方明月，汪溢磐，趙 奕，熱孜亞·艾力，申玉華，張鐵軍*

(1.北京林業(yè)大學草業(yè)與草原學院，北京 100083；2.赤峰學院化學與生命科學學院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種優(yōu)良的多年生豆科(Leguminosae)牧草，具有產(chǎn)草量高、適應性好、利用年限長、再生性強、營養(yǎng)豐富等特點[1]，有“牧草之王”的美稱。紫花苜蓿在我國的栽培歷史悠久，近年來，在政策扶持和市場需求拉動下，苜蓿種植面積迅速增加，現(xiàn)已成為了植物性蛋白飼料行業(yè)的主力軍，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[2]。

紫花苜蓿主要種植于我國的西北、東北、華北和江淮流域等地區(qū)，截止到2020年底，全國紫花苜蓿年末保留面積3 310.01萬hm2，種植面積前5位省區(qū)為甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、陜西和新疆(含新疆兵團)，占總面積的89.8%[3]。但我國北方特別是西北地區(qū)降雨稀少、水資源匱乏，加之冬季寒冷，低溫干旱的環(huán)境條件常常使紫花苜蓿出現(xiàn)減產(chǎn)、無法越冬等問題，造成經(jīng)濟損失的同時也影響了苜蓿草地的可持續(xù)利用[4-5]。因此，為滿足國內(nèi)苜蓿種植對苜蓿良種的需求，我國近幾年大量從國外進口苜蓿種子。這些引進品種雖然暫時緩解了苜蓿種子短缺的困局，但我國氣候條件與許多苜蓿品種來源地區(qū)有較大不同，盲目引種及系統(tǒng)性研究評價的缺乏給農(nóng)民和相關企業(yè)造成諸多損失。

目前，國內(nèi)外大多數(shù)研究集中于干旱、低溫單因素脅迫對紫花苜蓿生長和發(fā)育的影響，楊姝等[6]從27個苜蓿種植資源中選取了4個強抗旱種質材料，認為選育抗旱苜蓿品種的有效途徑是充分發(fā)掘地方苜蓿種質資源；Ni等[7]研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿表皮蠟質由伯醇、烷類、萜類等構成，并可通過改變?nèi)~表皮蠟質的含量、成分或結構來提高抗旱性；Castonguay等[8]研究認為，提高苜蓿耐寒性尤其是改良高秋眠級品種耐寒性是提高苜蓿產(chǎn)量的有效方式。秋眠與耐寒性密切相關，充分認識低溫馴化過程中苜蓿生長與耐寒性調(diào)控的分子機理，以分子育種方法改良苜蓿耐寒性是可行的[9]。然而，低溫干旱復合脅迫對牧草生長的研究相對較少。梁小紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)多年生黑麥草對低溫干旱復合脅迫具有交叉適應的能力，進行適度的干旱處理能提高其在低溫環(huán)境下的適應性和越冬成活率。劉杰等[11]以不同基因型的兩個小黑麥品種為試驗材料，發(fā)現(xiàn)低溫、干旱和復合脅迫對小黑麥草幼苗生理特性有著不同程度的影響，且復合脅迫可能對植物會出現(xiàn)協(xié)同效應或拮抗效應，不能視作是簡單的疊加效應。徐洪雨等[12]通過控溫和更換表土試驗模擬低溫干旱環(huán)境，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿根頸內(nèi)的脯氨酸和可溶性蛋白含量可能與其耐寒性有關，同時可溶性糖含量低是苜蓿根頸失水速率快乃至耐寒性受到嚴重影響的原因。

因此，關于低溫干旱復合脅迫對紫花苜蓿影響的研究相對較少。本研究將以代表性的國內(nèi)苜蓿品種和引進苜蓿品種為試驗材料，通過對低溫干旱復合脅迫下紫花苜蓿表型及生理指標的測定，系統(tǒng)分析比較8個紫花苜蓿品種在低溫干旱環(huán)境下的抗逆性，以期為我國北方地區(qū)的紫花苜蓿品種選擇和新品種培育提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料來源與處理

引進國內(nèi)外代表性抗寒紫花苜蓿品種共8個，以東北地區(qū)的重要品種‘公農(nóng)1號’(Medicagosativa‘Gongnong No.1’)為對照。品種名稱和來源見表1。

表1 供試品種名稱及來源

1.2 試驗方法

從每份紫花苜蓿品種材料中挑選180粒均勻一致、顆粒飽滿、無病蟲害的種子，先用HgCl2溶液消毒8分鐘，再用蒸餾水沖洗5次后置于內(nèi)鋪濾紙的培養(yǎng)皿中。于人工氣候箱中培養(yǎng)發(fā)芽，培養(yǎng)條件為晝/夜溫度為25℃/20℃，濕度為70%，光照/黑暗時間為12 h/12 h，光照強度為5 000 lx。

每份苜蓿品種材料均設置對照組和脅迫處理組，每組設置3次重復，即每份材料種植6盆，共48盆。待幼根長至1～2 cm時，選擇長勢較好的幼苗移栽至花盆中，每個花盆移植17株。移植前，試驗所用的塑料花盆及蛭石均進行高溫滅菌處理，并在每個盆內(nèi)裝入等量均勻的蛭石約45 g。移植后花盆內(nèi)土壤含水量保持在田間持水量的75%～80%，每周加入2～3次速效肥(品牌為Peters professional，成分為20∶20∶20氮磷鉀肥)，每次每盆0.1 g。待生長到4～5片復葉時，進行脅迫處理。

目前研究干旱脅迫對植物影響試驗最常用的干旱處理方法是反復干旱法[13,14]，本試驗采用兩次干旱低溫復合脅迫處理來進行抗逆性鑒定。脅迫處理期間，對照組始終置于人工培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件同發(fā)芽期，土壤含水量保持在田間持水量的70%～80%。處理組第一次停止供水直至土壤含水量降至田間持水量的15%～20%，持續(xù)脅迫8 d。隨后轉入4℃低溫培養(yǎng)箱進行低溫干旱復合脅迫，持續(xù)5 d，培養(yǎng)條件為晝夜溫度為4℃，空氣濕度為70%，光照/黑暗時間為12 h/12 h，光照強度為5 000 lx。然后，將其轉入人工培養(yǎng)箱并復水，使其土壤水分達到田間持水量的75%～80%。復水后第二次停止供水，方法同第一次。干旱脅迫持續(xù)8 d后再次轉入4℃低溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件同上，低溫干旱復合脅迫5 d后進行指標測定。

1.3 測定指標和方法

1.3.1表型指標的測定 試驗結束后對所有處理進行取樣，每盆隨機選取3株幼苗，測量植株高度、葉長及葉寬。每盆選擇3株與花盆中大部分幼苗長勢相同的苜蓿幼苗，剪下稱量其地上部鮮重，并于紙袋中自然風干后測量其地上部干重。計算各表型指標處理組相比對照組的降幅及相對鮮重、相對干重、相對鮮干比等3項指標，計算公式如下：

相對鮮干比=處理組鮮干比/對照組鮮干比×100%

1.3.2生理特征的測定 取樣前，用手持葉綠素儀(中科維禾TYS-4 N)測量每個花盆中3株長勢均勻植株的中部葉片的葉綠素含量及氮含量。過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性采用過氧化物酶試劑盒(貨號MM-35960O1，江蘇酶免實業(yè)有限公司)測定，過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性采用過氧化氫酶試劑盒(貨號MM-0799O1，江蘇酶免實業(yè)有限公司)測定。

1.3.3低溫干旱復合脅迫條件下的抗逆性綜合評價 采用隸屬函數(shù)模糊綜合評價法，對各品種紫花苜蓿在低溫干旱復合脅迫條件下的抗逆性，進行綜合評價。計算隸屬函數(shù)值Xi和隸屬函數(shù)總和(D)公式如下[5,15]:

式(1)

式(2)

式中i為指標，j為品種；Xi為處理組與對照組指標測定值的比值，Xmin、Xmax為此指標比值的最小值和最大值。綜合評價D值越大表示該紫花苜蓿品種在低溫干旱復合脅迫條件下抗逆性越強。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS25、DPS進行統(tǒng)計分析，使用Simpalot12.5作圖。

2 結果與分析

2.1 低溫干旱復合脅迫下不同品種紫花苜蓿幼苗表型特征的差異

紫花苜蓿的表型和生理均受到低溫干旱復合脅迫的顯著影響(P<0.05)，除了POD和CAT活性兩項指標外，不同苜蓿品種的表型和生理指標存在顯著差異(P<0.05)，品種與低溫干旱復合處理的交互作用對苜蓿各項指標影響并不顯著(表2)。

表2 低溫干旱脅迫和品種及其交互作用對苜蓿生長影響的方差分析(F值)

8個紫花苜蓿品種在低溫干旱復合脅迫和正常條件下，表型指標也有一定的差異(表3)。不同紫花苜蓿品種的株高在低溫干旱復合脅迫條件下降幅差異較大，其中‘公農(nóng)1號’的降幅最小，株高由平均20.39 cm下降為20.28 cm，降幅為0.54%(表3)?！绷?01’的降幅最大，株高由平均24.75 cm下降為17.26 cm，降幅達到30.28%。同時，低溫干旱復合脅迫對‘北極熊’及‘北林201’的株高存在顯著影響(P<0.05)，對‘WL298’的株高存在極顯著影響(P<0.01)，對其他品種的株高影響不顯著。

表3 不同紫花苜蓿品種在低溫干旱復合脅迫和正常條件下的表型指標

紫花苜蓿的葉長降幅范圍在0.47%～17.14%，其中‘東苜2號’‘龍牧803’的降幅均小于1%，‘龍牧803’的降幅最小，‘可汗’的降幅最大。葉寬的降幅范圍與葉長相近，其中‘東苜2號’的降幅最小，僅為1.47%，‘WL168’的降幅最大，達到14.76%。低溫干旱復合脅迫對‘北極熊’的葉長與葉寬均有顯著影響(P<0.05)，同時對‘WL298’的葉長也有顯著影響(P<0.05)。

8個紫花苜蓿品種的鮮重及干重降幅均較大，鮮重降幅平均為56.76%，干重降幅平均為52.72%。其中鮮重降幅最小的是‘東苜2號’，最大的是‘WL298’，干重降幅最小的是‘公農(nóng)1號’，最大的是‘北林201’。同時，低溫干旱復合脅迫對‘可汗’‘WL168’‘龍牧803’的鮮重均存在顯著影響(P<0.05)，對‘北極熊’‘北林201’‘WL298’的鮮重存在極顯著影響(P<0.01)?！睒O熊’的干重也受到低溫干旱復合脅迫的顯著影響(P<0.05)，‘WL298’‘WL168’的干重受其極顯著影響(P<0.01)。

2.2 低溫干旱復合脅迫下不同品種紫花苜蓿幼苗相對鮮重、干重和鮮干比的差異

2.2.1低溫干旱復合脅迫下不同品種紫花苜蓿幼苗相對鮮重的差異 表4可知，8個紫花苜蓿品種在低溫干旱復合脅迫條件下有個品種的相對鮮重無顯著差異，按相對鮮重大小依次為‘東苜2號’‘公農(nóng)1號’‘WL168’‘龍牧803’‘北林201’‘可汗’‘東苜2號’與‘北極熊’‘WL298’間存在顯著差異(P<0.05)。其中，‘東苜2號’的相對鮮重最大，為53.35%；‘WL298’的相對鮮重最小，為37.06%，表明該品種在低溫干旱復合脅迫下，鮮重下降幅度最大。

2.2.2低溫干旱復合脅迫下不同品種紫花苜蓿幼苗相對干重的差異 8個紫花苜蓿品種中僅部分品種的相對干重在低溫干旱復合脅迫條件下表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05，表4)，所有品種按相對干重大小依次為‘公農(nóng)1號’‘東苜2號’‘可汗’‘WL168’‘北極熊’‘龍牧803’‘WL298’‘北林201’。其中，‘公農(nóng)1號’的相對干重最大，為58.90%；‘北林201’的相對干重最小，為39.00%，表明該品種在低溫干旱復合脅迫下，干重下降幅度最大。

2.2.3低溫干旱復合脅迫下不同品種紫花苜蓿幼苗相對鮮干比的差異 表4可知，8個紫花苜蓿品種在低溫干旱復合脅迫條件下相對鮮干比無顯著差異(表4)，且按鮮干比大小排名為‘北林201’>‘東苜2號’>‘龍牧803’>‘ WL168’> ‘WL298’>‘北極熊’>‘可汗’>‘公農(nóng)1號’。8個紫花苜蓿品種中，‘北林201’的相對鮮干比最大，為96.49%；‘公農(nóng)1號’的相對鮮干比最小，為80.39%，表明該品種在低溫干旱復合脅迫下，相對鮮干比下降幅度最大。

表4 低溫干旱復合脅迫下不同紫花苜蓿品種相對鮮重、干重和鮮干比分析

因此，在低溫干旱復合脅迫條件下，與對照組相比，紫花苜蓿的干、鮮重及鮮干比均有較大下降幅度，但大部分品種間無顯著差異。

2.3 低溫干旱復合脅迫下不同品種紫花苜蓿幼苗生理特征的差異

紫花苜蓿的葉綠素受到品種和低溫干旱復合脅迫的顯著影響(P<0.05，表2)，但兩者的交互作用對其影響并不顯著。其中，低溫干旱復合脅迫對其葉綠素含量影響最小的是‘北極熊’與‘WL168’，與對照組相比葉綠素含量僅下降了0.63%，0.85%。影響最大的是‘北林201’與‘可汗’，與對照組相比葉綠素含量下降了25.98%，20.61%(圖1A)。

紫花苜蓿的氮含量受到品種和低溫干旱復合脅迫的顯著影響(P<0.05，表2)，低溫干旱復合脅迫對其影響最小的是‘北極熊’與‘WL168’，與對照組相比,氮含量僅下降0.12%，0.16%。影響最大的是‘北林201’與‘可汗’，與對照組相比,下降了21.85%，17.15%(圖1B)。

紫花苜蓿的POD僅受到低溫干旱復合脅迫的顯著影響(P<0.05，表3)，品種及兩者的交互作用對其影響并不顯著。其中，受低溫干旱復合脅迫影響最小的是‘北極熊’與‘北林201’，與對照組相比其POD值僅下降7.95%，27.47%。影響最大的是‘龍牧803’與‘公農(nóng)1號’，下降了54.66%，48.45%(圖1C)。

紫花苜蓿的CAT僅受到低溫干旱復合脅迫的顯著影響(P<0.05，表2)。其中低溫干旱復合脅迫對其CAT值影響最小的是‘可汗’與‘北極熊’，分別僅下降0.95%，3.53%。影響最大的是‘WL168’與‘北林201’，其CAT值下降了48.82%，48.03%(圖1D)。

圖1 干旱脅迫對不同品種苜蓿幼苗生理特征的影響

2.4 低溫干旱復合脅迫條件下紫花苜?？鼓嫘栽u價

根據(jù)隸屬函數(shù)D值，對8個品種紫花苜蓿在低溫干旱復合脅迫條件下的抗逆性進行綜合排序(表5)。在低溫干旱復合脅迫條件下，紫花苜?？鼓嫘詮娙醯呐琶麨椤畺|苜2號’>‘北極熊’>‘公農(nóng)1號’>‘龍牧803’>‘WL168’>‘ WL298’>‘可汗’>‘北林201’。其中，表型指標綜合評價指數(shù)最高的是‘東苜2號’，生理指標綜合評價指數(shù)最高的是‘北極熊’。

表5 紫花苜蓿品種的綜合評價指數(shù)

2.5 隸屬函數(shù)與其他指標的相關性分析

利用雙變量Pearson相關系數(shù)法對紫花苜蓿隸屬函數(shù)D值與試驗所測抗逆性評價指標進行相關性分析。結果表明，隸屬函數(shù)D值與株高、葉綠素含量、氮含量均呈顯著相關關系，干重與株高、葉長與葉寬呈顯著相關關系，葉綠素與氮含量呈極顯著相關關系(表6)。

表6 低溫干旱復合脅迫下紫花苜蓿各指標的相關系數(shù)

3 討論

3.1 低溫干旱復合脅迫對紫花苜蓿幼苗形態(tài)特征的影響

形態(tài)學指標是植物抗逆性鑒定中應用較多的指標，株高、葉長、葉寬等形態(tài)指標能較直觀、快速地反映植株生長狀況和對逆境脅迫的敏感程度[16-17]。薛琪等[18]研究發(fā)現(xiàn)水分脅迫會引起植株個體對水分的競爭，最終影響地上部分莖、葉的生長，干旱條件下苜蓿品種的株高增幅與對照組相比均有下降。王曉龍等[19]研究表明，株高較低的苜蓿品種秋眠級低，耐寒性較強。本試驗對不同紫花苜蓿品種采取低溫干旱復合脅迫處理，發(fā)現(xiàn)，處理后各苜蓿品種的株高與對照組相比均有所下降，但不同品種間的降幅差異較大。綜合評價后抗逆性較好的‘東苜2號’和‘公農(nóng)1號’降幅均在3%內(nèi)，但抗逆性較好的‘北極熊’降幅卻達到了近20%。因此，株高是否可以作為苜蓿在低溫干旱復合脅迫條件下的鑒定指標，還有待進一步研究確定。

鮮重、干重作為體現(xiàn)植株生物量的主要指標，能反應植物的物質能量積累[20]。而鮮干比則可用來衡量苜蓿品質，體現(xiàn)牧草的干物質積累程度及其利用價值，苜蓿的鮮干比越高，則其品質越好[21]。在低溫、干旱這兩種不利環(huán)境下，紫花苜蓿的鮮、干重均反應敏感，呈下降趨勢[22-23]，這與本試驗的結論較為一致。薛琪等[18]通過對不同紫花苜蓿品種在低溫、干旱這兩種不利環(huán)境下鮮干比的變化研究，發(fā)現(xiàn)植物可以通過降低鮮干比來儲存體內(nèi)營養(yǎng)物質,以度過逆境時期，且鮮干比下降幅度越大，抗寒性和抗旱性越弱,其中‘WL168’在干旱及低溫環(huán)境中鮮干比所受影響均較小，其抗寒性和抗旱性均較強。但在本試驗8個品種低溫干旱復合脅迫的條件下，‘WL168’品種的抗逆性綜合評價排名卻并不高，僅為第5。同時，在本試驗中鮮干比降幅最小的品種為抗逆性較差的‘北林201’。由此看見，單一脅迫條件(低溫、干旱)下抗逆性強的品種在復合脅迫條件下不一定抗逆能力好，且在多重逆境下植物的鮮干比與抗逆性間的關系更為復雜，不呈現(xiàn)出單一的正相關關系。

3.2 低溫干旱復合脅迫對紫花苜蓿幼苗生理特征的影響

光合作用是植物維持生長及進行物質代謝的最基本活動，而葉綠素是植物進行光合作用時所需的核心物質[24]，通過分析不同紫花苜蓿品種的葉綠素含量與其在低溫干旱復合脅迫條件下的抗逆性的關系，可用于指導鑒定耐低溫干旱型的苜蓿品種。近年來，葉綠素含量作為反應植物抗逆性的有效指標[25-26]，在紫花苜蓿的抗旱性及抗寒性相關研究中得到廣泛應用[24,27-28]。本試驗結果顯示，紫花苜蓿在低溫干旱復合脅迫條件下抗逆性綜合評價與葉綠素含量顯著相關，抗逆性強的品種葉綠素在逆境脅迫中下降幅度更小，這與余玲等[29]在紫花苜蓿的抗旱性研究中得出的結果一致，抗旱性強的品種能表現(xiàn)出較強的維持葉綠素含量的能力。同時，在本試驗中紫花苜蓿的抗逆性綜合評價與氮含量呈顯著相關關系，這可能說明氮含量會影響紫花苜蓿在低溫干旱環(huán)境中的抗逆能力。但這在之前的試驗研究中尚未報道，氮含量能否作為紫花苜蓿在低溫干旱復合脅迫條件下的鑒定指標，還有待進一步研究確定。

植物體內(nèi)的過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)可以協(xié)同作用消除過氧化氫清除自由基以此來防止膜脂過氧化[30-31]，對植物細胞起到保護作用，同時提升植物抵抗逆境的能力[32]。研究表明，紫花苜蓿在低溫或干旱逆境條件下，體內(nèi)的POD和CAT含量會隨著脅迫加劇呈先上升后下降的趨勢，這是由于在逆境脅迫下，植物會形成POD和CAT等抗氧化酶來降低傷害[32-33]。本試驗并未對紫花苜蓿在復合脅迫條件下POD、CAT含量的動態(tài)變化進行測定，僅測定了低溫干旱復合脅迫后的最終含量。試驗結果表明，脅迫處理后的各紫花苜蓿品種相比對照組體內(nèi)POD、CAT含量均有所降低，與之前的研究結論較為一致。

3.3 紫花苜蓿低溫干旱環(huán)境中抗逆性的綜合評價

植物在低溫干旱環(huán)境下的抗逆性是受多種因素共同影響的，不能根據(jù)單一指標來對其進行抗逆評價[34]。本試驗選取了9個抗逆性指標通過隸屬函數(shù)值法對8個紫花苜蓿品種進行綜合客觀的評價排序，結果表明‘東苜2號’‘公農(nóng)1號’在低溫干旱環(huán)境下的抗逆性較強。

4 結論

在低溫干旱環(huán)境下，各紫花苜蓿品種的形態(tài)及生理指標均呈下降趨勢。同時，基于雙變量Pearson相關系數(shù)法，發(fā)現(xiàn)隸屬函數(shù)與株高、葉綠素含量和氮含量均呈顯著相關關系，表明紫花苜蓿在低溫干旱復合脅迫下的抗逆性與這三個指標顯著相關。對9個指標的隸屬函數(shù)值綜合指數(shù)發(fā)現(xiàn)，在低溫干旱環(huán)境下的抗逆性表現(xiàn)為‘東苜2號’>‘北極熊’>‘公農(nóng)1號’>‘龍牧803’>‘WL168’>‘ WL298’>‘可汗’>‘北林201’。這對我國北方地區(qū)紫花苜蓿栽培品種的選擇具有重要參考價值。