邵繼海，陳杰鋒，胡婷

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，長沙 410128)

化學(xué)氮肥在提高農(nóng)作物產(chǎn)量方面發(fā)揮了極大的作用.然而，長期過量使用化學(xué)氮肥已導(dǎo)致一系列的農(nóng)業(yè)和環(huán)境問題，如農(nóng)田土壤酸化、水體富營養(yǎng)化和溫室氣體的釋放等[1-4].自20世紀(jì)80年代至今，我國農(nóng)田土壤酸化形勢依然嚴(yán)峻，減少化學(xué)氮肥的使用量和提高化學(xué)氮肥的利用效率是遏制農(nóng)田土壤酸化的主要措施.

固氮藍(lán)藻是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要微生物類群.研究表明，固氮藍(lán)藻每季向稻田輸入的氮素量可以達(dá)到20～60 kg/hm2[5].在水稻生長過程中，接種固氮藍(lán)藻可減少近一半的化學(xué)氮肥，且使水稻增產(chǎn)10%～30%[6].固氮藍(lán)藻在提高水稻產(chǎn)量和減少稻田化學(xué)氮肥使用量方面具有很大的應(yīng)用潛力.盡管目前關(guān)于固氮藍(lán)藻對農(nóng)田氮素輸入以及對農(nóng)作物的生長和增產(chǎn)效應(yīng)有較多的研究，但向酸化農(nóng)田接種固氮藍(lán)藻后，對水稻產(chǎn)量及農(nóng)田微生物結(jié)構(gòu)與功能的影響卻鮮有報(bào)道.本研究通過稻田小區(qū)試驗(yàn)，探討了在酸化稻田中接種固氮藍(lán)藻對水稻產(chǎn)量、土壤酶活性和土壤中細(xì)菌多樣性的影響，以期為酸化稻田中固氮藍(lán)藻的合理利用以及提高水稻產(chǎn)量與土壤肥力提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 小區(qū)試驗(yàn)位點(diǎn)概況及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

小區(qū)試驗(yàn)于2020年在湖南省瀏陽市蕉溪鎮(zhèn)水稻田(113°32′13.11″E，28°13′40.79″N)進(jìn)行.該稻田土壤pH為5.2;全氮0.55 g/kg;銨態(tài)氮0.05 mg/kg;總磷0.65 g/kg;有效磷11.63 mg/kg.試供藻種為林氏念珠藻(NostoclinckiaFACHB104)，由中國科學(xué)院水生生物研究所提供.使用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行藻種擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，光照周期光暗比設(shè)置為12L∶12D，光照強(qiáng)度為24 lx.待林氏念珠藻培養(yǎng)至對數(shù)末期，將其轉(zhuǎn)入無氮BG-11培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d，然后接種至稻田.試驗(yàn)分為對照(CK)和接種林氏念珠藻處理(NL).每個處理設(shè)置3個重復(fù)，隨機(jī)排列，共設(shè)計(jì)6個試驗(yàn)小區(qū)，每個小區(qū)的大小為4 m×5 m.NL處理組接種經(jīng)過氮饑餓的林氏念珠藻培養(yǎng)液，CK處理組接種等體積的無氮BG-11培養(yǎng)基.每次接種量約為6.6×1010cells/m2.從水稻插秧后第2 d到水稻乳熟期，每15 d接種1次.水稻品種為雜交稻天優(yōu)華占.水稻插秧前一周施加基肥，施用量為尿素166.67 kg/hm2, 氯化鉀166.67 kg/hm2, 過磷酸鈣291.29 kg/hm2.插秧1月后施加追肥，追肥用量為氯化鉀100 kg/hm2, 過磷酸鈣175.68 kg/hm2.水分管理方式為全生育期淹水.

1.2 樣品采集及測定

土壤樣品于水稻成熟期采集，在各試驗(yàn)小區(qū)采集至少5個點(diǎn)的0～20 cm耕作層土壤，混勻，挑出植物殘?bào)w后，采用4分法裝袋.一部分新鮮土樣裝于封口袋放于-80 ℃超低溫冰箱儲存，用于分析土壤微生物分子多樣性；一部分新鮮土壤裝于封口袋放于4 ℃冷藏，用于分析土壤酶活性.另一部分樣品儲存于自封袋內(nèi)并轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，碾磨過篩后測定其基本理化性質(zhì).

土壤pH采用電位法測定[7]；土壤中有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、總磷、有效磷、陽離子交換量參考文獻(xiàn)[7].土壤中脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定；酸性磷酸酶采用對硝基苯比色法測定；土壤纖維素酶采用蒽酮硫酸比色法測定.上述酶活性具體測定方法參照文獻(xiàn)[8].土壤固氮酶活性采用乙炔還原法測定[9-10].水稻成熟后，采用5點(diǎn)取樣法收割水稻穗.將谷粒樣品置于室外陽光下曬干，稱質(zhì)量，測定其產(chǎn)量.

1.3 高通量測序

選用土壤DNA提取試劑盒(天根)提取土壤樣品總DNA，使用16S rDNA通用引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3')和806R(5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3')擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V4～V5區(qū)[11].PCR熱循環(huán)方案設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入25個循環(huán)擴(kuò)增階段，每個循環(huán)包括變性95 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，最后于72 ℃保溫5 min.PCR擴(kuò)增在ABI GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems，CA，USA)上進(jìn)行.使用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，并使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進(jìn)一步純化.使用QuantiFluorTM-ST(PromegaUSA)對純化的擴(kuò)增子進(jìn)行定量，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina MiSeq平臺上進(jìn)行高通量測序.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，處理組和對照組的兩兩比較采用t檢驗(yàn)，p<0.05時(shí)表示差異顯著.采用皮爾森(pearson)相關(guān)性分析來研究土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)，以及細(xì)菌相對豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)與水稻產(chǎn)量

由表1可以看出，接種林氏念珠藻顯著提高了土壤中銨態(tài)氮的含量，與對照組相比，其銨態(tài)氮含量提高了27.0%.林氏念珠藻對土壤pH，有機(jī)質(zhì)，硝態(tài)氮，陽離子交換量影響不顯著.接種林氏念珠藻處理組土壤中速效磷平均值大于對照組，但統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示其差異未達(dá)到顯著性水平.由圖1可知，接種林氏念珠藻能顯著增加水稻的產(chǎn)量，增幅為33.7%.

表1 不同處理的土壤理化特征

2.2 土壤酶活性

由圖2可以看出，接種林氏念珠藻處理組的土壤固氮酶、酸性磷酸酶和纖維素酶的活性均顯著增強(qiáng)，與對照相比，分別增加了40.3%，50.8%和90.9%.土壤脲酶活性分析結(jié)果顯示，接種林氏念珠藻對該酶的活性沒有顯著影響.

2.3 土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

由表2可知，土壤中酸性磷酸酶與銨態(tài)氮的相關(guān)系數(shù)為0.82，呈顯著正相關(guān).纖維素酶與pH的相關(guān)系數(shù)為-0.82，呈顯著負(fù)相關(guān).纖維素酶與銨態(tài)氮的相關(guān)系數(shù)為0.96，呈極顯著正相關(guān).固氮酶活性與有機(jī)質(zhì)的相關(guān)系數(shù)為-0.83，呈顯著負(fù)相關(guān).

表2 土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的皮爾森相關(guān)性分析

2.4 土壤中細(xì)菌群落多樣性分析

高通量測序的結(jié)果顯示，該稻田土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌主要分布于變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)，這5個菌門的相對豐度占比之和高達(dá)73.19%～74.89%(圖3)，其中變形菌門占比最高，為22.89%～23.10%.其次為放線菌門和綠彎菌門，分別占比 13.53%～17.22% 和 12.42%～21.72%.從各類群相對豐度的平均值來看，接種林氏念珠藻后，放線菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對豐度均有所增加，而綠彎菌門和浮霉菌門相對豐度均有所降低.統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果顯示，在上述主要的微生物類群中，僅放線菌門的相對豐度在接種林氏念珠藻處理和對照之間存在顯著性差異.

為了揭示土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與主要環(huán)境因子的關(guān)系，將相對豐度前10位的細(xì)菌類群(門水平)與土壤中總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、總磷、效磷、有機(jī)質(zhì)含量和pH等7個環(huán)境因子做皮爾森相關(guān)性分析(表3).結(jié)果顯示，放線菌與浮霉菌的相對豐度分別與土壤中的總磷、速效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)；疣微菌和藍(lán)藻的相對豐度均與土壤中的銨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)；擬桿菌的相對豐度與土壤的氨氮呈顯著正相關(guān)，與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān).其余5個主要細(xì)菌類群與上述7個環(huán)境因子均無顯著相關(guān)性.

為了進(jìn)一步了解細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與主要環(huán)境因子的關(guān)系，在上述相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上，從目分類水平將放線菌門、疣微菌門、藍(lán)藻門、擬桿菌門中的主要類群與土壤的pH、銨態(tài)氮、總磷進(jìn)行了皮爾森相關(guān)性分析(附表2)，結(jié)果顯示疣微菌門中的Chthoniobacterales,藍(lán)藻門中的色球藻目(Synechococcales)和細(xì)鞘絲藻目(Leptolyngbyales)與pH呈顯著正相關(guān)，而擬桿菌門中的擬桿菌目(Bacteroidales)和Kryptoniales與pH呈顯著負(fù)相關(guān).色球藻目和細(xì)鞘絲藻目與土壤中銨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而放線菌門中的弗蘭克氏菌目(Frankiales),Solirubrobacterales和擬桿菌門中的擬桿菌目與銨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān).疣微菌門中的Pedosphaerales與土壤中總磷含量呈顯著正相關(guān).

表4顯示了不同處理?xiàng)l件下稻田土壤中細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)的變化情.各處理組高通量測序覆蓋率均大于95%，說明測序結(jié)果比較可靠，能夠有效反映樣本中細(xì)菌群落的多樣性.除Coverage指標(biāo)外，接種林氏念珠藻處理的α多樣性指數(shù)值均略高于對照組.然而，統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果顯示，這兩組處理的各多樣性指數(shù)均不存在顯著差異.

3 討 論

固氮藍(lán)藻可以通過生物固氮和光合作用向農(nóng)田輸入銨態(tài)氮和有機(jī)碳，提高土壤肥力，促進(jìn)農(nóng)作物生長[10-11].此外，有研究表明，一些固氮藍(lán)藻還能合成植物促長激素，促進(jìn)作物生長和提高作物產(chǎn)量[12].本研究結(jié)果顯示，在酸化稻田接種固氮藍(lán)藻可以有效地提高水稻產(chǎn)量.研究結(jié)果顯示，接種林氏念珠藻可以顯著提高土壤中固氮酶的活性和銨態(tài)氮的含量，基于這些結(jié)果推測氮素輸入是該固氮藍(lán)藻提高水稻產(chǎn)量的作用方式之一.磷酸酶能活化土壤中的非生物有效態(tài)磷元素，使其變?yōu)樽魑锟梢晕盏挠行B(tài)磷，進(jìn)而促進(jìn)作物生長[13].接種林氏念珠藻后，土壤中酸性磷酸酶活性顯著升高，但是土壤中有效磷的含量與對照相比無顯著差異，其原因可能是稻田中的微生物和水稻吸收了更多的有效磷.據(jù)此推測，提高磷元素的可獲取性也可能是接種林氏念珠藻提高水稻產(chǎn)量的另一原因.文獻(xiàn)[14]研究了稻田新紀(jì)錄固氮藍(lán)藻類珠藻對水稻生長、產(chǎn)量及稻田土壤理化特性的影響，在大田試驗(yàn)條件下，接種類珠藻可以使水稻增產(chǎn)25.1%，但是對土壤理化特性無顯著影響；本研究結(jié)果顯示，接種林氏念珠藻使水稻增產(chǎn)33.7%，土壤中的銨態(tài)氮含量顯著高于對照處理.本研究所用的土壤為酸性土壤，土壤酸化能抑制作物對氮素養(yǎng)分和無機(jī)陽離子的吸收，降低作物產(chǎn)量[15]，這些因素導(dǎo)致本田間試驗(yàn)水稻產(chǎn)量較低.

表3 土壤中主要細(xì)菌類群相對豐度與土壤理化性質(zhì)的皮爾森相關(guān)性分析

表4 接種林氏念珠藻對土壤中細(xì)菌α多樣性指數(shù)的影響

土壤酶的活性受土壤理化性質(zhì)的影響.有研究表明，微生物磷酸酶活性與環(huán)境中氮素營養(yǎng)水平直接相關(guān)[16].根據(jù)本文皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果，土壤中銨態(tài)氮含量與酸性磷酸酶呈顯著正相關(guān).接種林氏念珠藻后，土壤固氮酶活性升高，銨態(tài)氮含量增加.氮素營養(yǎng)水平的升高刺激土壤微生物磷酸酶的活性.纖維素酶活性是評價(jià)土壤肥力的重要指標(biāo)[17]，纖維素分解菌與固氮微生物之間存在較為普遍的碳氮互惠關(guān)系[18]，接種林氏念珠藻增強(qiáng)了土壤中纖維素酶的活性，再次從酶活性的角度證明固氮藍(lán)藻與纖維素分解菌之間存在互惠的關(guān)系，該結(jié)果也從纖維素酶活性的角度表明接種林氏念珠藻能夠提高土壤肥力.盡管有文獻(xiàn)報(bào)道固氮藍(lán)藻可以通過光合作用向農(nóng)田輸入有機(jī)碳[11]，然而本試驗(yàn)結(jié)束后，接種林氏念珠藻處理組土壤中有機(jī)質(zhì)含量與對照相比無顯著差異.其原因可能是接種固氮藍(lán)藻后微生物分解代謝有機(jī)質(zhì)的活性增強(qiáng)，有機(jī)物分解速度增加，抵消了固氮藍(lán)藻光合作用向土壤輸入的有機(jī)質(zhì).而土壤有機(jī)質(zhì)與固氮酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)也間接證明了這一點(diǎn).

土壤中變形菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、放線菌門和綠彎菌門的豐度往往較高[19]，本研究結(jié)果顯示，這5個細(xì)菌類群的相對豐度之和超過總細(xì)菌類群的70%.這也進(jìn)一步肯定了這些微生物是稻田土壤的主要細(xì)菌類群.如圖3所示，接種林氏念珠藻后，土壤中放線菌門的相對豐度顯著高于對照.放線菌是農(nóng)田土壤中的重要微生物類群，這類微生物具有強(qiáng)大的有機(jī)物分解能力，一些種類還具有生防和固氮的活性[20-21].屬分類水平的分析結(jié)果顯示，接種林氏念珠藻處理組土壤中諾卡氏菌屬(Nocardioides)、酸熱菌屬(Acidothermus)及一個未鑒定到屬的蓋勒氏菌目(Gaiellales)放線菌的相對豐度顯著高于對照.諾卡氏菌和酸熱菌對纖維素、木質(zhì)素及多種有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的降解能力[22-23].該類微生物豐度的增加可以提高稻田土壤有機(jī)碳的周轉(zhuǎn)，這也可能是接種林氏念珠藻處理組土壤中纖維素分解酶活性高于對照的原因.

土壤中微生物的群落組成與環(huán)境因子息息相關(guān).土壤中氮、磷、有機(jī)質(zhì)含量及土壤pH對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著的影響[24].皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果顯示，藍(lán)藻門的相對豐度均與土壤中的銨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)，而擬桿菌門和放線菌門中的一些種類的相對豐度與土壤中銨態(tài)氮呈顯著正相關(guān).盡管接種的林氏念珠藻在分類系統(tǒng)中屬于念珠藻科(Nostocaceae)，本研究在科分類水平的群落組成分析結(jié)果顯示，念珠藻科的類群在藍(lán)藻門中所占的相對比例比較低，占比均不到10%，其中的優(yōu)勢類群為色球藻科(Synechococcaceae)、微囊藻科(Microcystaceae)和細(xì)鞘絲藻亞科(Leptolyngbyaceae).本研究中生物多樣性樣品的采集時(shí)間為水稻成熟期，距離最近的一次林氏念珠藻接種時(shí)間已有一個多月，林氏念珠藻種群在稻田中的衰退可能是導(dǎo)致念珠藻科藍(lán)藻相對豐度較低的原因.藍(lán)藻分布與環(huán)境因子的關(guān)系復(fù)雜，不同生境存在著不同模式.以色球藻科藍(lán)藻為例，SILAMBARASAN等[25]研究結(jié)果顯示，海洋中色球藻科藍(lán)藻的豐度與水體營養(yǎng)鹽，如銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、磷酸鹽等的含量呈負(fù)相關(guān)，而FRADE等[26]研究結(jié)果則顯示大堡礁周圍海水中的色球藻科藍(lán)藻的豐度與水體營養(yǎng)鹽呈正相關(guān).本研究結(jié)果則顯示稻田色球藻科藍(lán)藻與土壤中銨態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān).也正是因?yàn)樯蛟迥亢图?xì)鞘絲藻目這些優(yōu)勢藍(lán)藻類群的相對豐度與土壤中銨態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān)，從而出現(xiàn)藍(lán)藻門的相對豐度與土壤中銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)的現(xiàn)象.本研究接種林氏念珠藻后，土壤中綠彎菌門和浮霉菌門相對豐度均有所降低，但相關(guān)性分析結(jié)果顯示，這兩類微生物的相對豐度變化與本研究測定的7個環(huán)境因子均無顯著相關(guān)性.土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替除了與環(huán)境因子相關(guān)外，還與微生物之間的相互作用相關(guān)[27].對本研究中主要細(xì)菌類群相對豐度之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明綠彎菌與酸桿菌、浮霉菌、疣微菌呈顯著正相關(guān)，與擬桿菌呈顯著負(fù)相關(guān).浮霉菌與疣微菌呈顯著正相關(guān).目前國內(nèi)外關(guān)于微生物之間的相互作用與群落演替關(guān)系的認(rèn)識還非常有限，關(guān)于稻田接種林氏念珠藻引起微生物群落結(jié)構(gòu)改變的驅(qū)動因子還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié) 論

向酸化稻田接種林氏念珠藻能顯著增加土壤中銨態(tài)氮的含量并提高水稻產(chǎn)量.林氏念珠藻能提高土壤中放線菌的相對豐度，并增強(qiáng)土壤中固氮酶、磷酸酶和纖維素酶的活性.