賀靜，孫曉慧△，楊莉，烏宇亮

活性氧（reactive oxygen species，ROS）在氧化應(yīng)激條件下可在心肌細胞內(nèi)過量聚集而引起細胞毒性，造成心肌細胞的凋亡和功能失調(diào)［1］。叢生蛋白（clusterin，CLU）是一種多功能伴侶蛋白，可分為分泌型和核型。其與氧化還原反應(yīng)關(guān)系密切，是氧化應(yīng)激反應(yīng)的感受器，可保護細胞抵抗應(yīng)激反應(yīng)。研究顯示，CLU可以通過抑制線粒體片段化進而抑制缺血、缺氧條件下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡，從而保護內(nèi)皮細胞［2］。在心肌梗死患者血清中，分泌型CLU（secretory clusterin，sCLU）水平顯著升高［3-4］。然而，sCLU對心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的作用尚不清楚。本研究擬探討sCLU對氧化應(yīng)激條件下心肌細胞損傷的作用及其可能的作用機制，以期為心肌氧化應(yīng)激損傷的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 大鼠心肌細胞H9C2購自中科院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司。MTT試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）購自武漢博士德生物工程有限公司。H2O2購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。大鼠sCLU酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。丙二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司。Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qPCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）購自天根生化科技（北京）有限公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、RIPA裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、DCFH-DA熒光探針、原位末端轉(zhuǎn)移酶標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。脂質(zhì)體LipofetamineTM2000購自美國Invitrogen公司。線粒體自噬抑制劑Mdivi-1購自美國Sigma公司。sCLU過表達載體pcDNA3.1-sCLU由廣州銳博生物科技有限公司合成。兔抗大鼠CLU單克隆抗體、兔抗大鼠磷酸酶及張力蛋白同源物誘導(dǎo)的蛋白激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）、小鼠抗大鼠Parkin單克隆抗體、兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）單克隆抗體、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG購自英國Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1 H9C2細胞的培養(yǎng)及分組 采用快速融化法［5］復(fù)蘇H9C2細胞，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2~3 d傳代1次，選取對數(shù)生長期的心肌細胞備用。實驗分3個部分。（1）實驗1。對數(shù)生長期的心肌細胞分為Control組（僅更換培養(yǎng)基）和H2O2組（100μmol/L H2O2處理）。（2）實驗2。對數(shù)生長期的心肌細胞分為Control組（僅更換培養(yǎng)基）、pcDNA3.1組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對照空質(zhì)粒）、pcDNA3.1-sCLU組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-sCLU過表達質(zhì)粒）、H2O2組（100μmol/L H2O2處理）、H2O2+pcDNA3.1組（pcDNA3.1對照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后加入100μmol/L H2O2處理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU組（pcDNA3.1-sCLU過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后加入100μmol/L H2O2處理）。（3）實驗3。對數(shù)生長期的心肌細胞分為DMSO組（加入1%體積分數(shù)的DMSO）、Mdivi-1組（10μmol/L的Mdivi-1處理）、H2O2+DMSO組（加入1%體積分數(shù)的DMSO處理30 min后加入100μmol/L的H2O2處理）、H2O2+Mdivi-1組（10μmol/L的Mdivi-1處理30 min后加入100μmol/L的H2O2處 理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU組（pcDNA3.1-sCLU過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后加入100μmol/L H2O2處理）、H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1組（pcDNA3.1-sCLU過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后加入10μmol/L的Mdivi-1處理30 min，再加入100μmol/L H2O2處理）。

1.2.2 qPCR檢測細胞中sCLUmRNA表達水平 收集1.2.1分組中實驗1各組細胞，采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，檢測RNA純度和濃度。采用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒合成cDNA。反應(yīng)總體積20μL：SuperReal PreMix Plus 10μL，上、下游引物各0.8μL，cDNA模板2μL，ROX Reference Dye 0.4μL，無RNA酶雙蒸水6μL。反應(yīng)條件：95℃15 min；95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)。sCLU引物：上游5′-TGCCTCTCTCCCACTACGG-3′，下 游5′-CTCCTTGCACACT?GTCGGG-3′；GAPDH引物：上游5′-GGAGAGTGTTTCCTC?GTCCC-3′，下游5′-ACTGTGCCGTTGAATTTGCC-3′。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.2.3 ELISA檢測培養(yǎng)液上清液中sCLU蛋白含量 收集1.2.1分組中實驗1各組細胞培養(yǎng)液上清液，采用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中sCLU的含量。將100μL的各處理組細胞培養(yǎng)上清液加入酶標板，37℃孵育2 h。棄上清液后加入100μL sCLU抗體工作液孵育1 h。洗滌3次加入100μL親和鏈霉素-HRP孵育30 min，TMB顯影液顯影。在450 nm波長處檢測樣品吸光度（A）值。根據(jù)標準品繪制標準曲線并計算樣品濃度。

1.2.4 Western blot檢測細胞中CLU、PINK1、Parkin、LC3蛋白表達 收集1.2.1分組中實驗1、實驗2各組細胞。采用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次；加入450μL RIPA蛋白裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。各組分別取30μg蛋白上樣，SDS-PAGE蛋白電泳；電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉，按照常規(guī)的方法加入CLU、PINK1、Parkin、LC3、GAPDH抗體（均1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST緩沖液洗膜3次；加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶5 000），室溫孵育2 h；TBST緩沖液洗滌；采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。Image J 1.8.0圖像分析系統(tǒng)分析灰度值，計算目的蛋白相對表達水平。

1.2.5 MTT法檢測細胞活力 將1.2.1分組中實驗2、實驗3各組細胞接種于96孔板，每孔200μL，含2×104個細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。每孔加入MTT溶液（5 g/L）10μL，孵育4 h，棄上清液，按每孔100μL加入二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min，酶標儀490 nm處讀取A值，設(shè)對照組細胞活力為100%，計算其余各處理組細胞活力。處理組細胞活力=（處理組A值/對照組A值）×100%。

1.2.6 TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡 將1.2.1分組中實驗2、實驗3各組細胞接種于6孔板中，4%多聚甲醛固定25 min，PBS洗滌2次，0.2%的TritonX-100處理5 min，漂洗2次，加入50μL TUNEL反應(yīng)混合液，37℃避光孵育1 h。漂洗后加入DAPI染核，抗熒光淬滅封片液封片后，熒光顯微鏡（×200）下觀察（激發(fā)波長550 nm）各組細胞紅色熒光陽性細胞所占比例，即為細胞凋亡率。

1.2.7 MDA和SOD水平檢測 將1.2.1分組中實驗2各組細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)結(jié)束后收集各組細胞的上清液，依據(jù)試劑盒說明書，檢測各組細胞中MDA和SOD水平。

1.2.8 DFCH-DA熒光探針測定細胞ROS水平 將1.2.1分組中實驗2各組細胞接種于6孔板中，用血清將DCFH-DA按照1∶1 000稀釋制備試劑，加入6孔板中，每孔1 mL，37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。吸掉培養(yǎng)液，無血清DMEM洗滌3次。收集細胞，熒光顯微鏡（×200）下觀察（激發(fā)波長488 nm）各組細胞的熒光強度。ROS水平以相對于Control組的相對熒光強度表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad 7.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗（方差齊）或Dunnett’s T3法檢驗（方差不齊）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗1 與Control組比較，H2O2組細胞中sCLUmRNA、細胞培養(yǎng)上清液中sCLU蛋白及細胞中CLU蛋白表達水平均降低（P＜0.01），見表1、圖1。

Tab.1 Comparison of the relative mRNA and protein levels of CLU in cells，and the protein levels of sCLU in the medium of H9C2 cells between the control group and the H 2O2 group表1 Control組和H 2O2組細胞中sCLU mRNA和蛋白相對表達水平、細胞培養(yǎng)上清液中sCLU蛋白水平的比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of the relative mRNA and protein levels of CLU in cells，and the protein levels of sCLU in the medium of H9C2 cells between the control group and the H 2O2 group表1 Control組和H 2O2組細胞中sCLU mRNA和蛋白相對表達水平、細胞培養(yǎng)上清液中sCLU蛋白水平的比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01。

組別Control組H2O2組t sCLU mRNA 1.03±0.05 0.39±0.09 10.700＊＊CLU蛋白0.98±0.09 0.56±0.08 6.298＊＊細胞培養(yǎng)上清液sCLU蛋白（ng/L）237.90±25.12 80.05±17.06 9.002＊＊

Fig.1 Comparison of the protein levels of CLU between the control group and the H2O2 group圖1 Control組和H2O2組細胞中CLU蛋白表達水平的比較

2.2 實驗2

2.2.1 各組細胞活力和凋亡水平比較 與Control組比較，pcDNA3.1組和pcDNA3.1-sCLU組細胞活力及細胞凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，H2O2組、H2O2+pcDNA3.1組細胞活力降低，細胞凋亡率升高（P＜0.05），H2O2+pcDNA3.1-sCLU組細胞凋亡率升高（P＜0.05），但細胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與H2O2組比較，H2O2+pcDNA3.1組細胞活力及細胞凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，H2O2+pcDNA3.1-sCLU組細胞活力升高，細胞凋亡率下降（P＜0.05），見表2、圖2。

2.2.2 各組細胞ROS、MDA和SOD水平的比較 與Control組比較，pcDNA3.1組和pcDNA3.1-sCLU組細胞ROS、MDA和SOD水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，H2O2組、H2O2+pcDNA3.1組、H2O2+pcDNA3.1-sCLU組ROS、MDA水平均升高，SOD水平均降低（P＜0.05）。與H2O2組比較，H2O2+pcDNA3.1組細胞ROS、MDA和SOD水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，H2O2+pcDNA3.1-sCLU組ROS和MDA水平均降低（P＜0.05），SOD水平升高（P＜0.05），見圖3、表3。

Tab.2 Comparison of the viability and apoptosis levels between the six groups of cells表2 各組細胞活力和凋亡率的比較（n=3，%，±s）

Tab.2 Comparison of the viability and apoptosis levels between the six groups of cells表2 各組細胞活力和凋亡率的比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比 較，b與pcDNA3.1組比 較，c與pcDNA3.1-sCLU組比較，d與H2O2組比較，e與H2O2+pcDNA3.1組比較，P＜0.05。

組別Control組pcDNA3.1組pcDNA3.1-sCLU組H2O2組H2O2+pcDNA3.1組H2O2+pcDNA3.1-sCLU組F細胞活力100.00±8.86 114.30±8.14 112.00±12.48 60.87±8.07abc 58.22±7.35abc 87.41±6.65bcde 23.530＊＊細胞凋亡率4.30±0.64 6.68±0.69 5.43±0.62 44.88±6.73abc 39.85±3.88abc 20.41±3.70abcde 78.890＊＊

Fig.2 Comparison of the apoptosis levels between the six groups(Bar=100μm)圖2 各組細胞凋亡水平的比較（標志線=100μm）

Fig.3 Comparison of the ROS levels between the six groups(Bar=100μm)圖3 各組細胞ROS水平的比較（標志線=100μm）

Tab.3 Comparison of the ROS,MDA and SOD levels between the six groups表3各組細胞ROS、MDA和SOD水平的比較（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of the ROS,MDA and SOD levels between the six groups表3各組細胞ROS、MDA和SOD水平的比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比 較，b與pcDNA3.1組比 較，c與pcDNA3.1-sCLU組比較，d與H2O2組比較，e與H2O2+pcDNA3.1組比較，P＜0.05。

組別Control組pcDNA3.1組pcDNA3.1-sCLU組H2O2組H2O2+pcDNA3.1組H2O2+pcDNA3.1-sCLU組F ROS 100.50±7.91 109.10±15.03 95.89±6.37 279.00±39.11abc 289.10±28.31abc 187.70±24.92abcde MDA 100.00±5.67 97.29±6.93 99.65±5.54 263.40±37.72abc 282.50±32.52abc 171.50±29.50abcde SOD 100.00±6.44 98.69±3.28 105.00±8.34 56.24±5.13abc 59.78±3.61abc 77.88±5.91abcde 44.000＊＊37.980＊＊42.240＊＊

2.2.3 各組細胞PINK1、Parkin和LC3蛋白表達水平的比較 與Control組比較，pcDNA3.1組和pcDNA3.1-sCLU組細胞PINK1、Parkin蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，H2O2組和H2O2+pcDNA3.1組細胞PINK1和Parkin蛋白表達水平均升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均降低（P＜0.05），H2O2+pcDNA3.1-sCLU組PINK1和Parkin蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與H2O2組比較，H2O2+pcDNA3.1組細胞PINK1和Parkin蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，H2O2+pcDNA3.1-sCLU組PINK1和Parkin蛋白表達水平降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.05），見圖4、表4。

Fig.4 The protein levels of PINK1,Parkin and LC3 in each group圖4 各組細胞PINK1、Parkin和LC3蛋白表達水平

Tab.4 Comparison of the protein levels of PINK 1,Parkin and LC3 between the six groups表4 各組細胞PINK1、Parkin和LC3蛋白表達水平的比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of the protein levels of PINK 1,Parkin and LC3 between the six groups表4 各組細胞PINK1、Parkin和LC3蛋白表達水平的比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與pcDNA3.1組比較，c與pcDNA3.1-sCLU組比較，d與H2O2組比較，e與H2O2+pcDNA3.1組比較，P＜0.05。

組別Control組pcDNA3.1組pcDNA3.1-sCLU組H2O2組H2O2+pcDNA3.1組H2O2+pcDNA3.1-sCLU組F PINK1 1.00±0.06 0.98±0.08 0.92±0.15 1.96±0.24abc 1.84±0.21abc 1.33±0.09de 26.190＊＊Parkin 1.00±0.08 1.07±0.11 1.12±0.12 1.95±0.17abc 1.91±0.16abc 1.16±0.14de 33.040＊＊LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.00±0.04 1.07±0.09 1.08±0.10 0.65±0.09abc 0.66±0.12abc 1.08±0.13de 14.180＊＊

2.3 各組細胞活力和凋亡水平的比較（實驗3）與DMSO組比較，Mdivi-1組細胞活力與細胞凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，H2O2+DMSO組細胞活力下降，而細胞凋亡率升高（P＜0.05）。與H2O2+DMSO組比較，H2O2+Mdivi-1組、H2O2+pcDNA3.1-sCLU組和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1組細胞活力均升高，細胞凋亡率均降低（P＜0.05）。與H2O2+Mdivi-1組比較，H2O2+pcDNA3.1-sCLU組和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1組細胞活力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，細胞凋亡率降低（P＜0.05）。與H2O2+pcDNA3.1-sCLU組比較，H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1組細胞活力及細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表5。

3 討論

心血管疾病中，心肌損傷的很大一部分原因來自缺血過程中細胞的氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基［6］。CLU是一種廣泛存在于人體組織和體液中，具有分子伴侶活性，可與多種分子結(jié)合并發(fā)揮多種功能的蛋白［7］。CLU可分為sCLU和核型。研究發(fā)現(xiàn)，sCLU參與多種重要的生理過程，包括細胞凋亡［8］、炎癥反應(yīng)［9］、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)［10］、細胞黏附及組織修復(fù)［11］等，并與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切［12］。此外，Turkieh等［3］發(fā)現(xiàn)，H9C2細胞中過表達sCLU可以降低蛋白酶體抑制劑MG-132誘導(dǎo)的細胞凋亡。小鼠心臟移植過程中，應(yīng)用重組CLU保存的離體心臟受損程度降低，表現(xiàn)為細胞凋亡、中性粒細胞浸潤和促炎因子分泌減少［13］。因此，sCLU可能作為氧化應(yīng)激條件下的氧化還原傳感器，對氧化應(yīng)激損傷的細胞發(fā)揮保護作用。Polimeno等［14］也發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細胞氧化損傷模型中sCLU蛋白表達水平降低。本研究應(yīng)用H2O2處理離體培養(yǎng)的大鼠心肌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，H2O2組細胞中sCLUmRNA、細胞培養(yǎng)上清液中sCLU蛋白及細胞中總CLU蛋白相對表達水平均降低，提示sCLU可能在細胞氧化應(yīng)激損傷過程中發(fā)揮保護作用。Jun等［15］研究發(fā)現(xiàn)，CLU可以通過激活A(yù)kt和GSK-3β信號通路而保護心肌細胞免受氧化應(yīng)激損傷的影響。本研究結(jié)果亦顯示，與Control組比較，H2O2組細胞活力降低，細胞凋亡率升高，ROS和MDA水平升高，SOD水平降低，證實H2O2能夠通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細胞損傷；另外，與H2O2組比較，H2O2+pcDNA3.1-sCLU組細胞活力升高，細胞凋亡率下降，ROS和MDA水平降低，SOD水平升高，再次證實sCLU過表達能減輕氧化應(yīng)激對心肌細胞的損傷。另有研究顯示，CLU過表達還可保護骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞及腎足突細胞抵御氧化應(yīng)激損傷［16-17］，而在骨肉瘤、前列腺腫瘤等細胞中敲低CLU則可增強腫瘤細胞對氧化應(yīng)激損傷的敏感性［18］。結(jié)合本研究，筆者認為CLU有保護細胞抵御氧化應(yīng)激損傷的作用。

Tab.5 Comparison of the viability and apoptosis levels between the six groups表5 各組細胞活力和凋亡率的比較（n=3，±s）

Tab.5 Comparison of the viability and apoptosis levels between the six groups表5 各組細胞活力和凋亡率的比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與DMSO組比較，b與Mdivi-1組比較，c與H2O2+DMSO組比較，d與H2O2+Mdivi-1組比較，e與H2O2+pcDNA3.1-sCLU組比較，P＜0.05。

組別DMSO組Mdivi-1組H2O2+DMSO組H2O2+Mdivi-1組H2O2+pcDNA3.1-sCLU組H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1組F細胞活力（%）100.00±4.84 94.48±3.07 59.50±6.54ab 78.56±4.65abc 87.87±7.54c 89.77±6.81c 18.630＊＊細胞凋亡率（%）5.56±1.43 9.43±2.69 48.55±4.48ab 30.53±4.70abc 20.49±2.69abcd 17.18±2.69acd 67.280＊＊

既往研究顯示，CLU可以通過參與氧化應(yīng)激、炎癥、胰島素生長因子1信號通路、KU70/BAX信號通路、腫瘤壞死因子α信號通路及絲裂原活化蛋白激酶信號通路等途徑在心肌細胞中發(fā)揮作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，pcDNA3.1-sCLU組細胞活力、細胞凋亡率、ROS和MDA水平、SOD的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能是由于CLU僅在氧化應(yīng)激等特定條件下才發(fā)揮相應(yīng)的作用。He等［17］研究也發(fā)現(xiàn)，單獨采用外源性CLU刺激腎足突細胞對細胞活力及氧化應(yīng)激水平無顯著影響。

線粒體自噬是一種以線粒體為目標的特殊自噬形式，其對整個線粒體網(wǎng)絡(luò)的功能完整性和細胞存活具有重要作用。線粒體自噬通過調(diào)節(jié)線粒體的質(zhì)量與數(shù)量維持心肌細胞的正常功能，線粒體自噬過度或不足均可影響心肌細胞的功能，甚至導(dǎo)致心肌細胞死亡。線粒體自噬過程受多種途徑調(diào)控，PINK1/Parkin是線粒體自噬中研究最多的信號通路，而氧化應(yīng)激是Pink1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬發(fā)生的重要始動因素［20］。因此，本研究分析了sCLU在心肌細胞中是否通過PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷作用，結(jié)果顯示，與Control組比較，H2O2組PINK1和Parkin蛋白表達水平升高，且細胞活力下降，細胞凋亡率升高，表明H2O2過度激活了線粒體自噬，進而導(dǎo)致心肌細胞損傷；與H2O2組比較，H2O2+pcDNA3.1-sCLU組PINK1和Parkin蛋白表達水平降低，表明sCLU過表達抑制了線粒體自噬，同時細胞活力升高，細胞凋亡率下降。本研究進一步采用線粒體自噬抑制劑Mdivi-1處理細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與H2O2+DMSO組比較，H2O2+Mdivi-1組、H2O2+pcDNA3.1-sCLU組和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1組細胞活力均升高，細胞凋亡率均下降；與H2O2+Mdivi-1組比較，H2O2+pcDNA3.1-sCLU組和H2O2+pcDNA3.1-sCLU+Mdivi-1組細胞活力無顯著變化，細胞凋亡率降低，提示sCLU對氧化應(yīng)激條件下H9C2細胞損傷的保護作用可能通過抑制線粒體自噬活性實現(xiàn)。另有研究顯示，在口腔癌細胞中sCLU可以通過AMPK/Akt/mTOR通路促進線粒體自噬，進而提升口腔癌細胞在饑餓條件下的生存能力［21］。然而，在氧化應(yīng)激損傷的心肌細胞中，sCLU調(diào)控PINK1/Parkin的分子機制尚不明確。

綜上所述，sCLU可對氧化應(yīng)激條件下的心肌細胞產(chǎn)生保護作用，其機制可能與抑制線粒體自噬的活化有關(guān)。sCLU有望成為一個新的治療心肌氧化應(yīng)激損傷的潛在靶標分子。