王保軍

（鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鶴壁 485030）

0 引言

中藥川芎，又名芎?、山鞠窮、香果等，為傘形科藁本植物干燥的根，首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血行氣、驅(qū)風(fēng)止痛等功效［1］?！败骸北咀鳌榜贰被蛞馊隧旕妨叽笾螅制渌幮陨闲?，善治頭痛等疾病故名芎?，以四川之地產(chǎn)者最佳，又名川芎［2］。川芎［3］極可能為藁本在長(zhǎng)期的栽培下形成的園藝類型，似與藁本相近，臨床應(yīng)用參考其本草源流，能更好的發(fā)揮川芎藥學(xué)價(jià)值。近年來(lái)研究［4］發(fā)現(xiàn)川芎中含有酚類、有機(jī)酸、苯酞類、多糖、生物堿等多種活性成分，能發(fā)揮保肝、抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等藥理作用。例如，2020 年Hu 等［5］發(fā)現(xiàn)川芎中的生物堿川芎嗪能抑制AKT-mTOR 通路、促進(jìn)自噬以治療肝纖維化、改善肝臟炎癥反應(yīng)。

方劑配伍是中醫(yī)藥臨床應(yīng)用的精髓和靈魂，中藥四氣五味不盡相同、六陳七情各呈千秋，《神農(nóng)本草經(jīng)》中有“相須、相使者良，相惡、相反者勿用”等論述，合理的配伍能夠發(fā)揮中醫(yī)藥系統(tǒng)整體治療疾病的作用，達(dá)到減毒增效的目的。川芎作為常見的中藥，有關(guān)其配伍規(guī)律的研究仍局限在專家經(jīng)驗(yàn)層面［6］，而科學(xué)系統(tǒng)的研究還比較匱乏。且中醫(yī)理論與西方醫(yī)學(xué)不盡相同，本研究基于大學(xué)生互聯(lián)網(wǎng)+創(chuàng)新項(xiàng)目數(shù)學(xué)模型之Apriori算法模型，利用R 語(yǔ)言Apriori算法計(jì)算川芎在《中國(guó)藥典》第一部中成藥方劑中的頻繁項(xiàng)集、關(guān)聯(lián)規(guī)則以發(fā)現(xiàn)川芎的方劑配伍規(guī)律。這種方法既簡(jiǎn)化了方劑成分?jǐn)?shù)量，又不失中醫(yī)配伍之妙。最后基于藥物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)新組方功效機(jī)制，為研發(fā)新一代川芎成方制劑提供參考線索。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源與處理

本研究匯總整理了2015 年《中國(guó)藥典》［7］第一部中所有成方信息，構(gòu)建了包含所有方劑的Excel 數(shù)據(jù)集，按照檢索規(guī)則提取其中包含川芎的所有成方制劑。檢索規(guī)則：（1）包含川芎的所有內(nèi)服制劑，排除外用、消毒等組方；（2）排除藥味數(shù)＞15的大方與不能體現(xiàn)川芎在方劑中實(shí)際作用的組方；（3）方劑包含藥物相同，但制劑類型不同的僅保留一種組方。例如，藥味完全一樣的同名膠囊、片劑、口服液僅保留一種制劑類型；（4）藥物來(lái)源相同的生熟異制品，按不同藥味計(jì)算。例如，生地黃和熟地黃按2味中藥計(jì)算。

1.2 頻繁項(xiàng)集與關(guān)聯(lián)算法

本研究基于R 語(yǔ)言“arules”包Apriori 算法對(duì)提取的川芎成方制劑進(jìn)行頻繁項(xiàng)集、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，并利用R語(yǔ)言“arulesViz”包隊(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。主要計(jì)算川芎配伍藥物的頻次、頻率，支持度、置信度、提升等參數(shù)。設(shè)置最小頻率＞10%，支持度＞10%，置信度＞50%.若以|T|表示包含中藥總數(shù)、|T(X)|表示包含X中藥的事物數(shù)，則支持度：SX→Y=|T(X∩Y)|/|T|；置信度：CX→Y=|T(X∩Y)|/|T(X)|；提升：LX→Y=CX→Y/SY。綜合考慮三個(gè)參數(shù)，研究川芎在中成藥方劑中的配伍規(guī)律。

1.3 新組方的藥效預(yù)測(cè)

基于《中國(guó)藥典》［7］選取新組方的活性成分，利用STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)（http∶//stitch.embl.de/）預(yù)測(cè)活性成分潛在的靶點(diǎn)，STITCH v 5.0 參數(shù)設(shè)置如下：Active interaction sources 模塊選取Textmining、Experiments、Databases、Predictions 四個(gè)選項(xiàng)。作用分?jǐn)?shù)設(shè)置為：Score≥0.7（no more than 50）。然后利用SRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https∶//string-db.org/）構(gòu)建靶點(diǎn)群PPI 網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中的度值、介數(shù)、最近距離中心性三個(gè)參數(shù)，利用K-means 聚類法將靶點(diǎn)群劃分為高中心性靶點(diǎn)、偏高中心性靶點(diǎn)、中等中心性靶點(diǎn)、偏低中心性靶點(diǎn)、低中心性靶點(diǎn)，最后利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析新組方可能作用的KEGG 信號(hào)通路，并結(jié)合中藥臨床應(yīng)用情況分析其可能的藥效機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 川芎的配伍規(guī)律與新組方發(fā)現(xiàn)

本研究發(fā)現(xiàn)94 個(gè)配方，川芎配伍頻率高于10 的中藥有19 味。結(jié)果如表1 和表2 所示，當(dāng)歸、甘草、黃芪、丹參、白芍等中藥與川芎配伍效果較好。在3味藥的組方中“川芎-當(dāng)歸-熟地黃”頻次最高為18；在4 味藥的組方中“川芎-當(dāng)歸-白芍-熟地黃”頻次最高為14。Apriori 關(guān)聯(lián)規(guī)律顯示共72 項(xiàng)，如圖1、圖2 和表3所示，其中“川芎，熟地黃→當(dāng)歸”是3味中藥中關(guān)聯(lián)度最高的組方，“川芎，白芍，當(dāng)歸→熟地黃”是4 味中藥中關(guān)聯(lián)度最高的組方。綜上，本研究認(rèn)為“川芎-白芍-當(dāng)歸-熟地黃”是川芎的最佳配伍組方。

圖1 關(guān)聯(lián)規(guī)則氣泡圖

圖2 關(guān)聯(lián)規(guī)則散點(diǎn)圖

表1 川芎配伍2味中藥組合頻次與頻率

表2 川芎配伍3～4味中藥組合頻次與頻率

2.2 川芎核心組方的藥效機(jī)制預(yù)測(cè)

查閱《中國(guó)藥典》質(zhì)量評(píng)價(jià)成分，發(fā)現(xiàn)“川芎-當(dāng)歸-白芍-熟地黃”組方的質(zhì)量評(píng)價(jià)成分為川芎嗪、阿魏酸、毛蕊花糖苷和芍藥苷，詳見表4 和圖3。如圖4所示，利用STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(CTN,Compound -Target Network) 發(fā)現(xiàn)4 種活性成分的潛在靶點(diǎn)共56 個(gè)。如圖5 所示，利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)表明共有45 個(gè)靶點(diǎn)能夠發(fā)生相互作用，網(wǎng)絡(luò)平均度值11.82，平均介數(shù)5.05×10-1，平均最近距離2.49×10-2。根據(jù)度值、介數(shù)中心性、最近距離中心性三個(gè)變量，利用SPSS軟件K-means聚類法進(jìn)行10次迭代聚類后，將靶點(diǎn)分為高中心性、偏高中心性、中等中心性、偏低中心性、低中心性五組，高中性靶點(diǎn)是TNF,CXCL8,TLR4,CCL2,DECR1,EGFR,MAPK1,MAPK3 可能是藥物的主要作用靶點(diǎn)。結(jié)果表5，圖5所示，各組聚類差異顯著（P＜0.01）。

表4 核心組分的質(zhì)量評(píng)價(jià)成分

圖3 質(zhì)量評(píng)價(jià)成分結(jié)構(gòu)式

圖5 靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表5 最終聚類中心

本研究將高中心性的8個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集，P-value＜0.01 中排名前30 的通路如圖6 所示，靶點(diǎn)主要分布在流感、肝炎、癌癥、細(xì)菌感染等疾病通路，以及NOD 樣受體、Toll 樣受體、HIF-1、TNF、MAPK、mTOR 信號(hào)通路。說(shuō)明該組方具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥效作用。

圖6 KEGG通路富集

3 討論

本研究基于R 語(yǔ)言Apriori 算法，對(duì)《中國(guó)藥典》［7］第一部中所有包含川芎的成方信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)律分析。發(fā)現(xiàn)“川芎-當(dāng)歸-白芍-熟地黃”這一組方配伍藥物頻次高、關(guān)聯(lián)度大，可能是川芎配伍的核心成分。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為“川芎-當(dāng)歸-白芍-熟地黃”是四物湯(Siwu decoction)的主要配方，Su等［8］通過(guò)UPLC-QTOF/MS/MS 和HPLC-DAD 技術(shù)發(fā)現(xiàn)四物湯中富含沒(méi)食子酸、芍藥苷、阿魏酸等成分，具有抗乳腺癌［9］、抗骨關(guān)節(jié)炎［10］等藥理作用。本研究結(jié)果證明了傳統(tǒng)中醫(yī)復(fù)方——四物湯的配伍合理性和科學(xué)性，具有抗癌、抗炎作用，也說(shuō)明“川芎-當(dāng)歸-白芍-熟地黃”是最佳的川芎配伍方式。

該組方的主要代表性成分為川芎嗪、阿魏酸、毛蕊花糖苷、芍藥苷，基于多種藥學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)該藥物組合能作用于TNF、CXCL8、TLR4、CCL2、DECR1、EGFR、MAPK1、MAPK3 等核心靶點(diǎn)群，能夠調(diào)控NOD樣受體、Tol 樣受體,TNF 信號(hào)通路發(fā)揮潛在的系統(tǒng)藥理作用。Wang 等［11］發(fā)現(xiàn)川芎嗪能夠通過(guò)降低TNF-α和TLR4 的表達(dá)，發(fā)揮抗炎癥和抗肺損傷的作用。Kong 等［12］通過(guò)RT-PCR 和western blot 發(fā)現(xiàn)川芎嗪能夠下調(diào)CXCL8 和TNF-α 的表達(dá)，具有抗肺纖維化的作用。研究［13-14］發(fā)現(xiàn)阿魏酸是當(dāng)歸的主要藥效成分，能夠降低IL-6、IL-8 和CCL-2 的含量，抑制呼吸道過(guò)敏性炎癥反應(yīng)。毛蕊花糖苷是地黃的主要成分，Gan等［15］發(fā)現(xiàn)其能夠下調(diào)IL-1、IL-6、TNF-α 和TGF-β1，具有抗炎、抗免疫作用。日本學(xué)者［16］利用RT-PCR 和Elisa 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)芍藥苷能顯著降低MIF、IL-6、IL-8、TNF-α 的mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)。以上報(bào)道說(shuō)明川芎嗪、阿魏酸、毛蕊花糖苷、芍藥苷均有調(diào)控細(xì)胞因子和抗炎的作用。

我們證明了LFAP 是川芎在中成藥中的關(guān)鍵組方，具有多靶點(diǎn)、多途徑的藥理性質(zhì)。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘、藥學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析研究，發(fā)現(xiàn)LFAP 有抗炎癥，抗腫瘤的作用?？傊?，我們總結(jié)了一種中藥開發(fā)方法，并分析了川芎的配伍規(guī)律和藥理機(jī)制，為進(jìn)一步研究川芎提供了理論基礎(chǔ)和方向，也為大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目提供數(shù)據(jù)支持，塑造提升學(xué)生的創(chuàng)新實(shí)踐能力，引領(lǐng)當(dāng)代大學(xué)生成長(zhǎng)成才。