傅磊 李亮 卞建軍 沈磊 蘇玉璇 左金曼

成人原發(fā)免疫性PLT減少癥(ITP)曾稱特發(fā)性PLT減少性紫癜，是一種由自身抗體介導(dǎo)，以PLT破壞增加及生成減少為特征的獲得性自身免疫性出血性疾病[1-2]。ITP患者存在體液免疫功能異常，亦存在細胞免疫功能異常，特別是調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)、調(diào)節(jié)性B細胞(Breg細胞)的數(shù)量和(或)功能異常在疾病發(fā)生發(fā)展中起到十分重要的作用[3]。本文應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測成年ITP患者治療前后Treg細胞、Breg細胞水平變化，并與正常人進行比較，旨在了解ITP患者細胞免疫功能異常情況，為其治療提供方向。

對象與方法

1.對象：2017年1月～2020年6月于我科門診就診及住院的ITP患者82例(ITP組)，其中男45例，女37例，年齡16～72歲，平均年齡(44.52±11.26)歲，發(fā)病時平均PLT計數(shù)(10.25±6.32)×109/L。ITP診斷標準參照《成人原發(fā)免疫性PLT減少癥診斷與治療中國專家共識(2016年版)》[4]。排除標準：(1)其他自身免疫性疾病繼發(fā)PLT減少；(2)顱內(nèi)出血；(3)嚴重血栓病史；(4)嚴重肝、腎功能不全或心、肺功能障礙；(5)忌用糖皮質(zhì)激素；(6)妊娠或哺乳期。納入同期于我院體檢的健康者45例(對照組)，其中男25例，女20例，年齡19～65歲，平均年齡(43.78±10.59)歲。所有對照組受試者均已排除自身免疫性疾病和過敏性疾病史者。兩組受試者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過我院倫理委員會審核批準，所有受試者均知情同意。

2.方法

(1)一般資料收集：收集所有受試者的一般資料，包括年齡、性別。收集ITP患者發(fā)病時的PLT計數(shù)。

(2)治療方案：根據(jù)治療方案將82例ITP患者分為地塞米松組(地塞米松單藥治療，10例)和地塞米松+重組人PLT生成素(rhTPO)組(地塞米松聯(lián)合rhTPO治療，72例)。地塞米松單藥治療方案：地塞米松40 mg，每日1次靜脈滴注，共4日。地塞米松聯(lián)合rhTPO治療方案：地塞米松40 mg，每日1次靜脈滴注，共4日；rhTPO 15 000 U，每日1次皮下注射(PLT計數(shù)≥100×109/L時停用，最多應(yīng)用14日)。

(3)療效判斷：參照《成人原發(fā)免疫性PLT減少癥診斷與治療中國專家共識(2016年版)》[4]，療效包括完全反應(yīng)(CR)、有效(R)及無效(NR)，治療有效例數(shù)=CR例數(shù)+R例數(shù)。根據(jù)療效將82例ITP患者分為治療有效組(75例)和治療無效組(7例)。

(4)Treg細胞及Breg細胞水平檢測：所有治療有效患者均在治療前、后留取血液樣本，治療無效患者在治療開始后4周留取血液樣本，對照組受試者于體檢時留取血液樣本。加入不同抗體采用FACSCantoⅡ流式細胞儀(BD公司，美國)，應(yīng)用BD Cell Quest軟件分析實驗數(shù)據(jù)，分別記錄CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞及CD19+CD24highCD38highBreg細胞水平。

結(jié) 果

1.ITP患者治療后的臨床療效：82例ITP患者中地塞米松單藥治療10例，地塞米松聯(lián)合rhTPO治療72例。見表1。兩種方案治療后共75例有效(包括63例CR和12例R)，7例無效，總有效率為91.46%(75/82)。

表1 ITP患者治療后的臨床療效(例)

2.ITP組治療前和對照組受試者兩種細胞水平比較：ITP組治療前CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞及CD19+CD24highCD38highBreg細胞水平均明顯低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 ITP組治療前和對照組受試者兩種細胞水平比較

3.治療有效組和治療無效組患者治療前后兩種細胞水平比較：治療前兩組患者CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞及CD19+CD24highCD38highBreg細胞水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后治療有效組患者兩種細胞水平均高于同組治療前及同期治療無效組(P<0.05)，治療無效組患者治療前后兩種細胞水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 治療有效組和治療無效組患者治療前后兩種細胞水平比較

討 論

ITP是一種臨床常見出血性疾病，原因為各種免疫介導(dǎo)而致患者PLT過度破壞、PLT生成減少，引起發(fā)病[5]。T細胞及B細胞水平異常及功能改變在多種自身免疫性疾病中均起到重要作用。Treg細胞、Breg細胞具有低反應(yīng)性及免疫抑制性，通過獨特的免疫調(diào)節(jié)作用，可誘導(dǎo)和維持機體的自身免疫耐受。Treg細胞可高表達CD25，分泌IL-10及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等多種細胞因子，并表達特異性的FOXP3轉(zhuǎn)錄因子，因此CD4+CD25+FOXP3+是最經(jīng)典的Treg細胞免疫表型，此類Treg細胞可通過抑制T細胞的活化及自身反應(yīng)性T細胞的免疫反應(yīng)，進而促進抑制性細胞因子的分泌等作用，維持外周免疫耐受，可參與多種變態(tài)反應(yīng)性疾病及腫瘤免疫的發(fā)病[6-7]。Breg細胞是另一類具有獨特免疫調(diào)節(jié)作用的B細胞亞群[8]，可分泌IL-35、IL-10及TGF-β等細胞因子，參與自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、惡性腫瘤及過敏性疾病等多種疾病的免疫反應(yīng)。Breg細胞的常見表型有CD19+CD24highCD38high、CD19+CD24highCD27+、CD19+CD25highCD71high、CD19+CD24+FOXP3+等，目前研究最多的是CD19+CD24highCD38highBreg細胞。

Treg細胞減少及其功能缺陷會引起多種自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[9-10]。ITP作為一種十分常見的自身免疫性疾病，越來越多的研究開始探討其發(fā)生、發(fā)展進程中Treg細胞發(fā)揮的作用?，F(xiàn)有研究表明，ITP患者外周血及脾臟中的Treg細胞水平均明顯下降[11-12]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Treg細胞在ITP患者中不僅存在水平減少，還有功能的下降，其伴隨增殖相關(guān)蛋白水平下降和細胞自噬功能降低，從而參與疾病的發(fā)生及發(fā)展[13]。有學(xué)者通過檢測ITP患者體內(nèi)Treg細胞全基因組微小RNA(miRNA，miR)表達譜，發(fā)現(xiàn)其中miR-155-5p、miR-146b-5p和miR-142-3p的表達較對照組顯著降低，推測在ITP患者中miRNAs的低表達可能影響Treg細胞的功能[14]。本研究檢測ITP患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞水平，結(jié)果顯示，與對照組比較，ITP患者外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞水平明顯降低，與上述研究結(jié)果一致，提示Treg水平減少可能是影響ITP疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素。有研究進一步證明，ITP患者Treg細胞水平在進行糖皮質(zhì)激素治療前明顯低于正常人，但治療后Treg細胞水平明顯升高[15]。特別是經(jīng)大劑量地塞米松治療后，ITP患者Treg細胞數(shù)量明顯升高，PLT水平迅速恢復(fù)[16]。Sakakura等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，ITP患者在進行相關(guān)治療后處于完全緩解期時，特別是在脾臟切除術(shù)后，其Treg細胞水平明顯升高。另有學(xué)者通過系列針對成人和兒童ITP患者的研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞在外周血、骨髓和脾臟中的水平均顯著降低，Treg細胞功能明顯受損；在經(jīng)地塞米松、利妥昔單抗或PLT生成素受體激動劑等方案治療后，Treg細胞失調(diào)情況得以改善，PLT水平恢復(fù)[18]。本研究所有ITP患者在地塞米松單藥或聯(lián)合rhTPO治療方案治療后，治療有效組患者CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞水平較同組治療前明顯升高，而治療無效組該細胞水平較同組治療前無明顯升高，提示ITP患者Treg細胞水平異?？赡軈⑴c疾病發(fā)展。

Breg細胞水平減少及功能缺陷可參與SLE、再生障礙性貧血等多種自身免疫性疾病的發(fā)展過程[19-20]。目前Breg細胞在ITP中的作用得到越來越多的研究證實。研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者體內(nèi)Breg細胞水平明顯下降，并可通過調(diào)節(jié)體液免疫影響IL-10及TGF-β等細胞因子的表達，使患者Breg細胞功能下降[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血CD19+CD24highCD38highBreg細胞水平明顯低于對照組，與上述研究結(jié)果一致，提示Breg細胞水平減少可能是ITP發(fā)病的重要因素。相關(guān)研究顯示，ITP患者應(yīng)用地塞米松治療后，體內(nèi)Breg細胞水平升高，并促進IL-10的分泌增加，療效顯著[22]。另有學(xué)者通過應(yīng)用rhTPO聯(lián)合沙利度胺方案治療難治性ITP患者發(fā)現(xiàn)，加用rhTPO后患者Breg細胞和Treg細胞水平均顯著升高，總緩解率明顯提高[23]。本研究中，ITP患者應(yīng)用地塞米松單藥或聯(lián)合rhTPO方案經(jīng)有效治療后CD19+CD24highCD38highBreg細胞水平明顯恢復(fù)，而治療無效者該細胞水平無明顯變化，提示Breg細胞水平異常可能參與ITP患者的疾病發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)ITP患者體內(nèi)CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞及CD19+CD24highCD38highBreg細胞水平較對照組明顯下降，經(jīng)有效治療后兩者細胞水平顯著升高，治療無效時則無明顯變化，提示Treg細胞及Breg細胞可能參與ITP的發(fā)生和發(fā)展。其可能機制是患者體內(nèi)Treg細胞、Breg細胞水平的減少無法有效抑制免疫作用，使細胞免疫抑制功能出現(xiàn)缺陷，并導(dǎo)致各種細胞因子分泌下降，打破自身免疫平衡，最終引起自身反應(yīng)性T細胞、B細胞激活增多，導(dǎo)致PLT大量破壞。而經(jīng)過免疫抑制和(或)促PLT生成藥物治療后，患者Treg細胞、Breg細胞水平升高，免疫功能恢復(fù)，PLT水平升高，提示Treg細胞、Breg細胞在ITP的發(fā)生、發(fā)展中均起到重要作用，是ITP治療的兩個潛在生物靶點，如能及時有效地提高Treg細胞、Breg細胞水平并改善其功能，糾正機體免疫功能紊亂狀態(tài)，可作為ITP的一個新的治療方法。