虞偉妃,汪笑秋,趙麗萍,周玨伊,馮繼紅

虞偉妃,汪笑秋,趙麗萍,周玨伊,馮繼紅,浙江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 浙江省杭州市 310053

虞偉妃,麗水市人民醫(yī)院腫瘤放化療科 浙江省麗水市 323000

0 引言

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用.腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞釋放的多種細(xì)胞因子、生長因子和炎癥介質(zhì)可直接影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,也可通過誘導(dǎo)生長信號的改變或激活細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞來間接影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[1,2].細(xì)胞因子在腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展中起著重要的作用,比如白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8和IL-22具有增強(qiáng)致瘤活性的作用[3-5],而IL-1和IL-21則能抑制腫瘤的生長[6,7].IL-32是一種由活化的T淋巴細(xì)胞、自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子[8].據(jù)報(bào)道,IL-32可參與調(diào)節(jié)胃癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,比如,IL-32可促進(jìn)肺癌和胃癌細(xì)胞的生長與遷移[9,10],而在結(jié)直腸癌和乳腺癌中則能發(fā)揮抑癌作用[11,12].造成這種情況的原因可能與IL-32的亞性多樣性以及不同癌種相關(guān).目前發(fā)現(xiàn)IL-32具有α、β、γ、δ、ε、η、s、θ和ζ 9種亞性,其中IL-32γ的活性最強(qiáng)[8].IL-32γ已被證明在食管癌患者的癌細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞以及T細(xì)胞中高表達(dá)[13].但I(xiàn)L-32γ在NK細(xì)胞中高表達(dá)對其食管癌的作用并不清楚.因此,本研究分析IL-32γ在NK細(xì)胞表達(dá)水平與食管癌細(xì)胞之間的聯(lián)系.

1 材料和方法

1.1 材料 RPMI-1640培養(yǎng)基(上海中喬新舟生物科技有限公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);IL-2細(xì)胞因子(北京百普賽斯生物科技有限公司);靶向IL-32γ的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)(shIL-32γ#1和shIL-32γ#2)以及對照shNC(上海生工生物工程有限公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒(廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司);Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(武漢普諾賽生命科技有限公司);5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine,EDU)試劑(蘇州宇恒生物科技有限公司);IL-32γ抗體(克隆號KU32-52,美國Biolegend公司);shRNA轉(zhuǎn)染試劑以及腫瘤壞死因子受體超族成員6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6,FAS)、死亡受體3(death receptor 3,DR3)和腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor 2,TNFR2)抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司);B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific proteases 3,Caspase 3)抗體(美國Cell Signaling Technology公司);辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠二抗體(萬類生物科技有限公司).

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng): NK-92細(xì)胞和食管癌細(xì)胞株Eca9706和TE-1購自武漢普諾賽生命科技有限公司.將NK-92細(xì)胞置于含10%胎牛血清和10 ng/mL IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基中,將Eca9706和TE-1細(xì)胞分別置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng).共培養(yǎng)體系: 分別將Eca9706或TE-1細(xì)胞接種在不同規(guī)格(96孔和6孔)Transwell共培養(yǎng)體系(孔經(jīng)0.4 μm,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和10 ng/mL IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基)的下室,待細(xì)胞貼壁后,按照效靶比(1:1、2:1和5:1)的比例將NK-92細(xì)胞接入上室,共培養(yǎng)48 h.

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染: 將NK-92細(xì)胞置于含10%胎牛血清和10 ng/mL IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長過夜,次日達(dá)到80%匯合時(shí),更換無血清培養(yǎng)基孵育6 h,并按shRNA轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染方案說明書步驟,將shIL-32γ#1、shIL-32γ#2以及對照shNC分別轉(zhuǎn)入NK-92細(xì)胞.6 h后,更換完全培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)48 h.Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率后,將細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.3 細(xì)胞活性檢測: 分別將Eca9706或TE-1細(xì)胞接種于96孔Transwell共培養(yǎng)體系(5000細(xì)胞/孔)的下室,細(xì)胞貼壁后,上室按不同效靶比接入轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的NK-92細(xì)胞,共培養(yǎng)48 h.將含NK-92細(xì)胞的插入小室取出,加10 μL CCK-8試劑入下室,孵育2 h后,酶標(biāo)儀波長490 nm處檢測吸光度值.

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測: 分別將Eca9706或TE-1細(xì)胞接種于96孔Transwell共培養(yǎng)體系(5000細(xì)胞/孔)的下室,細(xì)胞貼壁后,上室按效靶比5:1(即2.5×104細(xì)胞/孔)接入轉(zhuǎn)染的NK-92細(xì)胞,共培養(yǎng)48 h.將含NK-92細(xì)胞的插入小室取出,加50 μM EDU試劑入下室,孵育2 h后,熒光顯微鏡觀察EDU陽性細(xì)胞.

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測: 分別將Eca9706或TE-1細(xì)胞接種于6孔Transwell共培養(yǎng)體系(1.5×105細(xì)胞/孔)的下室,細(xì)胞貼壁后,上室按效靶比5:1(即7.5×105細(xì)胞/孔)接入轉(zhuǎn)染的NK-92細(xì)胞,共培養(yǎng)48 h.將含NK-92細(xì)胞的插入小室取出,收集下室EC9706或TE-1細(xì)胞.按照試劑盒說明書步驟,分別對Eca9706或TE-1細(xì)胞在暗室孵育Annexin V和PI試劑,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡比例.1.2.6 蛋白表達(dá)檢測: 分別將Eca9706或TE-1細(xì)胞接種于6孔Transwell共培養(yǎng)體系(1.5×105細(xì)胞/孔)的下室,細(xì)胞貼壁后,上室按效靶比5:1(即7.5×105細(xì)胞/孔)接入轉(zhuǎn)染的NK-92細(xì)胞,共培養(yǎng)48 h.將含NK-92細(xì)胞的插入小室取出,收集下室EC9706或TE-1細(xì)胞.用RIPA裂解細(xì)胞并提取蛋白.將蛋白通過Western blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至PVDF膜.將膜用5%脫脂乳封閉后,室溫分別孵育IL-32γ、FAS、DR3、TNFR2、Caspase-3和β-actin抗體(均1:1000)2 h,洗膜后,分別孵育對應(yīng)的二抗.用化學(xué)發(fā)光法顯示條帶,并用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像,并用自帶軟件分析蛋白相對表達(dá)量.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD).采用方差分析各組的差異,用事后檢驗(yàn)法對各組均數(shù)進(jìn)行多重比較.P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 NK-92細(xì)胞與Eca9706或TE-1細(xì)胞的效靶比選擇如圖1所示,與對照組(效靶比0:1)比較,在NK-92細(xì)胞與Eca9706或TE-1細(xì)胞的效靶比1:1、2:1和5:1時(shí),Eca9706或TE-1細(xì)胞的細(xì)胞活性均降低(P＜0.05或P＜0.01),且效靶比5:1時(shí)效果差異最為明顯,后續(xù)選擇效靶比5:1.

圖1 NK-92細(xì)胞對食管癌細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響.A: NK-92細(xì)胞對Eca9706細(xì)胞活性的影響;B: NK-92細(xì)胞對TE-1細(xì)胞活性的影響.mean±SD,n=3,與對照組(效靶比0:1)相比,aP＜0.05,bP＜0.01.

2.2 敲降N K-92細(xì)胞中I L-32γ增加共培養(yǎng)體系中Eca9706或TE-1細(xì)胞的細(xì)胞活性 如圖2A所示,與對照組或sh-NC轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染shIL-32γ(shIL-32γ#1和shIL-32γ#2)能抑制IL-32γ表達(dá).將NK-92細(xì)胞與Eca9706或TE-1細(xì)胞按效靶比(5:1)共培養(yǎng)48 h,與NK-92共培養(yǎng)組(NK-92與Eca9706或TE-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系)比較,NK-92-shIL-32γ#1或shIL-32γ#2共培養(yǎng)組(shIL-32γ#1或shIL-32γ#2轉(zhuǎn)染的NK-92與Eca9706或TE-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系)中Eca9706和TE-1細(xì)胞的活性明顯增加(P＜0.01,圖2B和C).同時(shí),EDU法顯示,NK-92-shIL-32γ#1/shIL-32γ#2共培養(yǎng)組Eca9706或TE-1細(xì)胞中的EDU陽性細(xì)胞數(shù)相對NK-92共培養(yǎng)組增多(圖2D和E).

圖2 敲降NK-92細(xì)胞中IL-32γ能逆轉(zhuǎn)NK-92對食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用.A: shIL-32γ轉(zhuǎn)染效率鑒定;B,C: 各組共培養(yǎng)體系中Eca9706(B)和TE-1(C)細(xì)胞的細(xì)胞活性;D,E: 各組共培養(yǎng)體系中Eca9706(D)和TE-1(E)細(xì)胞的EDU陽性細(xì)胞染色圖.mean±SD,n=3,與對照組相比,aP＜0.01;與NK-92共培養(yǎng)組相比,bP＜0.01.IL-32γ: 白細(xì)胞介素-32γ;EDU: 5-乙炔基-2’-脫氧尿苷.

2.3 敲降NK-92細(xì)胞中IL-32γ能抑制NK-92誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞凋亡 如圖3所示,與NK-92共培養(yǎng)組比較,NK-92-shIL-32γ#1或shIL-32γ#2共培養(yǎng)組的Eca9706和TE-1細(xì)胞的凋亡明顯降低(P＜0.01,圖3A和B),Eca9706(圖3C和D)和TE-1細(xì)胞(圖3E和F)中Bcl-2的表達(dá)均明顯增加(P＜0.01),Bax和Cleaved caspase-3表達(dá)明顯降低(P＜0.01).

圖3 敲降NK-92細(xì)胞中IL-32γ能抑制NK-92誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞凋亡.A,B: 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡;C,D: Western blot檢測各組Eca9706細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3表達(dá);E,F: Western blot檢測各組TE-1細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3表達(dá).mean±SD,n=4,與NK-92共培養(yǎng)組相比,aP＜0.01.IL-32γ: 白細(xì)胞介素-32γ;Cleaved caspase-3: 裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3;Bcl-2: B淋巴細(xì)胞瘤-2;Bax: Bcl-2相關(guān)X蛋白.

2.4 敲降NK-92細(xì)胞中IL-32γ能抑制共培養(yǎng)體系中食管癌細(xì)胞死亡受體相關(guān)蛋白表達(dá) 如圖4所示,與NK-92共培養(yǎng)組比較,NK-92-shIL-32γ#1或shIL-32γ#2共培養(yǎng)組Eca9706(圖4A和B)和TE-1(圖4C和D)細(xì)胞中FAS、DR3和TNFR2表達(dá)均明顯降低(P＜0.01).

圖4 敲降NK-92細(xì)胞中IL-32γ能抑制共培養(yǎng)體系中食管癌細(xì)胞死亡受體相關(guān)蛋白表達(dá).A,B: Western blot檢測各組Eca9706細(xì)胞中FAS、DR3和TNFR2表達(dá);C,D: Western blot檢測各組TE-1細(xì)胞中FAS、DR3和TNFR2表達(dá).mean±SD,n=4,與NK-92共培養(yǎng)組相比,aP＜0.01.FAS: 腫瘤壞死因子受體超族成員6;DR3: 死亡受體3;TNFR2: 腫瘤壞死因子受體2.

3 討論

食管癌是嚴(yán)重影響人類健康的的常見腫瘤類疾病之一,約90%的食管癌為食管鱗狀細(xì)胞癌,其早期癥狀不明顯,易錯(cuò)診[14].雖然近年來食管癌診治手段有所進(jìn)步,但晚期食管鱗狀細(xì)胞癌患者的總體治療效果仍不令人滿意[15],因此,對其有更深入的認(rèn)識并積極尋找其他有效的治療方法迫在眉睫.

NK細(xì)胞可通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性來清除腫瘤細(xì)胞,其在腫瘤的天然免疫防御中發(fā)揮重要作用[16].IL-2、IL-12和IL-18雖然被發(fā)現(xiàn)其能活化NK細(xì)胞和增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng),但這些細(xì)胞因子在高劑量系統(tǒng)給藥后具有明顯的毒性[17,18].IL-32γ在活化的NK細(xì)胞中過表達(dá),并且能誘導(dǎo)分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α[19],且IL-32γ過表達(dá)可增強(qiáng)NK細(xì)胞的易感性,并增加IFNγ和TNF-α的生成[20].另外研究顯示,TNF-α又可通過TNFR2來激活NK細(xì)胞毒性[21].但NK細(xì)胞中IL-32γ表達(dá)是否對其發(fā)揮抗食管癌的作用的影響目前尚不清楚.本研究顯示,敲降NK-92細(xì)胞中IL-32γ表達(dá)后,NK-92細(xì)胞對食管癌細(xì)胞的殺傷作用降低,提示IL-32γ是NK-92細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的必要細(xì)胞因子.活化的NK細(xì)胞能釋放如TNF-α/β、FASL等多種TNF配體[22,23].這些配體成員與對應(yīng)的TNF受體(又稱死亡受體)結(jié)合后,能通過死亡結(jié)構(gòu)域招募并激活caspase-8,活化的caspase-8能直接活化caspase-3也可通過影響B(tài)cl-2和Bax表達(dá)隨后激活下游效應(yīng)caspase-9、-7和-3[24,25].本進(jìn)一步對敲降IL-32γ的作用機(jī)制進(jìn)行探索,結(jié)果顯示,在與轉(zhuǎn)染shIL-32γ的NK-92細(xì)胞構(gòu)成共培養(yǎng)體系的食管癌細(xì)胞中死亡受體家族成員FAS、DR3和TNFR2以及凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved caspase-3表達(dá)降低,同時(shí)Bcl-2表達(dá)增加.以上結(jié)果說明,敲降NK-92細(xì)胞中IL-32γ表達(dá)能減弱NK-92細(xì)胞對食管癌細(xì)胞的殺傷作用,且此作用可能與降低食管癌細(xì)胞中死亡受體表達(dá)和caspase-3通路激活有關(guān).

4 結(jié)論

綜上所述,IL-32γ是NK細(xì)胞在發(fā)揮抗食管癌效應(yīng)的必要細(xì)胞因子,缺失IL-32γ能導(dǎo)致NK細(xì)胞對食管癌細(xì)胞的殺傷作用減弱.另外,這一結(jié)果還提示了: 也許IL-32γ給藥可能是治療食管癌的潛在方法之一,但這一方法仍需大量研究驗(yàn)證.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

活化的自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用,但NK細(xì)胞的活化又受到腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、生長因子和炎癥介質(zhì)的影響.

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-32γ已被發(fā)現(xiàn)其在活化的NK細(xì)胞表達(dá)升高,但并不清楚NK細(xì)胞中IL-32γ的表達(dá)水平是否影響其對食管癌細(xì)胞的殺傷作用.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

研究NK細(xì)胞中IL-32γ的表達(dá)水平對其殺傷食管癌細(xì)胞的影響,并分析其中涉及的機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

用基因干擾法敲降NK-92細(xì)胞中IL-32γ的表達(dá)后,將其分別與食管癌細(xì)胞EC9706和TE-1(靶細(xì)胞)構(gòu)成共培養(yǎng)體系,檢測EC9706和TE-1細(xì)胞的活性、增殖和凋亡情況以及死亡受體途徑和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

敲降NK-92細(xì)胞中IL-32γ的表達(dá)能促進(jìn)靶細(xì)胞EC9706和TE-1的活性和增殖、抑制細(xì)胞凋亡,并減弱死亡受體途徑以及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinecontaining aspartate-specific proteases 3,caspase-3)的激活.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

敲降IL-32γ能降低NK細(xì)胞對食管癌細(xì)胞的殺傷作用.

展望前景

靶向過表達(dá)NK細(xì)胞中IL-32γ表達(dá)可能是食管癌治療的潛在策略之一.