李細(xì)媛，朱智鑫，趙海龍△

黑色素瘤是一種源自皮膚、黏膜、葡萄膜和腦膜等部位黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，每年黑色素瘤患者病死率超過3.5%，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的5年生存率僅為15%~20%［1］。黑色素瘤早期主要通過手術(shù)切除治療，深度轉(zhuǎn)移或已擴(kuò)散至淋巴結(jié)者主要依賴免疫療法、化療和放療等治療手段［2］。在進(jìn)展為黑色素瘤過程中，黑色素細(xì)胞常伴隨絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路相關(guān)基因突變或蛋白過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖水平和侵襲能力過度增強(qiáng)［3］。約50%的黑色素瘤患者存在鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（BRAF）突變，其中最常見的為BRAFV600E突變［4］。

目前臨床上BRAF突變型黑色素瘤的靶向治療藥物以BRAF抑制劑和絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MEK）抑制劑組合為主，臨床效果顯著，患者腫瘤抑制率和總生存期均有明顯改善［5］。然而，目前臨床上已經(jīng)出現(xiàn)大量對(duì)BRAF抑制劑或聯(lián)合MEK抑制劑治療黑色素瘤產(chǎn)生耐藥性的病例，尤其在治療后期出現(xiàn)了嚴(yán)重的藥物相關(guān)不良反應(yīng)并進(jìn)一步發(fā)生腫瘤的惡性化轉(zhuǎn)移［5］。本文重點(diǎn)討論單藥型BRAF抑制劑或聯(lián)合MEK抑制劑治療BRAF突變型黑色素瘤耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制，并歸納總結(jié)耐藥后靶向治療和免疫治療的最新研究進(jìn)展。

1 BRAF突變型黑色素瘤耐藥性的發(fā)生機(jī)制

BRAF突變型黑色素瘤耐藥性主要分為原發(fā)性耐藥性、適應(yīng)性耐藥性和繼發(fā)性耐藥性，發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，涉及腫瘤細(xì)胞內(nèi)以及腫瘤微環(huán)境中基因、表觀遺傳和代謝等多方面變化［6］。

1.1 原發(fā)性耐藥性 約20%接受BRAF抑制劑治療的BRAFV600E突變型黑色素瘤患者在初次治療期間即出現(xiàn)病情惡化且發(fā)生轉(zhuǎn)移，說明部分黑色素瘤在發(fā)生發(fā)展初期就已經(jīng)具有內(nèi)在耐藥性［7］。研究表明，在BRAFV600E突變的黑色素瘤細(xì)胞系和原位腫瘤中，內(nèi)在基因突變和源自腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)的內(nèi)源性分泌因子是誘發(fā)針對(duì)BRAF抑制劑原發(fā)耐藥性的驅(qū)動(dòng)因素之一［6］。

人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶-張力蛋白同源的基因（PTEN）是一種抑癌基因，也是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子。BRAF突變型黑色素瘤中頻發(fā)內(nèi)源性PTEN突變和缺失［8］。He等［8］研究表明，PTEN缺失會(huì)激活BRAF突變型黑色素瘤中MAPK和PI3K-蛋白激酶B（AKT）信號(hào)通路，并通過抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)性調(diào)節(jié)蛋白（BIM）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)而誘發(fā)內(nèi)在耐藥性。Griewank等［9］發(fā)現(xiàn)，在BRAF突變型黑色素瘤中，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因（RB）信號(hào)通路的失調(diào)驅(qū)動(dòng)MAPK/PI3K信號(hào)通路的激活，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞不受控制地增殖。此外，黑色素瘤細(xì)胞中RB信號(hào)通路中p16缺失的原因有細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子2A（CDKN2A）的缺失（50%～80%）、失活突變（16%）和表觀遺傳沉默（20%）［9］。Smalley等［10］發(fā)現(xiàn)在BRAFV600E突變型黑色素瘤中細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）存在過表達(dá)情況，與BRAF抑制劑耐藥性的形成呈正相關(guān)。

大鼠肉瘤病毒癌基因同源（RAS）相關(guān)的C3肉毒素底物1（RAC1）作為Rho家族的小GTP結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞骨架重構(gòu)和細(xì)胞遷移。其中RAC1P29S是黑色素瘤中繼BRAFV600E（50%）和NRASQ61（20%）之后的第三大常見熱點(diǎn)突變，占4%。RAC1P29S是一種激活性突變，促使RAC1發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和遷移水平提高［11］。Uribe-Alvarez等［12］研究表明，BRAFV600E突變型黑色素瘤中內(nèi)源性RAC1P29S與對(duì)BRAF抑制劑的早期耐藥性有關(guān)，并且沉默RAC1P29S表達(dá)可以恢復(fù)細(xì)胞對(duì)BRAF抑制劑的敏感性。

神經(jīng)纖維素-1（NF-1）是一種腫瘤抑制因子，可以通過抑制RAS表達(dá)來限制MAPK信號(hào)通路的激活。Tangella等［6］研究表明NF1的表達(dá)缺失與BARF抑制劑的耐藥性呈正相關(guān)，尤其是在使用BRAF抑制劑維莫非尼（Vemurafenib）治療黑色素瘤產(chǎn)生耐藥性的患者中頻發(fā)內(nèi)源性NF-1基因突變。

MEK1/2蛋白是BRAF蛋白的下游分子，可促進(jìn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）磷酸化和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)［13］。Wagle等［14］研究發(fā)現(xiàn)，MEK1C121S的突變與細(xì)胞對(duì)BRAF和MEK抑制劑耐藥性形成有關(guān)。同樣，Carlino等［15］在使用BRAF抑制劑治療BRAF突變型黑色素瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性MEK1P124突變導(dǎo)致的耐藥性是患者無進(jìn)展生存期縮短的主要原因之一。

1.2 適應(yīng)性耐藥性 臨床中應(yīng)用BRAF抑制劑治療后，黑色素瘤患者在治療初期多數(shù)會(huì)出現(xiàn)腫瘤區(qū)域縮小，但黑色素瘤體不會(huì)完全消失［1］。目前普遍認(rèn)為這是BRAF抑制劑誘導(dǎo)出現(xiàn)的補(bǔ)償機(jī)制，可促使部分原始腫瘤細(xì)胞的存活能力增強(qiáng)，進(jìn)而出現(xiàn)抑制劑治療耐受情況，稱為適應(yīng)性耐藥性。適應(yīng)性耐藥性的發(fā)生是可逆的，且不具有遺傳性［6］。

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）作為對(duì)黑色素細(xì)胞的早期生長和分化至關(guān)重要的主調(diào)控因子，參與黑色素瘤細(xì)胞侵襲、生存、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、自噬等諸多生物學(xué)過程［16］。在不同類型的黑色素瘤患者中MITF表達(dá)水平不一［17］。其中，MITF高表達(dá)患者出現(xiàn)原發(fā)黑色素瘤體積增大和增殖水平提高的現(xiàn)象，而MITF低表達(dá)患者則多出現(xiàn)侵襲性更高的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤［16］。Rathore等［18］發(fā)現(xiàn)耐藥型黑色素瘤細(xì)胞系中MITF低表達(dá)，但侵襲性相關(guān)的核因子（NF）-κB信號(hào)通路和AXL的表達(dá)水平反而較高，說明MITF低表達(dá)與黑色素瘤耐藥性表型的形成以及惡性程度增高存在密切關(guān)聯(lián)。相反，Smith等［19］研究認(rèn)為由配對(duì)盒基因（PAX3）介導(dǎo)的MITF高表達(dá)是黑色素瘤細(xì)胞早期非突變和可逆的藥物耐受狀態(tài)的驅(qū)動(dòng)因素。如上所述，雖然黑色素瘤增殖和侵襲均參與黑色素瘤耐藥性形成，但MITF呈現(xiàn)出截然相反的表達(dá)水平。此外，研究表明BRAF抑制劑治療后黑色素瘤細(xì)胞在增殖和侵襲狀態(tài)之間的表型轉(zhuǎn)換，促使腫瘤細(xì)胞在早期治療中快速適應(yīng)和存活，導(dǎo)致耐藥性出現(xiàn)［17］。但是，由于MITF參與的生物學(xué)過程十分復(fù)雜，其不同表達(dá)水平導(dǎo)致黑色素瘤進(jìn)展方向不同的原因和機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

1.3 繼發(fā)性耐藥性 繼發(fā)性耐藥性主要指最初有治療效果并伴隨腫瘤消退的患者在后續(xù)治療過程中出現(xiàn)復(fù)發(fā)情況，是黑色素瘤患者最主要的耐藥類型。繼發(fā)性耐藥性的產(chǎn)生主要與MAPK信號(hào)通路中基因突變情況有關(guān)，后者誘導(dǎo)MAPK信號(hào)通路過度激活或利用替代通路（如PI3K-AKT通路）繞過MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖［20］。Johnson等［21］研究發(fā)現(xiàn)部分基因突變參與黑色素瘤繼發(fā)性耐藥性的產(chǎn)生，包括NRAS或KRAS突變、BRAF剪接變體、BRAFV600E/K擴(kuò)增以及MEK1/2突變。

受體酪氨酸激酶（RTKs）是MAPK信號(hào)通路的上游蛋白。Sullivan等［22］已證明RTKs的上調(diào)可以通過激活RAS蛋白而直接激活MAPK信號(hào)通路。此外，胰島素樣生長因子1受體（IGFR1）、血小板衍生生長因子受體（PDGFR）β等均可上調(diào)RTKs表達(dá)，同時(shí)經(jīng)非ERK依賴途徑激活PI3K-AKT通路［22］。臨床研究表明，BRAF抑制劑治療可導(dǎo)致部分黑色素瘤細(xì)胞的RTKs表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)伴隨MAPK信號(hào)通路或替代的PI3K-AKT信號(hào)通路激活，進(jìn)而提高細(xì)胞增殖水平并形成耐藥性［23］。

Yin等［24］研究發(fā)現(xiàn)在約28%的黑色素瘤中存在NRAS激活性突變，其中最常見的是NRASQ61R突變。NRAS突變體在被激活表達(dá)后通過誘導(dǎo)絲氨酸/蘇氨酸激酶（RAF）的二聚化進(jìn)而激活MAPK通路［24］。此外，在BRAFV600E突變型黑色素瘤中MEK1突變被證實(shí)與對(duì)BRAF抑制劑產(chǎn)生的繼發(fā)性耐藥性存在正相關(guān)［15］，同時(shí)，MEK1/2的組成性激活或藥物結(jié)合位點(diǎn)的突變，還可以導(dǎo)致對(duì)MEK抑制劑耐藥性的發(fā)生［25］。Little等［26］研究證實(shí)BRAFV600E突變擴(kuò)增也是導(dǎo)致對(duì)MEK抑制劑產(chǎn)生耐藥的主要因素，BRAFV600E擴(kuò)增通過激活MEK，進(jìn)而激活MAPK信號(hào)通路的下游組成蛋白來驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖，形成耐藥性。

BRAFV600E剪接變體也可以產(chǎn)生對(duì)BRAF抑制劑的耐藥性。Clark等［27］研究發(fā)現(xiàn)在耐藥型BRAFV600E黑色素瘤細(xì)胞中存在異常剪接的BRAFV600E異構(gòu)體，即p61BRAFV600E，該異構(gòu)體缺乏包括RAS結(jié)合域（RBD）在內(nèi)的外顯子3-5，能夠不依賴RAS途徑進(jìn)行二聚化，進(jìn)而形成耐藥性。Jiang等［28］研究發(fā)現(xiàn)PI3K與MAPK通路之間存在交叉?zhèn)鬟_(dá)，耐藥型BRAF突變型黑色素瘤通過避開BRAF和MEK抑制劑靶向的蛋白位點(diǎn)，利用替代通路中AKT蛋白激活MAPK信號(hào)通路中的ERK以促進(jìn)細(xì)胞生存。

總之，在單藥型BRAF抑制劑和（或）MEK抑制劑聯(lián)合治療過程中是否產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥性很大程度上取決于MAPK通路或替代通路的激活情況，而相關(guān)通路蛋白能夠起到提示惡性程度的作用。此外，通過RTKs表達(dá)上調(diào)直接影響上述通路中部分基因表達(dá)水平也是耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制之一。然而，目前關(guān)于原發(fā)性耐藥性和適應(yīng)性耐藥性發(fā)生機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)與區(qū)別仍不明確，還需進(jìn)一步研究來闡明耐藥性發(fā)生機(jī)制，以尋找新的治療模式組合，以期同時(shí)預(yù)防2種耐藥的發(fā)生。

2 耐藥型BRAF突變型黑色素瘤治療方案優(yōu)化的現(xiàn)狀及前景

如上所述，單藥型BRAF抑制劑和（或）MEK抑制劑聯(lián)合治療BRAF突變型黑色素瘤均易產(chǎn)生耐藥性，因此開發(fā)BRAF與MEK以外的其他靶點(diǎn)特異性藥物或新的治療方式已成為目前的研究熱點(diǎn)。

2.1 ERK抑制劑 原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥性主要涉及MAPK信號(hào)通路的重新激活，但通過抑制BRAF和MEK以阻礙MEK過度激活MAPK通路，仍然可能出現(xiàn)耐藥性［6］。ERK在MAPK/ERK通路中發(fā)揮著獨(dú)特的作用，可以使100多種不同的底物磷酸化，參與MAPK/ERK的激活或去激活反饋回路，而且只有1個(gè)MEK1/2的上游效應(yīng)物。ERK的重新激活是大多數(shù)繼發(fā)性耐藥性機(jī)制的核心。因此，ERK抑制劑目前被認(rèn)為是可以有效抑制MAPK通路并且減少耐藥性產(chǎn)生的靶點(diǎn)［29］。

Germann等［30］發(fā)現(xiàn)Ulixertinib/BVD-523是一種新型的、可逆的、腺苷三磷酸（ATP）競(jìng)爭(zhēng)性的ERK1/2抑制劑，具有高效能和ERK1/2選擇性。在BRAFV600E突變型黑色素瘤細(xì)胞系異種移植模型中，Ulixertinib/BVD-523與BRAF抑制劑聯(lián)合使用時(shí)產(chǎn)生了協(xié)同抗腫瘤增殖作用［30］。同樣，在BRAF/MEK聯(lián)合靶向治療后產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥的動(dòng)物模型中，單藥ERK抑制劑在體內(nèi)外均有顯著的抗腫瘤活性［31］。目前美國食品藥物監(jiān)督管理局（FDA）已將Ulixertinib/BVD-523列為治療轉(zhuǎn)移性BRAFV600E突變型黑色素瘤的快速通道藥物之一［30］。

SCH772984是一種新型選擇性的ERK1/2抑制劑，在BRAF、NRAS或KRAS突變的黑色素瘤細(xì)胞中具有納摩爾效力，并能在可耐受的劑量下誘導(dǎo)異種移植動(dòng)物模型腫瘤消退［32］。SCH772984還能有效地抑制對(duì)BRAF和MEK抑制劑聯(lián)合靶向治療耐藥的黑色素瘤細(xì)胞中的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖［32］。除此之外，還有較多處于臨床試驗(yàn)階段或臨床試驗(yàn)完成但結(jié)果尚未公布的ERK抑制劑，如LY3214996［33］、GDC0994［34］等。ERK抑制劑已經(jīng)是治療BRAFV600E突變型黑色素瘤耐藥性的研究熱點(diǎn)之一。

2.2 AXL抑制劑 通過上述耐藥性發(fā)生機(jī)制可見，RTKs是黑色素瘤適應(yīng)性和繼發(fā)性耐藥性機(jī)制的重要組成成分。RTKs家族由Tyro-3、AXL和Mer組成，尤其是AXL異常表達(dá)與癌癥的發(fā)展、耐藥性有關(guān)，并參與包括黑色素瘤在內(nèi)的多種腫瘤免疫逃逸；而在BRAF突變型黑色素瘤細(xì)胞系中也頻發(fā)AXL高表達(dá)、MITF低表達(dá)的耐藥表型［18］。已有研究探討AXL抑制劑治療耐藥型BRAF突變型黑色素瘤的效果，如尚在臨床試驗(yàn)階段的BGB-324/Bemcentinib（Ⅰ型）［35］、LDC1267（Ⅱ型）［36］等。

AXL-1047-MMAE是一種抗體偶聯(lián)藥物（ADC），可以在黑色素瘤動(dòng)物模型體內(nèi)外誘發(fā)細(xì)胞毒性。以AXL抑制劑為基礎(chǔ)的ADC治療不僅可以防止BRAF抑制劑耐藥性產(chǎn)生，而且能增強(qiáng)BRAF和MEK抑制劑聯(lián)合使用的療效，共同抑制耐藥細(xì)胞生長，并且對(duì)MAPK通路抑制劑有抗性的黑色素瘤具有顯著療效［37］。

2.3 抗程序性死亡受體/配體-1（PD-1/PD-L1）抗體 針對(duì)黑色素瘤的免疫原性，以PD-1及其配體PD-L1為靶點(diǎn)的免疫治療是目前臨床研究熱點(diǎn)之一。PD-1是一種重要的免疫抑制分子，通過抑制T細(xì)胞活性來抑制免疫系統(tǒng)，而抗PD-1單克隆抗體能夠阻斷PD-1受體，維持T細(xì)胞激活狀態(tài)以抑制腫瘤生長［38］。因此靶向PD-1的抗體，無論是單一療法還是與抗細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）藥物聯(lián)合治療在臨床上已經(jīng)顯示出治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的前景［39］。

尼伏單抗（Nivolumab）是一種人IgG4抗PD-1單克隆抗體，可以特異性附著于T細(xì)胞的PD-1受體上，防止T細(xì)胞的失活。其與另一種針對(duì)淋巴細(xì)胞中PD1受體的人源化單克隆抗體潘利珠單抗（Pembrolizumab）于2014年被FDA批準(zhǔn)用于黑色素瘤的治療［40］。針對(duì)PD-L1的IgG1同種型的全人源化單克隆抗體阿替珠單抗（Atezolizumab），以及另一種可同時(shí)阻斷PD-L1與PD-1和CD80分子相互作用的單克隆抗體度伐單抗（Durvalumab），尚處于驗(yàn)證BRAF突變型黑色素瘤患者治療效果的臨床試驗(yàn)階段［1］。

最新研究表明，靶向治療與免疫治療的聯(lián)合使用可以加強(qiáng)對(duì)腫瘤生長的控制，但伴有明顯的不良反應(yīng)，比如肝功能不全、熱射病等［41］。同時(shí)，靶向治療和免疫治療的給藥先后順序也有局限性，如MAPK靶向治療可能誘導(dǎo)腫瘤出現(xiàn)抗PD-1的轉(zhuǎn)錄特征，從而形成針對(duì)免疫治療的耐藥性［42］。

2.4 抗CTLA-4抗體 除PD-1外，CTLA-4也是黑色素瘤治療過程中的重要靶點(diǎn)之一［39］。CTLA-4在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和衰竭的活化T細(xì)胞上表達(dá)，與T細(xì)胞表面受體CD28共享B7配體（CD80和CD86）。當(dāng)CTLA-4與抗原提呈細(xì)胞的B7配體（CD80和CD86）結(jié)合后，通過內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用抑制T細(xì)胞激活，產(chǎn)生免疫抑制反應(yīng)。因此，腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)CTLA-4及相關(guān)受體蛋白，發(fā)揮后者的免疫抑制特性，進(jìn)而能夠逃避T細(xì)胞及相關(guān)免疫反應(yīng)的攻擊，完成免疫逃逸［43］。

伊匹單抗（Ipilimumab）于2011年被FDA批準(zhǔn)作為抗CTLA-4單克隆抗體藥物，用于治療不可切除或轉(zhuǎn)移性的黑色素瘤［40］。2015年FDA批準(zhǔn)Ipilimumab聯(lián)合Nivolumab治療黑色素瘤，但該組合容易出現(xiàn)藥物毒性反應(yīng)，目前，在保持原有療效的情況下，通過改變藥物劑量或調(diào)整給藥順序以減少該藥物毒性反應(yīng)的研究尚處于臨床試驗(yàn)階段［40］。其他抗CTLA-4抗體藥物如替西木單抗（Tremelimumab）、BCD-145治療黑色素瘤的研究仍在臨床試驗(yàn)階段［1］。

2.5 表觀遺傳療法 近年來表觀遺傳學(xué)是基因表達(dá)調(diào)控研究的熱點(diǎn)之一，異常的表觀遺傳修飾能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，從而降低化療藥物的效果［44］。因此，逆轉(zhuǎn)或修復(fù)異常表觀遺傳修飾可以為治療耐藥型BRAF突變型黑色素瘤提供新的治療思路［45］。DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)、研究最深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一，然而在黑色素瘤治療過程中DNA甲基化狀態(tài)異常與耐藥性形成機(jī)制的關(guān)系暫不明確，同時(shí)相關(guān)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）抑制劑臨床研究不夠深入，DNMT抑制劑能否有效降低BRAF突變型黑色素瘤耐藥性并改善治療效果還需進(jìn)一步研究與探討。

3 總結(jié)與展望

綜上，隨著耐藥性機(jī)制研究的逐步細(xì)化和深入，靶向治療藥物的選擇范圍也在逐漸擴(kuò)大，包括新的BRAF和MEK抑制劑，以及其他靶點(diǎn)抑制劑的單藥使用或聯(lián)合使用。此外，免疫治療也是一個(gè)新的關(guān)注領(lǐng)域，多種相關(guān)藥物正處于研究或臨床試驗(yàn)階段，就目前試驗(yàn)效果來看，有可能實(shí)現(xiàn)對(duì)BRAF突變型黑色素瘤的長效控制。針對(duì)耐藥型BRAF突變型黑色素瘤迫切需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究，開發(fā)臨床應(yīng)用范圍更廣的靶向藥物以及改善免疫微環(huán)境的個(gè)性化免疫治療方案，提供更多的研究數(shù)據(jù)以便制定聯(lián)合用藥的最優(yōu)療程與組合方式。