文│吳宣（四川省動物疫病預防控制中心）

兔病毒性出血癥又稱兔瘟，是由兔出血癥病毒（RHDV）引起的兔的一種急性高度接觸性傳染病，以呼吸系統(tǒng)出血、實質(zhì)性器官出血水腫變化為特征，該病傳播快、發(fā)病急、潛伏期短，感染后2～3天迅速死亡，死亡率極高（90%～100%）。當前國內(nèi)預防兔病毒性出血癥常用的滅活疫苗有：兔瘟單苗、兔-巴二聯(lián)苗、兔-巴-魏（波）三聯(lián)苗。隨著分子生物學的發(fā)展，基因工程苗的研究也有了很大的進展。

一、組織滅活疫苗

組織滅活疫苗制備原理是兔病毒性出血癥病毒加入0.5%甲醛溶液制成的懸液在37℃下失去致病性而保持其免疫原性。制備過程是將兔瘟病毒接種健康兔，收取24～72小時死亡兔的含毒組織（肝、脾、腎），用緩沖液搗碎過濾后，經(jīng)0.5%甲醛溶液37℃滅活24小時而制成。用該苗接種后，兔6～10天產(chǎn)生抗兔病毒性出血癥病毒的抗體，12～16天抗體效價達到峰值，隨后開始下降。在疫苗生產(chǎn)中，免疫佐劑起著重要的作用，加了佐劑的組織滅活苗克服了抗體峰值和抗體持續(xù)時間短的問題。隨著動物免疫佐劑的研究，出現(xiàn)了多種免疫佐劑，比如黃芪多糖、鋁膠、蜂膠、弗氏佐劑等，加入佐劑的滅活疫苗可以提高兔病毒性出血癥病毒抗原的免疫原性，刺激機體迅速產(chǎn)生抗體，并促使免疫系統(tǒng)內(nèi)相關(guān)免疫細胞的活化，使抗體效價維持天數(shù)增長。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖作為中藥，具有消炎、殺菌、增強免疫力的作用，加入黃芪多糖佐劑的疫苗，抗體效價維持最長。

組織滅活疫苗在生產(chǎn)上一直具有良好的免疫效果，在規(guī)模場中被廣泛使用。一般在30～35日齡首免，60～65日齡二免，后備兔及母兔每隔3～5個月加強免疫，春秋發(fā)病高峰還要補充免疫。規(guī)模場對兔群不斷地加強免疫增加了養(yǎng)殖成本，加上易感兔和非免疫兔的日益減少，疫苗生產(chǎn)成本和養(yǎng)殖戶的養(yǎng)殖成本不斷增加。加上生產(chǎn)不穩(wěn)定，制作工藝煩瑣，生產(chǎn)過程中散毒風險的存在，兔群機體還有一定的組織過敏反應。這些因素都導致滅活苗的發(fā)展受到限制，目前學者們主要著眼于RHDV疫苗基因工程疫苗的研究。

二、瘟巴二聯(lián)苗

將兔瘟強毒株接種健康兔，采取含毒組織（肝、脾、腎），搗碎過濾滅活后，制成滅活液。將標準兔多殺性巴氏桿菌菌株純化后在馬丁肉湯中含氧培養(yǎng)，純檢后備用。然后按照比例加上氫氧化鋁膠、蜂膠等佐劑配制成二聯(lián)苗。制備過程中優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提純病毒、提高抗原含量，兩種抗原之間無互相干擾，產(chǎn)生的兩種抗體滴度均達到最高。該疫苗產(chǎn)生抗體快，5～7天產(chǎn)生堅強的免疫效果；免疫期長，免疫期達6個月；兔瘟保護率95%，巴氏桿菌病保護率80%；12℃保存有效期達10月以上。

三、 兔瘟-巴氏桿菌病-魏氏梭菌三聯(lián)滅活疫苗

將兔瘟病毒皮下接種健康兔，采取瀕死或者死亡兔的肝、脾、腎等含毒組織，將組織搗碎后按比例加鹽水研磨過濾，加入甲醛混勻滅活。將巴氏桿菌接種含有裂解血的馬丁肉湯中培養(yǎng)24小時，純凈性檢合格后再將菌種接種于血液馬丁肉湯中含氧培養(yǎng)，菌液涂片檢查純度合格后按一定含菌量加入甲醛滅活。將魏氏梭菌接種到肉肝胃酶消化湯中，純檢合格后再接種到新的肉肝胃酶消化湯中培養(yǎng)。將合格菌液加入甲醛溶液滅活。將三種合格的滅活毒（菌）液調(diào)pH值到7.0，然后按照比例加上氫氧化鋁膠、蜂膠等佐劑配制成兔瘟-巴氏桿菌病-魏氏梭菌三聯(lián)滅活疫苗，經(jīng)無菌、安全、效力實驗和物理性狀檢驗合格后備用。

二聯(lián)苗、三聯(lián)苗的對兔瘟的防治有重要作用，效果明顯、易保存，運輸方便，可在生產(chǎn)上也出現(xiàn)過注射聯(lián)苗后在免疫期內(nèi)仍發(fā)生兔瘟流行，而且也存在滅活不完全引起的風險，加上如何平衡兔瘟和巴氏桿菌病、魏氏梭菌病的免疫期差距和配制比例，以增強免疫力、延長免疫期、降低成本也是值得進一步研究的問題。市場上很多聯(lián)苗因為各抗原比例、濃度等問題，在生產(chǎn)上使用的劑量很大，副作用很明顯，免疫效果也受到影響。

四、 基因工程疫苗

1.基因工程亞單位疫苗。VP60是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，有兩個主要的抗原決定簇，具有很高的抗原免疫性，是誘導抗病毒感染的主要核衣殼蛋白，也是分析病毒屬性和親緣關(guān)系的蛋白。通過基因工程技術(shù)將RHDV的VP60蛋白在表達載體（昆蟲細胞或者幼蟲、大腸桿菌、乳酸桿菌、腺病毒、酵母、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯）中進行體外表達，所表達的蛋白自我裝配成與RHDV大小和形態(tài)相似的病毒樣顆粒（VLPs），該病毒顆粒不含病毒核酸，無法復制和擴增，無感染性，但具有免疫原性，可激活固有免疫應答。Boga J A等就VP60在大腸桿菌中表達，表達蛋白加入弗氏佐劑免疫兔群，能夠?qū)ν卯a(chǎn)生保護作用。王永山等將VP60基因在大腸桿菌中表達，用重組蛋白、免疫佐劑和卡介苗素制備的亞單位疫苗，該疫苗能保護兔抵抗2倍常規(guī)攻毒劑量強毒的攻擊。Nagesha H S等用桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)表達了VP60，表達蛋白可裝配成類病毒樣粒子（VLPs），病毒樣粒子可刺激兔群機體產(chǎn)生強烈的體液免疫，抵抗RHDV的攻擊。Xuexing Zheng等用重組桿狀病毒在蠶的幼蟲中表達VP60蛋白，加入弗氏佐劑乳化后，免疫兔群，免疫保護期可達一年；沒有加佐劑的保護期僅有180天。Boga J A等將VP60的編碼序列插入酵母表達，重組的VP60蛋白抗原在不加佐劑條件下可對RHDV完全保護。嚴維魏等將VP60基因插入酵母轉(zhuǎn)移載體中獲得重組酵母菌，該酵母菌具有良好的抗原性，且血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。李傳山等構(gòu)建了植物表達載體pBI21-VP60，利用根瘤農(nóng)桿菌介導葉盤法轉(zhuǎn)化串葉松香草篩選擬轉(zhuǎn)基因植株，生產(chǎn)RHDV食用疫苗。Castanon S等構(gòu)建了植物表達載體PK2-VP60表達蛋白，加入弗氏佐劑皮下注射成年兔，對照兔40小時后死亡，有明顯的臨床癥狀，而免疫兔全部存活。

VLPs具有較好的免疫原性和更好的安全性，易被免疫系統(tǒng)識別。用VLPs制備的疫苗低劑量免疫后就能刺激機體產(chǎn)生良好的免疫應答，免疫兔后即可產(chǎn)生較強的體液免疫應答，保護性抗體可維持1年以上。VLPs作為VP60的亞單位表達蛋白，具有很高的免疫原性，且穩(wěn)定性好、安全性高，疫苗產(chǎn)量不受免疫兔數(shù)量的限制，可大規(guī)模生產(chǎn)。江蘇省農(nóng)業(yè)科學院兔病學科團隊研發(fā)的兔病毒性出血癥桿狀病毒載體滅活疫苗（BACVP60株）獲得國家新獸藥一類注冊證書，這是我國第一個兔用基因工程疫苗，也是世界上第一個獲得政府許可證的兔瘟亞單位疫苗。該疫苗對家兔保護率為100%，免疫有效期達7個月，保存期長達24個月。

2.重組病毒活載體疫苗。隨著分子生物學的研究進展，VP60蛋白可在大腸桿菌、酵母和昆蟲細胞等表達系統(tǒng)表達，制備成亞單位疫苗，也可用馬鈴薯病毒（PPV）、串葉松香草、百脈根等植物表達為載體的重組PPV-NK-VP60蛋白，利用植物進行口服免疫，對預防RHDV是一個全新的思路。Bertagnoli S等用牛痘病毒為載體構(gòu)建的重組病毒經(jīng)皮內(nèi)和口服免疫兔，可抵抗RHDV強毒的攻擊，對野兔的RHD也有很好的免疫作用。Erlinda Fernundeza等用腺病毒載體構(gòu)建了表達VP60蛋白的重組載體制備疫苗，產(chǎn)生的抗體可保持1年以上。此外還有很多學者用鳥痘病毒、兔痘病毒、金絲雀痘病毒等為基礎(chǔ)的載體構(gòu)建的重組病毒活載體疫苗，可產(chǎn)生滴度很高的抗RHDV特異性抗體，抵抗RHDV強毒的攻擊。重組疫苗對妊娠母兔和其繁殖率無任何的副作用，具有良好的生物安全性和穩(wěn)定性。Torres等用100倍的試驗劑量對重組病毒疫苗使用的安全性做了評估，未引起家兔的免疫耐受，對孕兔也未造成傷害。

Barcena J等用減毒的黏液瘤病毒（MV）構(gòu)建表達出的VP60免疫兔，可同時保護MV和RHDV和攻擊，因為表達的重組病毒帶有可轉(zhuǎn)移的胃腸炎病毒（TGEV）的抗原決定簇。Juan Barcena等用MV的一株自然弱毒株構(gòu)建了重組RHDV活載體疫苗，也可阻止兩種疾病的發(fā)生。Bertagnoli S等用MV的一株細胞致弱毒株構(gòu)建了重組MV-RHDV，可誘導高水平的RHDV和MV特異性抗體，可抵抗致死量RHDV和MV的攻擊。用兔黏液瘤病毒作為RHDV的載體，可同時有效預防兔群的兩大疾病，有效地降低了重組疫苗向非目標宿主散播的風險。致弱的兔黏液瘤病毒，既不會向自然界引入新病毒的危險，也可保證病毒的水平傳播特性。黃艷秋等用牛皰疹病毒1型為載體，制備了RHDV VP60重組蛋白疫苗，該疫苗可誘導小鼠產(chǎn)生RHDV特異性抗體。

兔病毒性出血癥基因工程疫苗的研制及在臨床中的成功應用，為我國養(yǎng)兔業(yè)在兔瘟防控領(lǐng)域找到新的方向，但是不同載體表達產(chǎn)物作為基因工程疫苗仍具有不同的缺陷。比如大腸桿菌表達的VP60具有不可溶性及免疫效果相對較差；重組痘病毒載體疫苗引起兔全身潛伏感染；重組病毒疫苗存在向環(huán)境擴散的安全問題；轉(zhuǎn)基因植物載體的表達量不理想等，加上新的變異亞型的出現(xiàn)，傳統(tǒng)的兔病毒性出血癥疫苗無法對其保護。但是Nadya Urakova（30）等研究發(fā)現(xiàn)RHDV在小鼠體內(nèi)的能力較差，用高劑量的RHDV攻擊標準的實驗室小鼠和缺乏功能性I型干擾素受體的基因敲除動物，這些動物都沒有出現(xiàn)疾病的臨床跡象，通過實時聚合酶鏈式反應PCR對病毒RNA的時間定量也并沒有顯示出病毒擴增的跡象。這些數(shù)據(jù)表明RHDV不能在小鼠體內(nèi)復制，甚至不能在先天免疫系統(tǒng)嚴重受損的動物體內(nèi)復制。這就需要科研人員加快對基因工程疫苗的研發(fā)，使其發(fā)揮優(yōu)良高效的免疫保護作用，以保障養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展。