黃建睿，陳 濤，繆紳裕

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.深圳市中國科學(xué)院仙湖植物園，廣東 深圳 518004）

葉綠體是質(zhì)體家族中的一種細(xì)胞器，含有豐富的葉綠素，是綠色植物進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化和光合作用的主要場所，賦予植物在地球生態(tài)環(huán)境中充當(dāng)生產(chǎn)者的角色。此外，葉綠體是許多生化過程的基本場所，如氨基酸、核苷酸、脂肪酸、植物激素、維生素的合成以及硫和氮的同化［1］。葉綠體中具有半自主性的細(xì)胞器，自身擁有相對獨(dú)立的遺傳物質(zhì)，即葉綠體基因組DNA（cpDNA），其結(jié)構(gòu)一般為雙鏈環(huán)狀的DNA 分子，少數(shù)為線形，是僅次于核基因組的第二大基因組［2］。與核基因組相比，葉綠體基因組因其相對穩(wěn)定的基因組結(jié)構(gòu)、基因內(nèi)容和基因序列，已被證明是用于遺傳多樣性評估的DNA 條形碼的重要數(shù)據(jù)來源，被廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)學(xué)研究［3］。葉綠體基因組按功能可分為遺傳系統(tǒng)基因、光合系統(tǒng)基因、合成系統(tǒng)基因、功能未知基因4類［4］。葉綠體基因組由于拷貝數(shù)高、母系遺傳、基因結(jié)構(gòu)和排列保守的特點(diǎn)，是研究近緣物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的有力工具［5-7］。在被子植物中，葉綠體的進(jìn)化速率也極其緩慢［8］。植物葉綠體基因組為系統(tǒng)發(fā)育、DNA 條形碼和種群間生物地理學(xué)提供了寶貴的資源。基因組學(xué)研究在基因組序列的遺傳組成、結(jié)構(gòu)、組織、功能多樣性中，發(fā)揮了重要作用，尤其在系統(tǒng)發(fā)育研究中，能夠直觀地體現(xiàn)出植物間的進(jìn)化關(guān)系［9-10］。

紫薇屬（Lagerstroemia）隸屬于千屈菜科（Lythraceae），全世界約有60 種紫薇屬植物，目前已培育出500 多個品種［11］。我國現(xiàn)有紫薇屬植物21 種，其中大花紫薇（Lagerstroemia speciosa）、南洋紫薇（L.siamica）、棱萼紫薇（L.turbinate）從東南亞引入［12］。紫薇屬植物多為落葉或常綠灌木或喬木，樹干多光滑，木材堅硬、耐腐，可作家具木材、建筑等使用，分布于亞洲東部、東南部、南部的熱帶、亞熱帶等地區(qū)［13］。紫薇（Lagerstroemia indicaL.）原產(chǎn)于中國，至少有1 500 年的種植歷史，隨后被引種到美國南部，采取雜交育種、誘變育種等多種培育方式，開始了紫薇屬植物在國外的育種歷程［14］。大多數(shù)紫薇屬植物具有大而美麗的圓錐花序，花期通常在夏季和秋季持續(xù)約3 個月或更久。此外，紫薇屬植物具有一定的藥用價值，根和枝葉入藥可用于治療過敏反應(yīng)，具有止癢功效，而花和葉入藥有清熱解毒、利尿的效果，其葉子還可通過吸收煙霧和灰塵來凈化空氣，因而紫薇屬植物作為觀賞、藥用兼環(huán)保的優(yōu)良花木，在園藝和園林應(yīng)用中具有重要價值［15-17］。

本文以葉綠體基因組的研究現(xiàn)狀為背景，歸納紫薇屬植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征，總結(jié)了紫薇屬葉綠體基因組在DNA 條形碼、簡單重復(fù)序列以及系統(tǒng)發(fā)育中的應(yīng)用，并分析了已完成序列測定的22 種植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，旨在進(jìn)一步歸納總結(jié)紫薇屬葉綠體基因組的研究現(xiàn)狀以及應(yīng)用前景，為紫薇屬植物種質(zhì)資源鑒定、分類和系統(tǒng)發(fā)育分析等方面的進(jìn)一步研究提供理論鋪墊，同時為紫薇屬其他物種的葉綠體基因組研究以及物種進(jìn)化和親緣關(guān)系分析等研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 葉綠體基因組研究概況

1.1 葉綠體全基因組序列測定

1986 年，植物葉綠體基因組的全序列測定最早在煙草（Nicotiana tabacum）中發(fā)表［18］。近年來，由于測序技術(shù)的不斷發(fā)展，測序成本逐漸降低，利用快速發(fā)展的第二代測序技術(shù)，越來越多物種的葉綠體基因組先后被測序用于系統(tǒng)發(fā)育研究，美國國家生物技術(shù)中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）中關(guān)于葉綠體全基因組的數(shù)據(jù)不斷被增加充實(shí)。

最初，基因組測序主要使用以Sanger 測序為核心的測序技術(shù)，該法需要分離純化葉綠體基因組DNA 或者構(gòu)建全基因組細(xì)菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）文庫，再利用含有物種葉綠體DNA 片段的載體進(jìn)行測序，過程復(fù)雜且難度大，測序耗時長、成本高，因此未被大范圍使用。直到新一代高通量測序的出現(xiàn)，極大地擴(kuò)大了測序通量，縮短了測序時長，為大規(guī)模葉綠體基因組測序提供了可能［19-21］。隨著測序成本的顯著降低，對整個葉綠體基因組進(jìn)行測序變得更為便捷。目前，NCBI 數(shù)據(jù)庫已獲得超過900 個陸地植物完整的葉綠體基因組［22］。此外，在葉綠體全基因組中開發(fā)了眾多組裝軟 件，如 GetOrganelle［23］、Fast-Plast［24］、NOVOPlasty［25］、ORG.Asm［26］、chloroExtractor［27］、IOGA［28］、Chloroplast assembly protocol［29］等。

1.2 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)研究

葉綠體全基因組序列由于其相對穩(wěn)定的基因組結(jié)構(gòu)、基因內(nèi)容和基因序列，已被廣泛接受為在分子進(jìn)化方面有價值的數(shù)據(jù)來源。葉綠體基因組具有高度保守的環(huán)狀DNA 結(jié)構(gòu)，少數(shù)為線形，是僅次于核基因組的第2 大基因組［30］。葉綠體基因組結(jié)構(gòu)通常為高度保守的四分體結(jié)構(gòu)，通常由1 個大單拷貝區(qū)（Large Single Copy，LSC）、1 個小單拷貝區(qū)（Small Single Copy，SSC）和2 個反向重復(fù)區(qū)（Inverted Repeats，IRs）組成。LSC區(qū)長約81～90 kbp，SSC 區(qū)范圍在18～20 kbp，2 個反向重復(fù)區(qū)大小介于20～30 kbp［31］。雖然葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)和大小高度保守，但I(xiàn)R/SC 邊界區(qū)域的擴(kuò)張和收縮常被認(rèn)為是造成高等植物葉綠體基因組長度差異的主要原因［32］。大多數(shù)被子植物的葉綠體基因組大小在107～218 kbp之間，由大約120 個基因組成，分別編碼rRNA、tRNA和蛋白質(zhì)［33］。雖然葉綠體基因組結(jié)構(gòu)高度保守，但也會發(fā)生基因缺失現(xiàn)象，且可能存在突變熱點(diǎn)［34-35］，這為紫薇屬葉綠體基因組的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

2 紫薇屬植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)研究現(xiàn)狀

2.1 紫薇屬植物葉綠體基因組測序

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，高通量技術(shù)的進(jìn)步降低了測序成本，極大地促進(jìn)了基因組和系統(tǒng)發(fā)育研究的進(jìn)步。越來越多物種的葉綠體基因組序列被測序，這對紫薇屬植物葉綠體基因組的比較研究提供了一定的分子基礎(chǔ)，有助于提升對其葉綠體基因組應(yīng)用價值的評價。目前，NCBI 顯示已完成22 種紫薇屬植物的葉綠體全基因組測序。表1 為目前已完成葉綠體全基因組測序的紫薇屬植物和5 個近緣屬的相關(guān)信息。

表1 來源于NCBI 的紫薇屬植物和外群葉綠體基因組序列Table 1 Chloroplast genome sequence of Lagerstroemia and outgroups derived from NCBI

2.2 紫薇屬植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載紫薇（L.indica）和絨毛紫薇（L.tomentosa）的葉綠體基因組序列，登錄號分別為NC_030484、MT019851，使用OGDRAW 在線軟件生成葉綠體基因組圖譜。由圖1 和圖2 可知，紫薇屬植物的葉綠體基因組呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，為高度保守的四分體結(jié)構(gòu)，其葉綠體基因組通常也由4 部分組成，分別為1 個大單拷貝區(qū)（LSC）、1 個小單拷貝區(qū)（SSC）和2 個反向重復(fù)區(qū)（IRs），其中2 個反向重復(fù)區(qū)域的序列相同，但方向相反，通常命名為IRa、IRb，該區(qū)域會在紫薇屬葉綠體基因組進(jìn)化過程中延伸或者縮??；LSC 和SSC 區(qū)的變異大于IR 區(qū)，非編碼區(qū)的分化程度大于編碼區(qū)［36］。由表2 可知，22種紫薇屬植物的葉綠體基因組大小約為150 kbp，最大的L.venusta長度為152 521 bp，最小的L.guilinensis長度為151 968 bp，其中LSC 區(qū)長度為83～84 kbp，SSC 區(qū)長度約為16 kbp，IR 區(qū)約為25 kbp，葉綠體基因組中嘌呤（GC）含量為37.6%～37.7%。紫薇屬植物的葉綠體基因組的基因數(shù)量大多為112 個，其中包括78 個蛋白編碼基因、30 個tRNA 基因、4 個rRNA 基因，但L.balansae的葉綠體基因組含有130 個基因，包括85 個蛋白編碼基因、37 個tRNA 基因、8 個rRNA 基因。葉綠體基因組雖然在基因結(jié)構(gòu)上高度保守，但I(xiàn)R/SC 邊界區(qū)域的擴(kuò)張和收縮引起的IR/SC 連接位置的變化，通常被認(rèn)為是造成高等植物葉綠體基因組長度變異的主要機(jī)制［37-38］。Zheng等［39］發(fā)現(xiàn)13 種紫薇在IR/SC 交界區(qū)表現(xiàn)出相似的特征，而Xu等［40］在3 個新測序的紫薇葉綠體基因組中觀察到rpl2 內(nèi)含子缺失，紫薇rpl2 內(nèi)含子缺失的發(fā)生被認(rèn)為是千屈菜科中重要的進(jìn)化事件之一。

圖1 大花紫薇葉綠體基因組物理圖譜Fig.1 Gene map of the choloroplast genome of Lagerstroemia speciosa

圖2 絨毛紫薇葉綠體基因組物理圖譜Fig.2 Gene map of the choloroplast genome of Lagerstroemia tomentosa

表2 紫薇屬植物葉綠體基因組序列特征匯總Table 2 Summary of chloroplast genome sequence characteristics of Lagerstroemia

2.3 22 種紫薇屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

為了確定紫薇屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，根據(jù)表1 中由NCBI 下載的FASTA 序列，使用軟件PhyloSuite，采用貝葉斯法（Bayesian inference，BI）構(gòu)建22 種紫薇屬植物的系統(tǒng)發(fā)育樹，另設(shè)置5 個近源外群Duabanga grandif lora、Oenothera biennis、O.argillicola、Ludwigia octovalvis、Erodium carvifolium。由圖3 可知，L.calyculata、L.loudonii、L.sp.2、L.tomentosa、L.sp.3、L.floribunda、L.balansae、L.intermedia、L.siamica、L.speciosa、L.venusta、L.anhuiensis、L.glabra、L.caudata、L.excelsa、L.indica、L.guilinensis、L.sp.4、L.limii、L.subcostata、L.fauriei、L.villosa共22 種紫薇屬植物單獨(dú)為一支，為單系群，具有較大的支持率。

圖3 基于27 個物種的葉綠體全基因組用貝葉斯法（Bayes）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 27 species chloroplast genome sequences with Bayes’method

3 紫薇屬植物葉綠體基因組的應(yīng)用研究進(jìn)展

3.1 DNA 條形碼研究

DNA 條形碼（DNA barcode）是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA 片段。該技術(shù)是利用生物體DNA 中一個或幾個保守片段對物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新興生物技術(shù)。葉綠體上的DNA序列片段（如matK、rbcL、trnH-psbA、rpoC1、rpoB、accD、ycf5 等）在植物DNA 條形碼被廣泛應(yīng)用。Xu等［40］從6 種紫薇屬植物的葉綠體基因組中選擇12 個相對較高的變異區(qū)（trnK-rps 16、trnStrnG、trnG-trnR-atpa、trnE-trnT、rbcLaccd、psbL-psbF-psbE、trnP-psaJ-rpl33、rrn16-trni、ccsa、ndhG-ndhI、rps15-ycf1 和ycf1）作 為cp DNA 標(biāo)記，推測它們在物種和品種水平上經(jīng)歷了更快的核苷酸替換，可以作為分子標(biāo)記應(yīng)用于紫薇屬植物的系統(tǒng)發(fā)育分析和植物鑒定；Zheng等［39］從13 種紫薇屬植物中選擇識別度最高的7 個基因片段（ndhF、ycf1、trnK-rps16、psbKPSBI、trnR-ucu-atpa、rpl32-trnL 和rrn16-trni）作為DNA 條形碼，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7 個條形碼能有效鑒別13 個種。Dong等［41］比較了20 種紫薇屬植物中的4 個高變量標(biāo)記和國際DNA 通用條形碼（rbcL、matK、psbA-trnH），發(fā)現(xiàn)4 個高變量標(biāo)記的進(jìn)化速率是DNA通用條形碼的2.5倍。馬麗［43］針對國際DNA 條形碼對紫薇屬植物的鑒定進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)trnH-psbA 在13 個紫薇屬物種中變異最大，但是鑒定成功率僅為38.46%；MatK 和rbcL 變異太小不適合用作紫薇屬DNA 條形碼；而組合片段rbcL+trnH-psbA 和mat K+rbc L+trn H-psb A 鑒定能力高，可用作紫薇屬特異性條形碼；構(gòu)建NJ 樹對15 個高變片段進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)其 中5 個片段 petA-psbJ、ndh F-rpl32、ndhGndhI、trnS-trnG 和trnR-atpA 的鑒定能力最強(qiáng)，因此建議將它們作為紫薇屬的候選DNA 條形碼。前人從紫薇屬葉綠體基因組中開發(fā)的DNA 標(biāo)記能彌補(bǔ)國際通用條形碼在紫薇屬中的鑒定缺陷，對紫薇種質(zhì)資源的種間鑒定、定向育種以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供了強(qiáng)有力的分子手段。

3.2 SSR 研究

簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）是由1～6 個核苷酸組成的簡單重復(fù)的串聯(lián)序列，SSR 在基因組的不同位置不同分布，長度一般在200 bp 以下，通常有6 種核苷酸類型，即單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸，且SSR 在真核和原核生物中廣泛分布［44-45］。SSR 分子標(biāo)記具有在基因中覆蓋率高、重復(fù)次數(shù)多、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測出品種親緣關(guān)系之間的細(xì)小差異，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于品種間親緣關(guān)系及遺傳多樣性的研究［46］。

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記已成為紫薇屬植物在遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析等研究的重要手段。例如，王獻(xiàn)等［47］設(shè)計并優(yōu)化了20 個紫薇和南紫薇的AFLP 銀染色反應(yīng)系統(tǒng)，該技術(shù)還應(yīng)用于分析30 個紫薇品種和2 個近緣種的親緣關(guān)系；顧翠花［48］在王獻(xiàn)等［47］的基礎(chǔ)上針對紫薇建立AFLP 實(shí)驗反應(yīng)體系，篩選出可用于分析紫薇種質(zhì)資源的引物，并用于評價13 個紫薇群體的親緣關(guān)系；徐靜靜等［49］利用ISSR 技術(shù)，基于4個紫薇群體和48 個不同花色的紫薇品種，分析了紫薇屬品種的花色遺傳多樣性；Wang等［50］利用78 個SSR 標(biāo)記分析評價了51 個紫薇品種和5 個屋久島紫薇品種的遺傳多樣性，驗證了現(xiàn)有品種與已鑒定但未開發(fā)種質(zhì)資源的品種之間的關(guān)系。這些研究在紫薇品種鑒定、分類、遺傳多樣性評價等方面取得了一定進(jìn)展。

葉綠體基因組中的簡單重復(fù)序列在種內(nèi)水平上可能是高度可變的，因此經(jīng)常被用作群體遺傳學(xué)和進(jìn)化研究中的遺傳標(biāo)記。Gu等［36］分析了22 種千屈菜科植物的SSR 位點(diǎn)，其中包含14種紫薇屬植物，研究發(fā)現(xiàn)每個種均有211～332 個SSR，長度包含8～16 個堿基，共發(fā)現(xiàn)單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸6 種SSR，以單核苷酸的重復(fù)序列最常見，數(shù)量在123～212 個，其中，紫薇屬植物中只有L.siamica和L.intermedia 存在六核苷酸。SSR 位于31 個編碼基因和57 個基因間隔區(qū)中，結(jié)果表明葉綠體基因組變異較大的SSR 可用于近緣物種的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究［35］。Xu等［40］分析了6 種紫薇屬植物的葉綠體基因組中的SSR，發(fā)現(xiàn)SSR 的長度在10～15 個堿基之間，對6 個紫薇基因組序列的比較分析表明，共檢測到5 類SSR（單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸）重復(fù)。Zheng等［39］通過比較13 種紫薇屬植物的葉綠體基因組中SSR 的分布和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)了從單核苷酸到六核苷酸的SSR，前5 種SSR 分別存在于紫薇屬13 種植物中，六核苷酸重復(fù)序列也僅存在于Lagerstroemia siamica和L.intermedia的葉綠體基因組中，發(fā)現(xiàn)SSR 序列分布在31 個基因編碼區(qū)和57 個基因間隔區(qū)，這與Gu 在22種千屈菜科的14 種紫薇屬植物的SSR 分布研究結(jié)果一致，SSR 在葉綠體基因組中分布不均的現(xiàn)象特征，有助于SSR 分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到種下層面的系統(tǒng)發(fā)育分析。馬麗［43］研究了13 種紫薇的66 個SSR 位點(diǎn)，選擇了7 個SSR 數(shù)量最高的基因，發(fā)現(xiàn)同源 SSR 沒有顯著差異，這也從側(cè)面說明了SSR 的多態(tài)性。在紫薇屬物種中鑒定SSR 位點(diǎn)為多態(tài)性SSR，為紫薇屬SSR 標(biāo)記的開發(fā)提供參考序列。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究

系統(tǒng)發(fā)育也稱為系統(tǒng)發(fā)展，它是指某一個類群的形成和發(fā)展過程。通過建立系統(tǒng)發(fā)育樹，能更直觀地分析類群的親緣關(guān)系。Xu等［40］使用最大簡約（MP）、最大似然（ML）和貝葉斯推斷（BI）方法，基于4 個葉綠體基因組全序列、編碼區(qū)、非編碼區(qū)和12 個高變區(qū)，在高Bootstrap 支持下完全區(qū)分了所有6 個紫薇屬分類群，獲得了較大的支持率。Zheng等［39］基于32 種物種（其中包括13 種紫薇）的66 個共享蛋白質(zhì)編碼基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，揭示了紫薇屬內(nèi)物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其在桃金娘目中的系 統(tǒng)發(fā)育位置。紫薇屬植物的系統(tǒng)發(fā)育，包括更具代表性的物種和大量的分子標(biāo)記，對于了解紫薇屬植物的進(jìn)化史、新品種的選育和紫薇種質(zhì)資源的保護(hù)至關(guān)重要［50］。

4 結(jié)語與展望

紫薇屬植物具有花期長、花色艷麗且抗污能力強(qiáng)的特點(diǎn)，是我國夏季重要的園林觀賞植物。本文在分析葉綠體基因組各 結(jié)構(gòu)中，由于L.loudonii、L.sp.2 WD-2021、L.sp.3 WD-2021、L.sp.4 WD-2021 的參考文獻(xiàn)未發(fā)布，暫只對19種紫薇屬植物的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行概述，且已進(jìn)行葉綠體基因組測序的物種僅占已有物種的1/3，因此對紫薇屬植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)的概括不夠系統(tǒng)。進(jìn)一步完成未進(jìn)行葉綠體基因序列的測定，有利于紫薇屬內(nèi)親緣關(guān)系以及屬內(nèi)基因組的比較研究。

相比利用基因片段作為DNA 標(biāo)記，簡短的片段無法準(zhǔn)確評估物種在系統(tǒng)發(fā)育樹中的位置，因此亟需通過完整的葉綠體基因組序列判定物種親緣關(guān)系，利用完整的葉綠體基因組序列進(jìn)行基因組比較研究更具有說服力［51-53］。新測序的紫薇屬植物葉綠體全基因組將利于提高對紫薇屬植物葉綠體基因組的認(rèn)識，并有助于對該物種開展資源保護(hù)工作。通過比較完整的葉綠體基因組，提高對葉綠體基因組進(jìn)化、物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的理解，同時有助于提升對葉綠體基因組應(yīng)用價值的評價，為紫薇屬植物后續(xù)的種質(zhì)資源鑒定、分類和系統(tǒng)發(fā)育分析等方面的進(jìn)一步研究提供理論鋪墊。