楊 麗，張俊峰

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心內(nèi)科 200011)

心血管疾病是全球主要死亡原因之一[1]。糖尿病是心血管疾病和缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)最重要的危險(xiǎn)因素，心血管疾病合并糖尿病患者的病死率是非糖尿病患者的2～6倍。心肌再灌注往往引起心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)[2]。糖尿病患者較健康人群發(fā)生MIRI的比例明顯升高[3]。糖尿病和IRI都可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。橙皮素具有顯著的抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用。研究報(bào)道橙皮素在腦、視網(wǎng)膜等器官IRI過程中具有保護(hù)作用[4-5]，而在糖尿病MIRI(D-MIRI)中的報(bào)道較少。本研究擬探討橙皮素在D-MIRI中是否抑制氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性家兔24只，體重2.0～2.5 kg，購于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0004，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物房。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵守3R保護(hù)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2試劑與儀器

橙皮素購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司(M18402-25G)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUPT缺口末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒和蛋白酶K購自武漢賽維爾生物科技有限公司；DAB顯色劑購自德國DAKO公司。脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；烤箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；載玻片及蓋玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；渦旋混合器(武漢賽維爾生物科技有限公司)；移液槍(中國北京Dragon公司)；顯微鏡(日本尼康Eclipse Ci-L)。

1.2 方法

1.2.1糖尿病兔造模

糖尿病兔模型制備方法：家兔禁食12 h，經(jīng)耳緣靜脈注射5%四氧嘧啶2 mL。每天上午抽取禁食12 h的家兔耳緣靜脈血進(jìn)行血糖檢測，直到血糖持續(xù)7 d高于11.1 mmol/L，表明糖尿病兔模型建立成功。糖尿病兔自由飲水，單籠普食飼養(yǎng),飼養(yǎng)2周后制備MIRI模型。

1.2.2兔MIRI造模

由于兔心肌冠狀動(dòng)脈左前降支較大鼠粗，制作MIRI模型成功率高，故該實(shí)驗(yàn)選用兔心肌制作MIRI模型。方法參考文獻(xiàn)[6]，采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)構(gòu)建兔MIRI模型。通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)將兔麻醉。仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上,氣管插管輔助通氣。在胸部左側(cè)的第3～4肋間切開皮膚，然后鈍性分離，剝離肌肉，露出心臟。在左心耳下方1～2 mm處,以5-0無損傷縫合線在左冠狀動(dòng)脈前降支下穿線,進(jìn)針深度約1.5 mm，將縫線線節(jié)穿過內(nèi)徑0.2 cm、長1 cm的硅膠管,避免結(jié)扎線切割血管，造成血管損傷，穩(wěn)定10 min后束緊結(jié)扎線,行左冠狀動(dòng)脈缺血30 min,然后松開結(jié)扎線取出硅膠管；進(jìn)行再灌注180 min。缺血成功的標(biāo)準(zhǔn):結(jié)扎線以下心肌組織發(fā)紺。再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn):心肌局部反應(yīng)性充血。

1.2.3動(dòng)物分組

24只家兔隨機(jī)分為對(duì)照組、D-MIRI組、低劑量橙皮素+D-MIRI組(L-HSP+D-MIRI)、高劑量橙皮素+D-MIRI組(H-HSP+D-MIRI)，每組6只。除對(duì)照組，其余各組按上述方法制備兔D-MIRI模型。參照文獻(xiàn)[7]方法，L-HSP+D-MIRI組再灌注結(jié)束后開始應(yīng)用橙皮素25 mg·kg-1·d-1灌胃干預(yù)1周。H-HSP+D-MIRI組再灌注結(jié)束后開始應(yīng)用橙皮素50 mg·kg-1·d-1灌胃干預(yù)1周，其余2組應(yīng)用等量生理鹽水灌胃干預(yù)。

1.2.4標(biāo)本采集

1周后，將家兔處死，完整取出心臟，分離出左心室。將兔左心室分為3部分，一部分心肌組織用于SOD和MDA的檢測；一部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定行蘇木素-伊紅(HE)染色；最后一部分心肌組織于液氮速凍后，置于-80 ℃中保存，行心肌TUNEL檢測。

1.2.5氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

取部分缺血心肌組織，冰水浴條件下，機(jī)械勻漿，制備成10%的勻漿液，2 500～3 000 r/min，離心10 min，取上清液進(jìn)行測定。根據(jù)SOD和MDA試劑盒說明書分別測量SOD和MDA水平。其中SOD水平用黃嘌呤氧化酶法，MDA水平用硫代巴比妥酸法。

1.2.6HE染色觀察心肌組織病理變化

取出固定在多聚甲醛中的心肌組織，梯度乙醇脫水透明，石蠟包埋，然后將組織切成5 μm厚的切片，HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的病理學(xué)變化。

1.2.7TUNEL法檢測家兔心肌組織細(xì)胞凋亡

取出保存在-80 ℃冰箱中的兔心肌組織行TUNEL檢測，使用TUNEL試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司，G1507)對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測。具體步驟如下：兔心肌組織制備冰凍切片，切片厚度為8～12 μm。滴加適量TUNEL反應(yīng)液，37 ℃溫箱孵育30 min。將切片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片甩干后滴加新鮮配制的DAB顯色液，陽性為細(xì)胞核呈棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染約3 min。最后脫水、中性樹膠封片。每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)8個(gè)高倍鏡(×200)視野內(nèi)的所有陽性細(xì)胞數(shù)和所有細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。每張切片由2名觀察者分別讀片，計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組兔心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

D-MIRI組、L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組心肌組織SOD水平低于對(duì)照組(P<0.05)，L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組高于D-MIRI組(P<0.05)，H-HSP+D-MIRI組高于L-HSP+D-MIRI組(P<0.05)。D-MIRI組、L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組心肌組織MDA水平高于對(duì)照組(P<0.05)，L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組低于D-MIRI組(P<0.05)，H-HSP+D-MIRI組低于L-HSP+D-MIRI組(P<0.05)。見表1。

表1 4組家兔心肌組織SOD、MDA及細(xì)胞凋亡率變化

2.2 各組家兔心肌組織的病理變化

對(duì)照組心肌未見明顯變性，排列規(guī)則，肌絲相對(duì)完整，細(xì)胞間隙均勻。D-MIRI組心肌組織水腫明顯，排列不規(guī)則，肌絲不完整，細(xì)胞間隙增大，不均勻。L-HSP+D-MIRI組心肌組織水腫，排列尚規(guī)則，肌絲尚完整，細(xì)胞間隙增大，不均勻，較D-MIRI組癥狀輕。H-HSP+D-MIRI組心肌組織稍水腫，排列規(guī)則，肌絲尚完整，細(xì)胞間隙增大，尚均勻，較L-HSP+D-MIRI組癥狀輕。見圖1。

2.3 各組家兔心肌組織細(xì)胞凋亡變化

采用TUNEL法檢測各組心肌組織細(xì)胞凋亡變化，光鏡下可見TUNEL染色陽性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色。D-MIRI組、L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組心肌細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P<0.05)。L-HSP+D-MIRI組、H-HSP+D-MIRI組心肌細(xì)胞凋亡率低于D-MIRI組(P<0.05)。H-HSP+D-MIRI組心肌細(xì)胞凋亡率低于L-HSP+D-MIRI組(P<0.05)。見表1、圖2。

A：對(duì)照組；B：D-MIRI組；C：L-HSP+D-MIRI組；D： H-HSP+D-MIRI組；黑色箭頭表示心肌細(xì)胞腫脹、細(xì)胞間隙增大等組織病理學(xué)改變。

A：對(duì)照組；B：D-MIRI組；C：L-HSP+D-MIRI組；D： H-HSP+D-MIRI組；黑色箭頭表示凋亡細(xì)胞。

3 討 論

糖尿病引起的心血管疾病是人類高死亡率的重要原因之一，D-MIRI的發(fā)病率逐年上升。糖尿病可引起內(nèi)皮功能障礙、胰島素抵抗、心肌代謝異常等多種功能障礙。與非糖尿病患者比較，糖尿病患者患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加了2～4倍[8]。此外，在急性MIRI的臨床情況下，糖尿病患者的臨床預(yù)后更差，包括急性心肌梗死、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)，提示糖尿病患者可能更容易發(fā)生急性MIRI[9]。MIRI的病理生理機(jī)制可能與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、酸中毒、線粒體功能失調(diào)、心肌纖維能量代謝障礙等相關(guān),其中氧化應(yīng)激反應(yīng)在MIRI中至關(guān)重要[10]。

IRI通常與微血管損傷有關(guān)，特別是毛細(xì)血管和小動(dòng)脈的通透性增加，從而導(dǎo)致組織間質(zhì)擴(kuò)散和液體過濾增加。缺血后，血液重新進(jìn)入組織，導(dǎo)致大量氧自由基的釋放。這些氧自由基引發(fā)酶促反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的氧化損傷，以及有毒代謝物的產(chǎn)生和涉及DNA、蛋白質(zhì)和脂類的細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)，表現(xiàn)為活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生和抗氧化酶的消耗[11]。過量的ROS可破壞細(xì)胞和線粒體的雙層膜，引起膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，這被認(rèn)為是導(dǎo)致線粒體和細(xì)胞功能障礙，特別是細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制[12]。

糖尿病心肌ROS生成的增加是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要因素[13]。高血糖可導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加，最終導(dǎo)致血管功能障礙。高血糖引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致肌肉和脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖不足。此外，高血糖引起的氧化應(yīng)激可促進(jìn)β細(xì)胞功能障礙，減少β細(xì)胞分泌胰島素[14]，這樣也會(huì)導(dǎo)致高血糖進(jìn)一步加重。在高血糖狀態(tài)下，ROS聚積，破壞DNA和蛋白質(zhì)，損傷心肌細(xì)胞。同時(shí)，高血糖引起的ROS積累可引發(fā)胰島素抵抗。當(dāng)肌肉、脂肪和肝臟中的細(xì)胞對(duì)胰島素沒有適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，并且不能從血液中攝取葡萄糖以獲得能量時(shí)，就會(huì)發(fā)生胰島素抵抗。因此，胰腺會(huì)產(chǎn)生更多的胰島素,這些特征共同構(gòu)成了心血管疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)。高血糖引起的氧化應(yīng)激在心血管功能障礙中發(fā)揮著重要作用，兩者相互作用、相互影響[15]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可進(jìn)一步誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，抑制抗氧化系統(tǒng)，加重?fù)p傷。SOD可清除ROS，增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)，保護(hù)心肌細(xì)胞。機(jī)體內(nèi)SOD及MDA水平可間接反映機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力和細(xì)胞受氧化損傷的嚴(yán)重程度。

心肌細(xì)胞凋亡是心肌在病理因素的作用下發(fā)生的主動(dòng)而有序的程序性死亡。IRI的發(fā)病機(jī)制是多因素性的,細(xì)胞凋亡是IRI的主要致病機(jī)制之一。心肌細(xì)胞是不可再生的細(xì)胞,心肌細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致心肌收縮功能障礙。因此,抑制心肌細(xì)胞凋亡是減輕心肌梗死患者心肌損傷的有效途徑之一。缺血會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡,再灌注則會(huì)進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞凋亡,抑制心肌細(xì)胞凋亡有助于減輕IRI對(duì)心臟的損傷。糖尿病加重MIRI的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。糖尿病可導(dǎo)致ROS的過度產(chǎn)生，當(dāng)MIRI發(fā)生時(shí)，離子通道開放(如K+外排)增加ROS的產(chǎn)生，在D-MIRI過程中，過度氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、壞死和炎性反應(yīng)，是MIRI的發(fā)生機(jī)制[16]。糖尿病模型中，激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(AMPK)可能對(duì)IRI引起的心臟損傷具有保護(hù)作用。研究表明，糖尿病通過下調(diào)BAG3/Bcl-2/Nrf-2/HO-1的表達(dá)，增加p22/p67/Caspase 3/PARP表達(dá)介導(dǎo)氧化損傷，加重了IRI誘導(dǎo)的心肌功能障礙[17]。

橙皮素主要來源于蕓香科柑橘屬幼果，屬于二氫黃酮中的一種,呈淡黃色針狀結(jié)晶或粉末。難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。橙皮素是柑橘果皮中主要藥理活性成分，其主要治療作用是抗氧化和自由基清除[18]。LI等[19]研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素可上調(diào)SOD表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用。橙皮素的抗氧化作用與清除自由基和增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)有關(guān)[20]。研究表明橙皮素可減少脂多糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞線粒體依賴性細(xì)胞凋亡[21]。本研究中，橙皮素明顯提高了D-MIRI兔心肌組織中的SOD水平，降低MDA水平和心肌細(xì)胞凋亡率，表明橙皮素可抑制D-MIRI兔的氧化應(yīng)激反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡，與之前的研究結(jié)果一致。

綜上所述，橙皮素可能是一種治療D-MIRI的潛在藥物，通過抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，從而對(duì)MIRI發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了橙皮素治療糖尿病患者心肌MIRI的理論基礎(chǔ)，為研究橙皮素抗心肌氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。橙皮素處理后可以同時(shí)抑制心肌氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生保護(hù)作用，但是哪一個(gè)機(jī)制在D-MIRI中發(fā)揮主要作用仍不清楚，需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證明。