李梓寧 ，靳雅 ，李霄 ，張晗 ，張鵬

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；2.方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種累及大中動(dòng)脈的血管壁慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受遺傳因素、環(huán)境因素、生活方式等多方面影響[1]。AS是心腦血管疾病與外周血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，常導(dǎo)致缺血性心臟病、缺血性中風(fēng)等疾病的發(fā)生。隨著西醫(yī)的不斷發(fā)展，以他汀類、抗血小板為主的藥物治療，以及以經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療為主的外科介入治療手段，在一定程度上減少了AS引發(fā)的心腦血管疾病的病死率。然而，他汀類藥物具有一定的引發(fā)肌損傷及肝腎損傷的風(fēng)險(xiǎn)，且在他汀的降膽固醇治療達(dá)標(biāo)后，患者仍存在明顯的心血管殘留風(fēng)險(xiǎn)。此外，他汀單藥不能滿足極高危患者的治療需求[2-4]。外科介入手術(shù)雖可臨時(shí)緩解冠狀動(dòng)脈管腔狹窄及堵塞，但常易在術(shù)后幾月或幾年內(nèi)出現(xiàn)“支架內(nèi)再狹窄”情況，并未從根本上解決疾病狀況，且患者術(shù)后需終身服藥，增加醫(yī)療成本與負(fù)擔(dān)[5]。因此，尋找可靠、有效、不良反應(yīng)小的天然藥物來防治AS疾病，一直以來被寄予厚望。

較之單一化學(xué)成分或單一作用靶點(diǎn)的藥物而言，中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，在AS的臨床治療方面已取得一定的效果[6]。益母草為唇形科植物益母草Leonurus japonicas Houtt.的新鮮或干燥地上部分，最早收錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。其味辛、微苦，性微寒，入心包、肝經(jīng)，具有活血化瘀、利尿消腫、清熱解毒之效[7]。中醫(yī)認(rèn)為，AS疾病多以“痰、瘀、濁、毒、虛”等為主要病理因素，其“瘀”不僅貫穿其發(fā)生、發(fā)展始終，又常與痰、濁等相互交結(jié)加速疾病進(jìn)程[8]，是臨床防治AS的關(guān)鍵之一。益母草雖為治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、產(chǎn)后惡露不盡的婦科良藥，但長(zhǎng)于活血養(yǎng)血，《本草匯言》云：“益母草，行血養(yǎng)血，性而不傷心血，養(yǎng)血而不滯血，誠為血家之圣藥也”[9]。因此，益母草目前已常用于心腦血管疾病的防治，尤其是復(fù)方的組方配伍之中，如冠心康[10]、醒腦治癱膠囊[11]等，取其活血養(yǎng)血、通利脈道之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，益母草化學(xué)成分主要有萜類、生物堿、黃酮類和苯丙素類等，其中萜類成分顯示出抗血栓、血管舒張、抗血小板聚集、抗炎等生物活性作用；生物堿類成分不僅具有抗炎、抗氧化活性，還可調(diào)節(jié)血管生成過程，并對(duì)子宮平滑肌具有雙向收縮調(diào)節(jié)作用[12]。藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，益母草能通過降低低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇和三酰甘油延緩AS的發(fā)展，還可通過減少氧化應(yīng)激和減少炎癥因子的表達(dá)，對(duì)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥起到保護(hù)作用，但缺乏對(duì)其機(jī)制的研究[13-15]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)采用現(xiàn)代化的研究方法，將醫(yī)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)結(jié)合在一起，基于“多基因、多靶點(diǎn)、多途徑”的互作網(wǎng)絡(luò)，為中藥治療各種疾病的作用靶點(diǎn)和潛在作用機(jī)制提供了預(yù)測(cè)價(jià)值[16]。為了更好地探索益母草活性成分治療AS的潛在分子機(jī)制，本研究借助超高壓液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，從化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)傳導(dǎo)通路多角度對(duì)益母草水提物干預(yù)AS的作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為進(jìn)一步揭示益母草的藥理作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

UPLC-Q-TOF-MS/MS儀UPLC Xevo G2-XS QTOF（Waters公司），ACQUITY UPLC HSS T3液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司，貨號(hào)：75002440），電熱套（北京中興偉業(yè)有限公司，批號(hào)：2D4W），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海禾汽玻璃儀器有限公司，批號(hào)：RE5005BEX），電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，序列號(hào)：3137811120），色譜級(jí)甲酸（ASC公司），乙腈（Fisher公司），超純水（屈臣氏），益母草藥材2021年購于北京同仁堂，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為唇形科植物益母草Leonurus japonicas Houtt.地上部分。

2 方法

2.1 益母草水提物的制備及處理 稱取適量益母草飲片加入蒸餾水回流提取3次，每次加入蒸餾水用量分別為10倍量、8倍量、8倍量，分別回流提取30 min、20 min、20 min，煮沸后計(jì)時(shí)，合并 3 次濾液，旋蒸，減壓濃縮凍干。

2.2 益母草水提物的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析 鑒定稱取益母草水提物藥粉適量，采用50%甲醇超聲提取20 min，提取液在轉(zhuǎn)速13 000 r/min，離心半徑8.6 cm，溫度20℃下離心15 min，取上清液進(jìn)樣。液相色譜條件流速0.4 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫。洗脫時(shí)間見表1。

表1 梯度洗脫時(shí)間Tab.1 Gradient elution time

2.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），質(zhì)譜掃描模式采用正、負(fù)離子2種掃描模式，毛細(xì)管電壓為ESI+3.0 kV/ESI-2.5 kV，錐孔電壓為40 V。離子源溫度110℃，霧化器溫度為450℃，霧化器流速為800 L/h，錐孔氣流量為50 L/h。MSE Continuum掃描模式檢測(cè)，質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1 200，碰撞氣為氬氣，碰撞電壓為 15～30 V、20～40 V、30～50 V，用亮氨酸腦啡肽LE（m/z 556.2677[M＋H]+）作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量實(shí)時(shí)校正，體積流量為0.5 μL/min，進(jìn)樣量10 μL，數(shù)據(jù)采集軟件為MassLynx 4.2，數(shù)據(jù)處理軟件為UNIFI 1.9.4。

2.4 藥物活性成分篩選及作用 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)利用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem數(shù)據(jù)庫，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）收集益母草水提物各成分化學(xué)結(jié)構(gòu)。借助SwissADME數(shù)據(jù)庫（http：//www.swissadme.ch），根據(jù)益母草水提物各成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)或SMILES字符，預(yù)測(cè)其成分的ADME參數(shù)、藥代動(dòng)力學(xué)特性、類藥物性質(zhì)等，采用胃腸道吸收（GI-absorption=high）、 類 藥 性 Druglikeness 中Lipinski、Ghose、Veber、Egan 和 Muegge 為 yes且≥3為篩選標(biāo)準(zhǔn)，確定益母草水提物的主要活性成分。利用 SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)平臺(tái)（http：//www.swisstargetprediction.ch/），預(yù)測(cè)益母草水提物主要活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。

2.5 疾病潛在作用靶點(diǎn)篩選及藥物-疾病作用 靶點(diǎn)獲取通過 GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）和 DisGeNET（https：//www.disgenet.org/search） 等數(shù)據(jù)庫挖掘與AS相關(guān)的靶基因；利用Excel對(duì)收集到的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行去重篩選，得到疾病相關(guān)的作用靶點(diǎn)。將AS相關(guān)的作用靶點(diǎn)映射至益母草水提物活性成分的潛在作用靶點(diǎn)上，借助Draw Venn Diagram在線繪圖工具繪制益母草活性成分潛在作用靶點(diǎn)與AS疾病靶點(diǎn)的Venn圖并得到交集靶點(diǎn)。

2.6 藥物防治疾病的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將AS相關(guān)的作用 靶點(diǎn)映射至益母草水提物活性成分的潛在作用靶點(diǎn)上，得到成分-疾病靶點(diǎn)文件。借助Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，構(gòu)建活性成分-交集靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.7 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建及核心靶點(diǎn)選篩 使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建益母草抗AS的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，生物體設(shè)置為“Homo”，得到PPI.tsv數(shù)據(jù)，借助Cytoscape3.7.1軟件繪制并構(gòu)建“共同作用靶點(diǎn)”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，PPI網(wǎng)絡(luò)由代表目標(biāo)蛋白質(zhì)的節(jié)點(diǎn)和代表蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的邊組成。邊緣的粗細(xì)代表組合分?jǐn)?shù)。度是指直接連接到一個(gè)節(jié)點(diǎn)的其他節(jié)點(diǎn)的數(shù)量。度數(shù)越高，節(jié)點(diǎn)越重要。同時(shí)利用Cytoscape 3.7.1軟件中 CytoNCA和 BisoGenet對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以介度中心性（BC）、對(duì)接中心性（CC）、度自由性（DC）和Degree值等為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出核心靶點(diǎn)。

2.8 GO和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析使用 DAVID在線分析軟件將交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物過程和KEGG通路富集分析，得到通路富集文件，以P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選通路，使用在線工具微生信進(jìn)行可視化，得到GO柱狀圖和KEGG氣泡圖。

2.9 分子對(duì)接分析 將益母草水提物有效成分與核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，從Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pub-chem.ncbi.nlm.nih.gov/）和 Chemspider數(shù)據(jù)庫（http：//www.8chemspider.com/）下載益母草水提物活性成分的SDF格式文件，使用Chem3D軟件轉(zhuǎn)化為Mol2格式文件。從Protein DataBank數(shù)據(jù)庫（PDB，https：//www.rcsb.org/）獲取 PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)的PBD格式文件[白細(xì)胞介素（IL）-6（PDB：1ALU）；腫瘤壞死因子（TNF，PDB：2E7A）；IL-1β（PDB：1LZH）；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 A（VEGFA）（PDB：1MKK）；CASP3（PDB：1NMS）；myc（PDB：1NKP）；表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR，PDB：1XKK）；SRC（PDB：1O41）；絲裂原活化蛋白激酶 3（MAPK3）（PDB：4QTB）；HSP90AA1（PDB：1OSF）]，導(dǎo)入 PyMol軟件去除水分子和異質(zhì)分子。用Auto Dock Tools分子對(duì)接模擬軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行添加氫原子等操作，再將化學(xué)成分和靶點(diǎn)文件均轉(zhuǎn)化為pdbqt格式的文件，運(yùn)用Grid模塊設(shè)置蛋白原配體為對(duì)接盒子中心，利用Auto Dock Vina軟件將受體（靶點(diǎn)）與配體（化學(xué)成分）進(jìn)行半柔性對(duì)接，結(jié)合能小于0 k J/mol表明受體和配體具有自發(fā)結(jié)合潛力，結(jié)合能小于等于-5.0 kJ/mol說明化學(xué)成分與靶點(diǎn)對(duì)接效果較好[17]。

3 結(jié)果與分析

3.1 藥物活性成分篩選及作用 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)益母草水提物UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定結(jié)果得到46個(gè)成分，具體信息見表2，正離子及負(fù)離子模式圖見圖1。借助SwissADME數(shù)據(jù)庫，通過ADME篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到7個(gè)活性成分，分別是益母草堿、益母草叟苷、Leoheteronin C、漢黃芩素、葫蘆巴堿、N，N，N-三甲基-色氨酸和芹菜醇。利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)平臺(tái)，預(yù)測(cè)各成分的潛在作用靶點(diǎn)。其中得到13個(gè)益母草堿預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，64個(gè)益母草叟苷潛在預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，74個(gè)Leoheteronin C潛在靶點(diǎn)，103個(gè)漢黃芩素潛在靶點(diǎn)，34個(gè)葫蘆巴堿潛在靶點(diǎn)，62個(gè)N，N，N-三甲基-色氨酸潛在靶點(diǎn)，92個(gè)芹菜醇潛在靶點(diǎn)。整合去重后共得到益母草水提物潛在作用靶點(diǎn)357個(gè)[1]。

圖1 益母草水提物活性成分正離子（A）和負(fù)離子（B）模式質(zhì)譜離子流圖Fig.1 Positive(A)and negative(B)total ion chromatograms of LHAE active ingredients

表2 益母草水提物活性成分UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定結(jié)果Tab.2 Compounds identified in LHAE active ingredients by UPLC-Q-TOF-MS/MS

3.2 疾病潛在作用靶點(diǎn)篩選及藥物成分-疾病作用靶點(diǎn)獲取 通過GeneCards、OMIM及DisGeNET數(shù)據(jù)庫分別得到AS相關(guān)的疾病基因4 717個(gè)、188個(gè)、2 044個(gè)，整合去重后共得到5 237個(gè)疾病基因。隨后與2.3得到的357個(gè)益母草成分作用靶點(diǎn)取交集，得到259個(gè)交集靶點(diǎn)并繪制Venn圖，見圖2。進(jìn)一步將交集靶點(diǎn)一一映射至成分潛在作用靶點(diǎn)上，得到藥物成分-疾病靶點(diǎn)文件。

圖2 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)VENN圖Fig.2 VENN diagram of drug targets and disease targets

3.3 藥物防治疾病的調(diào)控 利用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有7個(gè)活性成分，259個(gè)靶點(diǎn)，相互作用的邊共349條。見圖3。

圖3 益母草水提物治療AS的“相關(guān)活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network of“related active components-potential targets”of LHAE in the treatment of AS

3.4 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將得到的259個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI分析，利用Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行可視化處理，同時(shí)用軟件中CytoNCA和BisoGenet插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?BC、CC、DC、degree值等2倍中位數(shù)為篩選標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果見圖4。并進(jìn)一步篩選出核心靶點(diǎn)同時(shí)對(duì)核心靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5。

圖4 藥物-疾病靶點(diǎn)篩選策略Fig.4 Screening strategies of drug-disease targets

圖5 核心治療靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Protein-protein interaction(PPI)network of hit related targets

3.5 “信號(hào)通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 通過DAVID在線分析平臺(tái)對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析（P<0.05），得到 258個(gè) GOTERM-BP-DIRECT條目，259個(gè)GOTERM-CC-DIRECT條目，259個(gè)GOTERM-MFDIRECT條目，分別取其前10條作圖，通過微生信得到圖6。GO富集分析顯示，益母草防治AS可能涉及：對(duì)藥物的反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1、ERK2級(jí)聯(lián)正調(diào)控、炎癥反應(yīng)等。

通過DAVID在線分析平臺(tái)對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析（P<0.05），共得到240條信號(hào)通路，取相關(guān)性較高的20條作圖，利用微生信得到圖6。KEGG富集分析顯示，益母草可能通過影響磷酯酰肌醇 3激酶-蛋白激酶 B（PI3K-Akt）、TNF、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Ras）等信號(hào)通路發(fā)揮防治AS的作用。綜合3.3與3.4的結(jié)果，通過Cytoscape軟件對(duì)益母草7個(gè)核心成分，度值排名靠前的6個(gè)核心靶點(diǎn)，以及與其密切相關(guān)的15條核心信號(hào)通路進(jìn)行“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，見圖7。

圖6 生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）及KEGG通路富集結(jié)果Fig.6 Biological process(BP)，cell component(CC)，molecular function(MF)analysis of targets and KEGG pathway enrichment results

圖7 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Component-target-pathway interaction network

3.6 分子對(duì)接分析 利用Auto Dock軟件對(duì)核心藥效成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接模擬計(jì)算，見表3。對(duì)部分結(jié)果用Pymol進(jìn)行可視化分析，見圖8。對(duì)接結(jié)果顯示，益母草提取物活性成分與AS核心靶點(diǎn)的最低結(jié)合能均小于0 kJ/mol，表示預(yù)測(cè)的成分與靶點(diǎn)可以自發(fā)進(jìn)行結(jié)合，其中益母草叟苷、芹菜醇和 Leoheteronin C 與 IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA、MYC、SRC點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5 kJ/mol，說明其與靶點(diǎn)對(duì)接效果好[17]。

圖8 分子對(duì)接模式圖Fig.8 Molecular docking diagram

表3 益母草水提物與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合自由能Tab.3 Binding energies of LHAE active ingredients to core targets KJ/mol

4 討論

4.1 益母草治療AS研究基礎(chǔ) 本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)活性成分篩選，發(fā)現(xiàn)益母草干預(yù)AS的主要活性成分可能是益母草堿、益母草叟苷、漢黃芩素、Leoheteronin C、芹菜醇、葫蘆巴堿、N，N，N-三甲基-色氨酸。研究顯示，益母草堿以劑量依賴性的方式顯著減輕高膽固醇飲食誘導(dǎo)的新西蘭雄兔AS的發(fā)展，高劑量益母草堿可升高高密度脂蛋白膽固醇、降低三酰甘油，減少VSMC由收縮表型向合成表型的轉(zhuǎn)換和遷移，并改善巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)抑制血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、TNF-α、IL-6等炎癥因子的水平。此外，益母草堿還可呈劑量依賴性地降低血清和肝臟的脂質(zhì)過氧化水平[37]。Zhang等[38]從益母草中分離出的益母草叟苷A/B/C/D，在游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞中均有三酰甘油積聚的抑制作用。Ku等[39]發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可以有效減少人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中由高糖誘導(dǎo)的血管炎癥過程，減少血管通透性、單核細(xì)胞黏附、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，抑制活性氧的生成和核因子-κB（NF-κB）的激活。這些研究提示，益母草堿、益母草叟苷、漢黃芩素等可能是益母草水提物發(fā)揮抗AS藥效的主要活性成分。

4.2 靶點(diǎn)分析 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成分篩選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和網(wǎng)絡(luò)分析，可發(fā)現(xiàn)占據(jù)網(wǎng)絡(luò)中心位置的主要為IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA、c-myc等靶點(diǎn)，可能是益母草干預(yù)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。既往研究表明，在AS的發(fā)展過程中，IL-6具有影響炎癥細(xì)胞的聚集的作用，內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌趨化因子和增加細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)來影響IL-6和可溶性IL-6受體復(fù)合物的結(jié)合，共同促進(jìn)白細(xì)胞的募集和向內(nèi)膜遷移。Ha等[40]發(fā)現(xiàn)胡枝子提取物可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的小鼠動(dòng)脈內(nèi)膜單核細(xì)胞的浸潤(rùn)、ICAM的表達(dá)，以及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 和 VCAM1 的表達(dá)，從而有效預(yù)防早期AS。Zhang等[41]發(fā)現(xiàn)TNF-α可能通過增加低密度脂蛋白跨內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)并促進(jìn)NF-κB和過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ（PPAR-γ）的激活，從而促進(jìn)低密度脂蛋白在血管壁的滯留，加速AS。斑塊內(nèi)血管生成是增加斑塊糜爛、破裂風(fēng)險(xiǎn)的重要因素。血管生成由各種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，例如VEGF家族。Mao等[42]發(fā)現(xiàn)，高膽固醇血癥增加了炎性細(xì)胞因子TNF-α的釋放，然后通過增強(qiáng)VEGFA/VEGFR-2和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（FGF-2）/纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1（FGFR-1）表達(dá)促進(jìn)斑塊內(nèi)血管生成，共同促進(jìn)高膽固醇新西蘭兔AS病變的不穩(wěn)定性。血管平滑肌細(xì)胞過度遷移與病理性內(nèi)膜增厚相關(guān)，Luo等[43]發(fā)現(xiàn)川芎內(nèi)酯對(duì)病理性內(nèi)膜增厚有保護(hù)作用，表現(xiàn)為抑制VSMC在體內(nèi)和體外的遷移，并與下調(diào)c-myc蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表達(dá)有關(guān)。可見，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的益母草水提物抗AS的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要與炎癥反應(yīng)、血管新生及平滑肌細(xì)胞的增殖遷移有關(guān)，可為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供參考。

4.3 生物富集分析 通過GO功能富集分析可知，生物學(xué)進(jìn)程包括對(duì)藥物的反應(yīng)，對(duì)ERK1、ERK2級(jí)聯(lián)正調(diào)控、炎癥反應(yīng)等，主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性、類固醇結(jié)合藥物結(jié)合等方面的功能。通過KEGG富集分析預(yù)測(cè)，益母草水提物干預(yù)AS的信號(hào)通路主要是PI3K/Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路。

PI3K/Akt信號(hào)已被證明參與許多生理和病理過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥、缺血性損傷和腫瘤進(jìn)展[44]。巨噬細(xì)胞衍生的泡沫細(xì)胞是早期AS病變的主要細(xì)胞類型，PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1和M2極性改變和凋亡影響AS的各個(gè)階段，包括早期病變、斑塊進(jìn)展和斑塊穩(wěn)定性[45]。

HIF-1信號(hào)通路可通過上調(diào)NF-κB、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體、活性氧、自由基和一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、增殖、遷移和血管生成，從而促進(jìn)AS的發(fā)展。此外，HIF-1通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1表型分化和骨橋蛋白、TNF-α、iNOS、IL-6和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的炎癥和遷移。HIF-1α還通過減少膽固醇外流機(jī)制，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成[46]。Shan等[47]發(fā)現(xiàn)HIF-1α參與了缺氧誘導(dǎo)的KLF4表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞的遷移，影響血管重塑。

Ras是多種細(xì)胞外信號(hào)通路的上游。Ras調(diào)節(jié)的信號(hào)通路控制包括增殖、生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程在內(nèi)的生物過程。Yu等[48]發(fā)現(xiàn)Ras在VSMCs中的作用包括 ERK、FAK、PI3K/Akt的激活、MMPs的分泌以及其他小G蛋白的調(diào)節(jié)，阿卡波糖對(duì)A7r5細(xì)胞中Ras的表達(dá)有抑制作用，從而減少A7r5細(xì)胞的增殖、遷移。Lin等[49]發(fā)現(xiàn)哌嗪二酮衍生化合物TW-01能抑制Ras的激活，抑制MAPK及其下游c-fos、c-jun和c-myc mRNA表達(dá)，顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖以及大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生。

5 結(jié)語

本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)定性表征益母草水提物的化學(xué)成分，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接篩選并驗(yàn)證其主要活性成分的作用靶點(diǎn)，初步探討了益母草水提物治療AS的潛在作用機(jī)制。結(jié)果表明，益母草水提物可能通過調(diào)控IL-6、TNF、IL-1β、VEGFA 和 c-myc等核心靶點(diǎn)及 PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路發(fā)揮治療AS作用。本研究為進(jìn)一步闡明益母草水提物治療AS機(jī)制提供了一定的研究方向和數(shù)據(jù)支持，但存在以下不足：1）僅對(duì)益母草水提物化學(xué)成分進(jìn)行了定性分析，并未進(jìn)行定量分析。2）通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接研究得到的僅是預(yù)測(cè)性結(jié)果，益母草提取物及其活性成分防治AS的確切作用與機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。