體JC-1聚集在基質(zhì)中，以發(fā)射紅色熒光的聚合物存在；凋亡細(xì)胞JC-1主要存在于胞漿中，以發(fā)射綠色熒光的單體形式存在，因此，細(xì)胞JC-1探針由紅色熒光轉(zhuǎn)為綠色熒光時，可反映線粒體膜電位的變化。

1.9 Western blot法檢測凋亡、自噬及上游相關(guān)蛋白表達(dá) HCT116細(xì)胞按“1.6”項下方法進(jìn)行分組及給藥，參考文獻(xiàn)[11]報道進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗(ERK1/2、p-ERK1/2、p53、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Akt、p-Akt、c-Met、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影、成像，分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 野黃芩苷、奧沙利鉑及聯(lián)合用藥對HCT116細(xì)胞活力的影響 如圖1所示，野黃芩苷、奧沙利鉑均能抑制HCT116細(xì)胞活力，干預(yù)24 h的IC50值為185.10、40.05 μmol/L，并呈現(xiàn)劑量依賴性，因此選擇遠(yuǎn)低于其IC50值的25、50 μmol/L野黃芩苷和20 μmol/L奧沙利鉑進(jìn)行后續(xù)實驗。如圖2所示，與空白組比較，野黃芩苷各濃度組均對HCT116細(xì)胞無抑制作用(P>0.05)，而奧沙利鉑組及野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑組均能抑制HCT116細(xì)胞活力(P<0.01)；此外，野黃芩苷各濃度聯(lián)合奧沙利鉑組對HCT116細(xì)胞活力的抑制作用均強于奧沙利鉑組(P<0.05，P<0.01)，提示野黃芩苷能夠協(xié)同奧沙利鉑抑制HCT116細(xì)胞活力。

2.2 野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑對HCT116細(xì)胞生長的影響 空白組呈上皮細(xì)胞樣細(xì)胞貼壁生長，狀態(tài)正常；奧沙利鉑組和野黃芩苷組出現(xiàn)少量凋亡細(xì)胞；藥物聯(lián)用組HCT116細(xì)胞體積縮小，與周圍細(xì)胞脫離，出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，見圖3。結(jié)果提示，野黃芩苷能夠協(xié)同奧沙利鉑促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡。

2.3 Hochest染色檢測野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑對HCT116細(xì)胞凋亡的影響 空白組細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散均勻藍(lán)色熒光，形態(tài)正常；奧沙利鉑組和野黃芩苷組出現(xiàn)少量濃染致密的顆粒塊狀藍(lán)色熒光；藥物聯(lián)用組出現(xiàn)大量濃染致密的顆粒塊狀藍(lán)色熒光，細(xì)胞凋亡特征明顯，見圖4。結(jié)果提示，野黃芩苷可協(xié)同奧沙利鉑促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑對HCT116細(xì)胞凋亡的影響 與空白組比較，各用藥組HCT116細(xì)胞凋亡率均升高(P<0.05，P<0.01)，且藥物聯(lián)用組HCT116細(xì)胞凋亡率高于奧沙利鉑組(P<0.01)，見圖5。結(jié)果提示，野黃芩苷可協(xié)同奧沙利鉑促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡。

2.5 野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑對HCT116細(xì)胞線粒體膜電位的影響 空白組HCT116細(xì)胞JC-1染色以紅色熒光為主；奧沙利鉑組和野黃芩苷組細(xì)胞JC-1染色仍然以紅色熒光為主；藥物聯(lián)用組細(xì)胞JC-1染色由紅色熒光向綠色熒光偏移，見圖6。結(jié)果提示，野黃芩苷可協(xié)同奧沙利鉑降低HCT116細(xì)胞線粒體膜電位水平。

2.6 野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑對HCT116細(xì)胞中凋亡及其上游蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，奧沙利鉑組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)和ERK1/2蛋白磷酸化水平升高(P<0.05)，野黃芩苷組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，藥物聯(lián)用組Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值、cleaved caspase-3和p53蛋白表達(dá)及ERK1/2蛋白磷酸化水平均升高(P<0.01)；與奧沙利鉑組比較，藥物聯(lián)用組Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值、cleaved caspase-3和p53蛋白表達(dá)及ERK1/2蛋白磷酸化水平均升高(P<0.01)，見圖7。結(jié)果提示，野黃芩苷可協(xié)同奧沙利鉑發(fā)揮促凋亡作用，其機制可能與激活ERK/p53信號通路有關(guān)。

2.7 野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑對HCT116細(xì)胞中自噬及其上游蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，奧沙利鉑組p62蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，野黃芩苷組p62蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比值升高(P<0.01)，藥物聯(lián)用組p62、c-Met蛋白表達(dá)和Akt蛋白磷酸化水平均降低(P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比值升高(P<0.01)；與奧沙利鉑組比較，藥物聯(lián)用組p62、c-Met蛋白表達(dá)及Akt蛋白磷酸化水平均降低(P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比值升高(P<0.01)，見圖8。結(jié)果提示，野黃芩苷可協(xié)同奧沙利鉑發(fā)揮促自噬作用，其機制可能與抑制c-Met/Akt信號通路有關(guān)。

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡形式，可有序、有效去除受損細(xì)胞。凋亡細(xì)胞死亡機制的失調(diào)是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的標(biāo)志，亦是腫瘤產(chǎn)生耐藥性的重要原因[13-14]。線粒體途徑是凋亡發(fā)生的主要途徑之一，受到Bcl-2家族調(diào)節(jié)。Bcl-2家族成員之間的平衡及相互作用是確定細(xì)胞是否存活或凋亡的關(guān)鍵。正常細(xì)胞的促凋亡蛋白Bax主要存在于胞質(zhì)中，而抗凋亡蛋白Bcl-2存在于線粒體膜上[15]。當(dāng)線粒體凋亡啟動，Bax易位至線粒體中，增加線粒體膜通透性并激活caspase-3，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡進(jìn)入不可逆階段[16-17]。Bcl-2能夠拮抗Bax的線粒體膜孔形成活性，故Bax/Bcl-2是線粒體凋亡啟動的標(biāo)志[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨使用奧沙利鉑比較，野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑能夠上調(diào)HCT116細(xì)胞Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，表明野黃芩苷能夠協(xié)同奧沙利鉑發(fā)揮促凋亡作用。蛋白激酶ERK包括ERK1/2，磷酸化的ERK1/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，進(jìn)而活化多種轉(zhuǎn)錄因子。ERK在多種腫瘤中高度激活，驅(qū)動生長，抑制凋亡[18-19]。同時，ERK可以被抗腫瘤藥物激活，從而觸發(fā)其下游p53等腫瘤抑制蛋白，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生p53依賴的細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨使用奧沙利鉑比較，野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑能夠上調(diào)HCT116細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化水平及p53蛋白表達(dá)，表明野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑協(xié)同促凋亡機制可能與激活ERK/p53信號通路有關(guān)。

LC3是自噬發(fā)生的標(biāo)志之一。自噬形成時，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3(即LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值與自噬水平呈正相關(guān)[22-23]。p62被證實為自噬清除的標(biāo)志，可在自噬過程中被降解[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨使用奧沙利鉑比較，野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑能夠提升HCT116細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比值，抑制p62蛋白表達(dá)，表明野黃芩苷可協(xié)同奧沙利鉑發(fā)揮促自噬作用。c-Met為受體酪氨酸激酶家族成員，在結(jié)腸癌中可被激活，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療耐藥性聯(lián)系緊密[25]。據(jù)報道，c-Met的低表達(dá)可誘導(dǎo)肺胰腺癌等腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用[26-27]。c-Met下游重要途徑磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在各種癌癥的自噬中也可發(fā)揮調(diào)控作用，如抑制其表達(dá)可激活前列腺癌細(xì)胞自噬[28]，Akt抑制劑MK-2206可誘導(dǎo)耐藥肺癌細(xì)胞A549/DDP發(fā)生自噬[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨使用奧沙利鉑比較，野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑能夠下調(diào)HCT116細(xì)胞c-Met蛋白表達(dá)和Akt蛋白磷酸化水平，表明野黃芩苷聯(lián)合奧沙利鉑促進(jìn)自噬可能與抑制c-Met/Akt信號通路有關(guān)。

綜上所述，野黃芩苷能夠協(xié)同奧沙利鉑發(fā)揮抑制HCT116細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)凋亡和自噬，其潛在機制可能與激活ERK/p53和抑制c-Met/Akt信號通路有關(guān)。課題組后期將圍繞結(jié)腸癌細(xì)胞、結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞設(shè)計驗證實驗，以期深入揭示野黃芩苷和奧沙利鉑協(xié)同作用機制。